專利名稱：同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因診斷試劑盒，具體涉及一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合于常規(guī)血液安全核酸篩査的同步提取和同步實(shí)時(shí)檢測(cè)肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、艾滋病毒以及梅毒螺旋體核酸的試劑盒。
背景技術(shù)：
艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎以及梅毒都是通過(guò)血液傳播的重大傳染性疾病，輸血一直是上述疾病的主要傳播途徑之一。我國(guó)第一例臨床報(bào)道的艾滋病病人就是通過(guò)輸入不健康血液制品感染艾滋病毒的。世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)顯示，全球每年有近百萬(wàn)人因輸入不健康血液或血液制品感染艾滋病、病毒型肝炎等傳染?。幻磕晷略龅陌滩〔《緮y帶者中，有5%至10%是經(jīng)輸血或血液制品感染。由于目前尚沒有針對(duì)艾滋病和慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有效根治手段，梅毒雖然在感染早期能夠通過(guò)抗生素治療，但若診斷不及時(shí)也會(huì)造成神經(jīng)梅毒等器質(zhì)性病變，因而預(yù)防這幾種重大傳染性疾病的傳播顯得非常重要。
衛(wèi)生部和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局要求單采漿站和生物制品企業(yè)必須依據(jù)《血液制品管理?xiàng)l例》、《單采血漿站基本標(biāo)準(zhǔn)》、《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《中國(guó)生物制品規(guī)程》采集原料血漿和生產(chǎn)血液制品。原料血漿必須經(jīng)兩種不同的ELISA試劑初檢、復(fù)檢抗-HIV、抗-HCV、 HBsAg、梅毒和ALT合格后，方可用于生產(chǎn)。也就是說(shuō)，為保障血液安全，必須進(jìn)行艾滋、丙肝、乙肝病毒以及梅毒螺旋體四種病原的檢測(cè)。因?yàn)榘滩　⒈透窝?、乙型肝炎以及梅毒都是通過(guò)血液傳播的重大傳染性疾病，輸血一直是上述疾病的主要傳染途徑之一。我國(guó)是臨床用血大國(guó)，據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行政部門初步統(tǒng)計(jì)，2007年全國(guó)各主要血站采集的血液樣本超過(guò)800多萬(wàn)份，為2百多萬(wàn)病人提供了輸血治療。另外我國(guó)每年血液制品(如人血白蛋白，靜注丙種球蛋白等)生產(chǎn)所需的人血漿在3000噸，約需采集500多萬(wàn)
4人份的人血漿，血源的質(zhì)量安全至關(guān)重要。但到目前為止，國(guó)內(nèi)仍主要通過(guò)酶聯(lián)免疫法產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行血液的篩査。免疫學(xué)診斷法盡管隨著第三代單克隆診斷抗體的出現(xiàn)，提高了檢測(cè)的靈敏度，并在一定程度上減少了血源傳播病毒性疾病的機(jī)率；但由于受免疫學(xué)診斷方法的限制，依然不能完全杜絕陽(yáng)性病毒血樣(血漿)的漏檢，其主要原因在于免疫學(xué)診斷主要依賴抗原/抗體的免疫反應(yīng)，而病毒感染機(jī)體后，機(jī)體產(chǎn)生可供檢出的抗體滴度需要一段相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間；另外，由于個(gè)體免疫應(yīng)
答的不同,其中有少數(shù)感染者感染病毒后機(jī)體所產(chǎn)生的抗體滴度很低,很難用免疫學(xué)方法檢測(cè)出來(lái),甚至有些人無(wú)免疫應(yīng)答反應(yīng)，不產(chǎn)生抗體。因此，免疫學(xué)診斷方法不能檢測(cè)出處于"窗口期"和新近感染病毒的獻(xiàn)血員，勢(shì)必造成漏檢。因而無(wú)法確保用血的安全，每年各地都會(huì)發(fā)生相當(dāng)數(shù)量因輸血和使用血液制品而導(dǎo)致感染的病例，血液安全的快速確認(rèn)檢測(cè)是避免這幾種重大傳染性疾病的經(jīng)血液傳播的行之有效的手段，但由于目前使用血液安全檢測(cè)技術(shù)有一定缺陷，存在較大的漏檢隱患，必須研究新的先進(jìn)的血液安全替代檢測(cè)方法。
