專利名稱：：一種作為分子標(biāo)記的與豬胴體性狀相關(guān)的MuRF2基因片段克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動物分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與豬胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自占以來，豬在我國一直是六畜之首。養(yǎng)豬業(yè)的起伏，更是牽動著人民的生活水平的提高。豬肉在全世界的消費(fèi)量占紅色肉類消費(fèi)總量的43%,并且豬是人類身體的重要模式系統(tǒng)同時也是未來器官移植的重要來源(Rothschild,2003)。因此對豬的研究不管是從國民經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)還是從人類健康角度出發(fā)，都有著重要的實(shí)際意義。我國是世界上養(yǎng)豬最早的國家之一，養(yǎng)豬的歷史達(dá)幾千年之久，經(jīng)過祖先辛勤的飼養(yǎng)和選育，形成了許許多多的各具特色的地方品種。長期以來,豬的育種以提高生長速度、減少飼料消耗、增加瘦肉率為主要目標(biāo),并已取得顯著成績。但伴隨著片面追求生產(chǎn)效益和利益的是大量優(yōu)良品種面臨著滅絕的危險，有的品種甚至已經(jīng)滅絕。在豬的瘦肉率和生長速度大幅度提高的同時，傳統(tǒng)的育種手段也遭遇到發(fā)展的瓶頸，已經(jīng)很難象過去那樣大幅度地提高豬的生產(chǎn)水平和抗病能力了。豬生產(chǎn)水平的提高實(shí)際上降低了豬的體質(zhì)和適應(yīng)性，并影響到豬的肌肉品質(zhì)。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平與消費(fèi)水平的提高，帶來了人們膳食結(jié)構(gòu)與飲食觀念的變化，消費(fèi)者對豬肉品質(zhì)的耍求也越來越高。這些出現(xiàn)的一系列的新矛盾和新問題，迫切需要用新的手段和對策解決豬的育種問題。分于生物學(xué)的飛速發(fā)展使得豬的育種工作出現(xiàn)了新的曙光。利用遺傳學(xué)或分子生物學(xué)手段對傳統(tǒng)育種工作的不足之處進(jìn)行了強(qiáng)有力的補(bǔ)充，也使得豬的育種能夠突破傳統(tǒng)育種工作面臨的瓶頸問題，大大地促進(jìn)了豬育種工作的發(fā)展。目前，標(biāo)記輔助選擇(MAS)、影響豬重要數(shù)量性狀的基因組區(qū)域定位(QTL)、用基因組掃描(genomescanning)法和候選基因法(Candidategeneapproach)研究影響豬重要經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因(Economictraitsloci，ETLs)已經(jīng)成功地應(yīng)用到國內(nèi)外的豬育種實(shí)踐當(dāng)中，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)在動物育種中的應(yīng)用，世界各國豬的育種技術(shù)已邁入分子育種階段。目前通過候選基因法與標(biāo)記輔助選擇(MAS),已經(jīng)找到了一些影響豬的生產(chǎn)性狀的基因。Casas-Carrillo等(1995)在以6頭公豬與18頭無相關(guān)的母豬雜交群體中，發(fā)現(xiàn)在一個公豬家系中位于豬5號染色體上的類胰島素樣生長肉子l(Insulinlikegrowthfactor1，/GF-/)基因型與斷奶后日增重存在連鎖(LOD=2.3);Nezer等(999)以大約克與皮特蘭雜交的677頭后代作為試驗(yàn)對象，研究了影響體脂與肌肉性狀的QTL，同樣發(fā)現(xiàn)了位于2號染色體短臂的QTL,