國(guó)外研究證實(shí)，采用核酸檢測(cè)方法(NAT)后，HBV、 HCV、 HIV病毒的窗口期較抗體檢測(cè)分別提前9天、25天和14天。目前歐美血液制品生產(chǎn)企業(yè)已普遍采用NAT篩査血漿，冊(cè)0生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)也有專門會(huì)議討論并認(rèn)定NAT在血液和血液制品病毒安全性檢測(cè)方面的使用，迄今為止正式通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證可用于血液篩檢的試劑僅有2種，即Roche C0BAS AmpliScreen HBV/HCV/ HIV和Chiron Procleix TMAHIV21/HCV檢測(cè)系統(tǒng)，F(xiàn)DA評(píng)判這些試劑是否能用于血液篩檢的標(biāo)準(zhǔn)之一為必須對(duì)50 cp/ ml的病毒核酸的檢出率〉95 %。
然而，盡管NAT方法在保障血液安全方面的優(yōu)勢(shì)顯而易見，到目前為止，國(guó)內(nèi)還沒有推廣和普及該項(xiàng)技術(shù)。并且，國(guó)外的情況并不完全適用于國(guó)內(nèi)，國(guó)外的NAT方法針對(duì)的病源主要是HIV、 HBV、 HCV三種病毒，這三種病毒是影響國(guó)外血液安全的最大禍患；國(guó)內(nèi)的情況是除了這三種病毒外，必須進(jìn)行梅毒檢測(cè)，因?yàn)殡S著改革開放和國(guó)內(nèi)性觀念的變化，梅毒的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，也是影響血液安全的罪魁禍?zhǔn)?。目前，盡管國(guó)外已研制和開發(fā)了針對(duì)三種病毒的NAT方法和試劑，也有企業(yè)正在報(bào)批相關(guān)產(chǎn)品，但國(guó)內(nèi)外都還沒有針對(duì)這四種病原體核酸同步定量檢測(cè)的技術(shù)和產(chǎn)品。因此，開展血液安全高通量的多重(四重)PCR核酸檢測(cè)方法
(MNAT)對(duì)有效防止輸血感染、保障血液安全有著十分重要和實(shí)際的意義。本發(fā)
5明及其產(chǎn)品的推廣應(yīng)用將會(huì)極大地提供我國(guó)血液安全檢測(cè)的技術(shù)水平，從傳染源 頭上減少和控制艾滋、肝炎等重大傳染病的傳播，必將產(chǎn)生無(wú)可估量的經(jīng)濟(jì)和社 會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種同步檢測(cè) 肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒(簡(jiǎn)稱本試劑盒)。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
本試劑盒是一種多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，包括
1) 病原體濃縮液和DNA、 RNA核酸同步提取液
所述的病原體濃縮液是基于有機(jī)絮凝沉淀原理使用濃度為20%PEG6000的生 理鹽水溶液對(duì)病原體進(jìn)行濃縮；
所述的DNA、 RNA同步提取液由終濃度為4 mol/L異硫氰酸胍，0. 5%十二垸 基肌氨酸鈉，0.1腿ol/L 3巰基乙醇，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.20 g/L糖原組 成，其優(yōu)點(diǎn)是既避免了漏檢又不會(huì)干擾后續(xù)的熒光定量PCR檢測(cè)，以此作為對(duì) 《以Taq酶對(duì)DNA和RNA病原進(jìn)行同步PCR檢測(cè)的方法》專利技術(shù)(專利號(hào)ZL 01133528. 9)中血清中提取病原體核酸方法的補(bǔ)充。
2) 含有四種病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒
四種病原體包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋體。 陽(yáng)性質(zhì)粒含有這四種病原體PCR檢測(cè)擴(kuò)增片段的所有序列，其構(gòu)建方法如下
a) 利用T載體pTA-2構(gòu)建分別含有四種病原體擴(kuò)增片段的質(zhì)粒(pT-HBV， pT-HCV， pT-HIV， pT-TP);
b) 利用pTA-2(見附圖l)多克隆位點(diǎn)兩邊最接近連接的擴(kuò)增片段處都含有 EcoR I酶切位點(diǎn)，利用EcoR I酶單酶切回收得到分別含有四段酶切片段的小 片段；
c) 將含有HIV、 HCV、 HBV和TP的小片段兩兩之間進(jìn)行酶連(HIV與HCV， HBV與TP)，再分別以IR， 5， - GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3，
(SEQ. ID.NO. 2)和CR:5， - CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC -3， ( SEQ. ID. NO. 5)， BF: 5， - GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C —3， ( SEQ. ID. NO. 7)和TR: 5，-TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG_3， ( SEQ.ID.NO.il)為上下游引物，用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，擴(kuò)增產(chǎn)物帶有A尾)分別 對(duì)HIV&HCV,朋V&TP小片段的酶連產(chǎn)物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增(分別用引物IR&CR 和BF&TR)放大并分別進(jìn)行回收；
d) 將回收的片段分別與pTA-2載體進(jìn)行連接，測(cè)序并將形成的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌Top IO細(xì)胞中；
e) 利用pTA-2載體多克隆位點(diǎn)僅僅含有一個(gè)Pst I酶酶切位點(diǎn)且緊挨其中一 個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，對(duì)兩種分別含有兩種病原體擴(kuò)增片段的質(zhì)粒進(jìn)行Pst I單 酶切，并對(duì)形成的直鏈DNA片段進(jìn)行回收；
f) 將這兩段DNA片段進(jìn)行連接，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分別以BF&IR為上下游引物， 用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，擴(kuò)增產(chǎn)物帶有A尾)對(duì) 酶連產(chǎn)物進(jìn)行特異性擴(kuò)增放大并分別進(jìn)行回收；
g) 將回收的片段與T載體PTA-2進(jìn)行連接，測(cè)序，即得到含四種病原體PCR 檢測(cè)擴(kuò)增片段的所有序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pT-multy (序列見附圖2)。因?yàn)槊慷尾≡?體檢測(cè)擴(kuò)增片段兩邊都是EcoR I酶切位點(diǎn)，故在使用前很容易被NEB的EcoR I快速酶(濃度為20， 000U/ml室溫或者37"C下5分鐘)進(jìn)行單酶切切成分別 含有一種病原體擴(kuò)增序列的小片段(因帶有酶切位點(diǎn)，其長(zhǎng)度又大于擴(kuò)增片段)， 不但更貼切實(shí)際應(yīng)用時(shí)的模板形態(tài)，也避免了質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)容易形成氣溶 膠而引起的實(shí)驗(yàn)室大面積假陽(yáng)性污染現(xiàn)象。
3) —步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的TaqMan PCR擴(kuò)增體系 一步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的TaqMan PCR擴(kuò)增體系基于TaqMan探針和 Taq酶自身具有逆轉(zhuǎn)錄活性的DNA和RNA核酸同步擴(kuò)增的方法，其特點(diǎn)是使用單 管的單酶體系試劑，多項(xiàng)檢測(cè)的項(xiàng)目既含DNA，又含RNA,既有病毒也有螺旋體， 所選用的抗污染體系為經(jīng)典的UNG-dUTP系統(tǒng)，主要適用于血液篩查，。所使用 基于專利《以Taq酶對(duì)DNA和RNA病原進(jìn)行同步PCR檢測(cè)的方法》(專利號(hào)ZL 01133528.9)的技術(shù)，不需要逆轉(zhuǎn)錄酶，無(wú)專門的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。常規(guī)檢測(cè)RNA 病原體時(shí)候都是使用逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)DNA酶的雙酶體系，而逆轉(zhuǎn)錄酶不耐熱， RT溫度最優(yōu)為45-55。C，而在此溫度下，常規(guī)的基因工程制備的UNG (如目前市 售的絕大多數(shù)的UNG)具有降解逆轉(zhuǎn)錄出來(lái)的含U的DNA (稱為U-DNA)，故同步 檢測(cè)DNA和RNA病原體核酸時(shí)不能使用抗污染的UNG-dUTP經(jīng)典系統(tǒng)。我們發(fā)明 的一個(gè)突出特點(diǎn)就是無(wú)需專門的逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，故可以如同普通的DNA病原體檢測(cè)熒光定量試劑盒一樣使用抗污染的UNG-dUTP經(jīng)典系統(tǒng)。經(jīng)檢索國(guó)內(nèi) 有一家公司使用雙酶單管RT-PCR體系引入抗污染方案并且能成功用于多項(xiàng)對(duì)靈 敏度有要求的同步檢測(cè)(既有DNA又有RNA)，但使用的是不耐熱的UNG，因其 市場(chǎng)使用率不高，價(jià)格相對(duì)昂貴。而使用單酶體系(比如日本羅氏公司關(guān)于自 動(dòng)化多項(xiàng)Z05酶單酶單管RT-PCR TaqMan體系用于血篩的初步應(yīng)用報(bào)道)，不但 價(jià)格昂貴，且一般單酶體系為公司專利所有，難以推廣應(yīng)用?，F(xiàn)有的雙酶和單 酶體系不是價(jià)格昂貴就是生產(chǎn)和使用步驟繁瑣，使用本發(fā)明的方法不但可以降 低試劑盒的成本還能簡(jiǎn)化生產(chǎn)的步驟。本發(fā)明的同步多項(xiàng)檢測(cè)試劑最突出的優(yōu) 點(diǎn)在于該檢測(cè)試劑的優(yōu)秀的靈敏度和其特異性及在中國(guó)甚至亞太出現(xiàn)的各亞型 的覆蓋率(在NCBI上對(duì)迄今為止所有中國(guó)源的病原體序列進(jìn)行比對(duì)，選取檢測(cè) 的探針序列與95%以上的病原體核酸序列完全匹配)并且不同亞型擴(kuò)增效率近似 等效。
所述引物査看有關(guān)艾滋、丙肝乙肝病毒和梅毒病原體國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，確定 以gag基因作為艾滋病毒的熒光定量PCR檢測(cè)靶點(diǎn)，IF: 5' -TCA GCC CAG AAG TAA TAC CCA TG -3， (SEQ. ID. NO. 1)， IR: 5， - GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3' (SEQ. ID. NO. 2)。 5' UTR序列作為丙肝病毒的熒光定量PCR檢測(cè)靶點(diǎn)， CF: 5' - CAT GGC GTT AGT ATG AGT GTC G-3' ( SEQ. ID. NO. 4)， CR: 5， - CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC -3， ( SEQ. ID. NO. 5)。 Pre-S基因作為乙肝病毒的 熒光定量PCR檢測(cè)耙點(diǎn)，BF: 5， - GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C -3，
(SEQ. ID. NO. 7)， BR: 5， - AGG ACA AAC GGG CAA CAT ACC-3， ( SEQ. ID. NO. 8)。 以polA基因作為梅毒(TP)的熒光定量PCR檢測(cè)耙點(diǎn)，TF: 5， - TGC GTG ACG ATG TAC CAT GTG -3， ( SEQ. ID. NO. 10)， TR: 5' - TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG-3' ( SEQ. ID羞11)。
所述探針為TaqMan探針，分別由不同的熒光基因標(biāo)記或相同的熒光基因標(biāo) 記，但是至少用于校正加樣誤差內(nèi)標(biāo)的熒光基團(tuán)不能同于檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)
(若使用Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道實(shí)時(shí)定量PCR儀以及升級(jí)產(chǎn) 品或者CFX96 Real-Time PCR Detection System具有獨(dú)特的開放性加樣誤差 校正技術(shù)，不依賴于用于校正加樣誤差內(nèi)標(biāo)的熒光基團(tuán)，避免人為加樣誤差， 保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以考慮省略作為內(nèi)標(biāo)的熒光基團(tuán)，但不推崇)，而優(yōu) 選的TaqMan探針為3端為非熒光淬滅基團(tuán)的TaqMan探針，如BHQ或者Eclipse等。本發(fā)明中采用的探針序列為HIV探針為5， J0E(VIC/CY-3)-AGCATTATC AGA AGG AGC CAC CCC ACA AG-Eclipse3， ( SEQ. ID. NO. 3); HCV探針為 5， FAM-CCG GTT CCG CAG ACC ACT ATG GCT-Eclipse3， ( SEQ. ID. NO. 6); HBV 探針為5' TAMARA-AGGACAAACGGGCAACATACC-Eclipse3， ( SEQ. ID.N0.9); 梅毒(TP)探針為5， CY-5- TCG CTC GAA GAT TCC TGT TGT ATT CCG CT -Eclipse3， (SEQ. ID. NO. 12)，內(nèi)標(biāo)校正基團(tuán)選用的是ROX。上述探針標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)參考 的是ABI 7500熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)通道，由于使用不同型號(hào)的儀器所標(biāo) 記的探針發(fā)光基團(tuán)可以進(jìn)行微調(diào)。如果不需要確定所檢測(cè)的樣品中含有具體哪 一種病原體核酸，而是僅僅依據(jù)有無(wú)對(duì)樣品進(jìn)行合格不合格鑒定，可以對(duì)4種 病原體的探針標(biāo)記相同的發(fā)光基團(tuán)。
熒光定量PCR反應(yīng)液包含lOxPCR buffer (含有MgS04 20. Ommol/L) 5. 0 U 1, 25mmol/L MgCl2 3.0ul， 1Ommol/L dNTPs mix (each) l.Oyl， lOumol/L 的HIV、 HCV、 HBV、 TP上下游引物各為2. 0、 2.25、 1.75、 2. Oul， lOumol/L 的HIV、 HCV、 HBV、 TP的探針分別為0. 9、 0. 8、 0. 85、 0. 95 u 1， 5U/ u 1 Taq DNA 聚合酶0. 5 P 1，加入ROX染料后用雙蒸水補(bǔ)充體積使反應(yīng)液總體積為30 y 1。
綜上所述，本發(fā)明在于提出一種測(cè)定HBV，HCV,HIV病毒以及梅毒螺旋體核 酸的試劑盒，包括同步提取HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋體核酸的濃縮和提 取試劑，其中含有病原體濃縮液、異硫氰酸胍一步法DNA、 RNA同步提取液，和 HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋體核酸擴(kuò)增試劑，其中含有熒光定量反應(yīng)液、探 針、Taq酶、陽(yáng)性對(duì)照等。匹配儀器可使用美國(guó)ABI公司的ABI7500熒光定量 PCR儀、Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道實(shí)時(shí)定量PCR儀或CFX96 Real-Time PCR Detection System、 Roche的LightCycler 480及以上級(jí)別定量 PCR儀等，但不局限于這些。本試劑盒優(yōu)秀的品質(zhì)很大程度上取決于所選用的 HBV, HCV， HIV病毒以及梅毒螺旋體的引物和TaqMan探針序列。因此，本試劑盒 所公布的引物、探針、陽(yáng)性質(zhì)粒中含四種病原體PCR檢測(cè)擴(kuò)增片段的序列以及 起互補(bǔ)序列毫無(wú)疑問(wèn)應(yīng)當(dāng)受到所申請(qǐng)要求的權(quán)利保護(hù)之內(nèi)。
本試劑盒的工作原理
本發(fā)明提供的同步擴(kuò)增檢測(cè)肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體核酸的熒光定 量PCR試劑盒中，有標(biāo)記了熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基 團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)
9移(FRET)而被3'端非熒光淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒光信號(hào)的變化且本 底低。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸， TaqDNA聚合酶利用其5'端到3'端外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)， 這樣破壞了兩基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可 以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈 比例關(guān)系。對(duì)肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域 值(Ct， Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超 過(guò)基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起 始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的 Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。 在本發(fā)明提供的同步擴(kuò)增檢測(cè)乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋體核 酸的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體 檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、 退火溫度等的優(yōu)化，并將熒光定量PCR技術(shù)和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于 乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體同步定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反 復(fù)試驗(yàn)，建立了同步檢測(cè)乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體熒光定量 PCR方法，并研制出同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體熒光定量PCR試劑 盒，可以滿足快速同步診斷乙型、丙型肝炎、艾滋病毒以及梅毒螺旋體的要求。
本試劑盒需配合熒光定量PCR儀使用。 本試劑盒的使用方法包括下列步驟
a) 對(duì)濃度為1(T拷貝/ P 1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板進(jìn)行10倍的系列稀釋，制備陽(yáng)性標(biāo)
準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品定量；
b) 用DNA、 RNA同步提取的方法或者基于專利《以Taq酶對(duì)DNA和RNA病原
進(jìn)行同步PCR檢測(cè)的方法》(專利號(hào)ZL 01133528.9)中血清中提取病原體核酸 方法從待測(cè)標(biāo)本中提取核酸；
c) 分別取b)步中的核酸和同樣量的系列稀釋的a)步中的兩種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品加 入到含有Taq DNA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；
d) 通過(guò)比較待測(cè)樣品和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值Ct值，對(duì)待測(cè)樣品的起始拷 貝數(shù)進(jìn)行定量。本試劑盒的功能
我國(guó)艾滋病毒攜帶者超過(guò)100萬(wàn)人，乙肝病毒攜帶者1.2億人、丙肝病毒 攜帶者4000萬(wàn)人。由于目前尚沒有針對(duì)艾滋病和慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有 效根治手段，預(yù)防這幾種重大傳染性疾病的傳播顯得非常重要。梅毒在感染早 期雖然能夠治療，但由于早期癥狀較輕，不易發(fā)現(xiàn)，目前一般情況下，很少人 主動(dòng)進(jìn)行梅毒檢測(cè)，到了晚期造成器質(zhì)性損傷特別是神經(jīng)損傷后很難治愈和恢 復(fù)。由于這幾種重大傳染源都是經(jīng)血傳播，故血液安全的快速確認(rèn)檢測(cè)是避免 這幾種重大傳染性疾病的經(jīng)血液傳播的行之有效的手段。本試劑盒是血液安全 檢測(cè)領(lǐng)域的升級(jí)產(chǎn)品，可對(duì)乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋體進(jìn)行同步 定量檢測(cè)，可檢出標(biāo)本中極微量的核酸，在病毒感染后數(shù)天即能檢出，大大縮短 "窗口期"，盡管從理論上并不能完全消除感染"窗口期"，但病毒核酸轉(zhuǎn)陽(yáng)之 前的血液傳染性極低，可以有效地預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病，使輸血傳播疾病 的危險(xiǎn)性降到最低。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
工、病毒和螺旋體兩種病原體，DNA、 RNA兩種核酸同步提取，同步實(shí)時(shí)檢測(cè)，
并且提供了一種濃縮液，可以富集體液中的病毒；
2、 整個(gè)流程時(shí)間短，能效高，96個(gè)測(cè)試僅僅3個(gè)小時(shí)就快速完成并報(bào)告可
信度極高的結(jié)果；
3、 操作簡(jiǎn)單，封閉性檢測(cè)，避免了可能的污染和人為誤差；
4、 靈敏度高(每個(gè)體系最低檢測(cè)限達(dá)到l拷貝)；
5、 適用于大規(guī)模高通量的血液篩查，如血液中心和生物制品生產(chǎn)企業(yè)開展 核酸篩査，也可適用于大容量高效率的臨床核酸檢驗(yàn)。
本試劑盒用途驗(yàn)證
美國(guó)羅氏分子系統(tǒng)公司開發(fā)出商業(yè)化檢測(cè)外周血單核細(xì)胞，血漿，或其它體 液中數(shù)種病毒的檢測(cè)及量化的分析方法Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/ HIV， 與核酸提取儀聯(lián)用其靈敏度可以達(dá)到檢測(cè)被處理樣品中廣100個(gè)靶DNA或RNA分 子，而本試劑盒在基于長(zhǎng)期工作積累和擁有發(fā)明專利基礎(chǔ)上，其靈敏度達(dá)到了每 ml樣品20個(gè)耙DNA或RNA分子，重復(fù)性達(dá)到95%，且沒有運(yùn)用核酸提取儀。試 劑盒中四種檢測(cè)探針和引物都可以單獨(dú)組成針對(duì)一種病原體(HCV, HIV， HBV, TP) 的檢測(cè)試劑盒，組裝成四重?zé)晒舛吭噭┖泻蠓謩e檢測(cè)四種病原體(100人份單獨(dú)血樣)，比單一檢測(cè)試劑盒檢測(cè)時(shí)檢測(cè)20拷貝/ml時(shí)的Ct值分別延后 1.67,0.85， 0.92和1.08。


圖1是pTA2 Vector序列信息；
圖2是標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板中連接進(jìn)pTA2 Vector載體的序列。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)
的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.
薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)D.L.斯 佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或 按照制造廠商所建議的條件。
一、實(shí)施例1:試劑盒組成與配制
1、 病原體濃縮液與DNA、脂A同步提取液
為自己配制，病原體濃縮液PEG6000體積分?jǐn)?shù)為20%的生理鹽水溶液。DNA、 RNA同步提取液終濃度為4mol/L異硫氰酸胍，體積分?jǐn)?shù)為0. 5%十二垸基肌氨 酸鈉，0.1腿ol/L e巰基乙醇，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.20 g/L糖原。
2、 熒光PCR反應(yīng)液
10xPCR buffer (含有MgS04 2 0. 0ramol/L) 5. 0 P 1, 25mmol/L MgCl2 3. 0 u 1， 10腸1/L dNTPs mix (each) l.Oul， 10umol/L的HIV、 HCV、 HBV、 TP上下游 引物各為2. 0、 2.25、 1.75、 2. Oiil， 10ixmol/L的HIV、 HCV、 HBV、 TP的探 針分別為0.9、 0.8、 0.85、 0. 95ixl， 5U/P 1 Taq DNA聚合酶0. 5 y 1，加入ROX 染料后用雙蒸水補(bǔ)充體積使反應(yīng)液總體積為30 u 1。
3、 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板貯存液
濃度為101()拷貝/ u 1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-multy在使用前很用NEB的EcoR I 快速酶(室溫下5分鐘)酶切成分別含有一種病原體擴(kuò)增序列的小片段，再進(jìn)行 10倍系列稀釋；或者將pT-HBV， pT-HCV, pT-HIV以及pT-TP直接分別進(jìn)行10
12倍系列稀釋。
4、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水
二、實(shí)施例2:使用試劑盒同步檢測(cè)乙型、丙型肝炎、艾滋病毒及梅毒螺旋
體
1、 將100 w 1體液標(biāo)本放入1. 5ml離心管中，加入等體積的病原體濃縮液充 分震蕩搖勻，10 000g離心15min，沉淀直接加50 u 1DNA、 RNA同步提取液充分 混勻，37。C或室溫放置15min;再加入100ul -20。C預(yù)冷的異丙醇，4'C沉淀15min， 10 OOOg離心15min，棄去上清；往沉淀中加500ul 75%乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌 殘存異丙醇，13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；3 OOOrpm離心10sec，將管 壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2 — 3min (不可過(guò)分干燥，防 止下一步核酸不溶解)；加入40ul DEPC水(加入DEPC的純水高壓后的水即為DEPC 水)，輕輕混勻溶解核酸。3000g離心5sec，冰上保存，使用時(shí)取20ul (最好2 小時(shí)內(nèi)使用，以免核酸特別是RNA降解)
2、 將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)pT-multy用NEB公司的EcoR I快速內(nèi)切酶處理后(酶 切體系所用雙蒸水必須是DEPC處理過(guò)的)快速加熱到9(TC滅活內(nèi)切酶的活力， 再進(jìn)行10倍系列稀釋到1(f拷貝/ul， 1C)7拷貝/Pl， K)6拷貝/ul， 105拷貝/" 1， 104拷貝/111， 103拷貝/111， 102拷貝/111， 10'拷貝/iil， 10"拷貝/ul?；?者將pT-HBV， pT-HCV， pT-HIV以及pT-TP分別進(jìn)行10倍系列稀釋到108拷貝/ "1， 107拷貝/"1， 1()6拷貝/ul， 1()5拷貝/ul， 1()4拷貝/iil， 1()3拷貝/txl, 102 拷貝/ul， 1(y拷貝/pl， 10-拷貝/ul。
3、 分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各30 P 1，取第a)步提取的核酸20 P 1和第 b)步稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板1 u 1以及19 u 1雙蒸水，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不 同的PCR反應(yīng)管，對(duì)應(yīng)于樣品其濃度分別是2X109拷貝/ml ， 2X108拷貝/ml ， 2Xl(f拷貝/ml ， 2Xl()6拷貝/ml ， 2Xl()5拷貝/ml ， 2Xl()4拷貝/ml ， 2X103 拷貝/ml ， 2Xl()2拷貝/ml， 20拷貝/ml在熒光定量PCR儀上平行做PCR檢測(cè)。 循環(huán)條件為94。C預(yù)變性3min， 58。C退火3min, 65。C延伸15min (Taq DNA聚 合酶逆轉(zhuǎn)錄活性最大)；循環(huán)過(guò)程使用兩步法94。C 30s， 58°C lmin, 45個(gè)循環(huán)。 把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，同步檢測(cè) F扁,JOE， TAMARA， CY-5以及用于校正加樣誤差的熒光基團(tuán)ROX。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)，結(jié)果為HBV、 TP、 HCV、 HlV在2Xl()5拷貝/ml ，2Xl()4拷貝/ml ，2Xl()3拷貝/ml ，2Xl()2拷貝/ml 和20拷貝/ml的模板濃度時(shí)平均Ct值分別是
28. 16， 31. 29， 34. 75， 38.03， 41. 21; 27. 21， 31. 12， 34. 51， 37. 91， 41. 03;
28. 25， 30. 71， 34. 12, 37. 52， 40. 60;26. 97, 31. 16, 34. 51, 37. 74, 41. 27;陰性 對(duì)照為0;
反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)三次，得到的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P>0. 05，數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著 意義，說(shuō)明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。
從上述實(shí)例可以說(shuō)明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且， 熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需約2. 5個(gè)小時(shí)就能完成，大大縮短了 時(shí)間。
試劑盒的操作只需1人即可完成整個(gè)定量操作過(guò)程， 一次可檢測(cè)32—384個(gè) (由定量?jī)x器型號(hào)決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
序列表
〈110〉武漢大學(xué)
〈120〉同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒
〈140〉
〈141〉
〈160〉 4
〈210〉 1
〈211〉 94
<212>薩
〈213〉乙型肝炎病毒(〃印a"'"s 5 "'孺，HBV)— 〈400>
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCT 60 TCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT 94
〈210〉 2 〈211〉 98
14〈212〉腿
〈213〉丙型肝炎病毒(^印a"'fis C !^r〃s， HCV) 〈400〉
CCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGG 60 GGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATG 98 〈210〉 3
<211〉 139
<212>薩
<213〉艾滋病毒(力腿朋i歷廁/7oJe/Ycie/7C7 "'riAs， HIV) 〈400〉
TAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGA 120 CCATCAATGAGGAAGCTGC 139
〈210〉 4 <211〉 136 <212〉 DNA
〈213〉梅毒螺旋體(trepo/7e/i7a ; aJ7jVi/叫TP) 〈400〉
GTGCTTGTGTGCAAGA
權(quán)利要求
1、一種同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，其特征在于1)病原體濃縮液和DNA、RNA核酸同步提取液；2)含有四種病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，四種病原體包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋體；3)一步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的TaqMan PCR擴(kuò)增體系，由含有20.0mmol/L MgSO4的10×buffer，10μmol/L的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋體上下游引物，10μmol/L的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋體的熒光探針，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs mix和無(wú)菌雙蒸水組成，其中引物和標(biāo)記探針如下①乙型肝炎病毒正向引物為5′-GCGGCGTTTTATCATCTTCCTC-3′，反向引物為5′-AGGACAAACGGGCAACATACC-3′；熒光探針序列為5′-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)TAMRA，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Eclipse標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HBV是含有乙型肝炎病毒的Pre-S基因的98個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；②丙型肝炎病毒正向引物為5′-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATG-3′，反向引物為5′-CCTGGCAATTCCGGTGTACTC-3′；熒光探針序列為5′-CCGGTTCCGCAGACCACTATGGCT-3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Eclipse標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HCV是含有丙型肝炎病毒的5’UTR序列的98個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；③艾滋病毒正向引物為5′-CATGGCGTTAGTATGAGTGTCG-3′，反向引物為5′-GCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3′；熒光探針序列為5′-AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)JOE/VIC/Cy-3，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Eclipse標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HIV是含有艾滋病毒的gag基因139個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；④梅毒螺旋體正向引物為5′-TGCGTGACGATGTACCATGTG-3′，反向引物為5′-TCTTGCACACAAGCACGATATTG-3′；熒光探針序列為5′-TCGCT CGAAG ATTCC TGTTG TATTC CGCT -3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)Cy-5，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)Eclipse標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-TP是含有梅毒螺旋體的poly A基因136個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖。
2、 按權(quán)利要求1所述的一種同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的 試劑盒，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板包括乙型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HBV包含的Pre-S基因的核苷酸序列為NO. 1; 丙型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HCV包含的5' UTR序列的核苷酸序列為NO. 2; 艾滋病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-HIV包含的gag基因的核苷酸序列為NO. 3; 梅毒螺旋體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板pT-TP包含的poly A基因的核苷酸序列為NO. 4。
3、 按權(quán)利要求1所述的一種同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的 試劑盒，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板包括同時(shí)含有四種病原體檢測(cè)序列的質(zhì)粒序列為圖2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步檢測(cè)肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，涉及一種基因診斷試劑盒。本發(fā)明包括1)病原體濃縮液和DNA、RNA核酸同步提取液；2)含有四種病原體檢測(cè)序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，四種病原體包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋體；3)一步法單管單酶多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的TaqMan PCR擴(kuò)增體系。本發(fā)明同步實(shí)時(shí)檢測(cè)；整個(gè)流程時(shí)間短，能效高；操作簡(jiǎn)單，封閉性檢測(cè)，避免了可能的污染和人為誤差；靈敏度高；適用于大規(guī)模高通量的血液篩查，如血液中心和生物制品生產(chǎn)企業(yè)開展核酸篩查，也可適用于大容量高效率的臨床核酸檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101487062SQ20081019748
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者立 周, 唐景峰, 王業(yè)富, 龔路路 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)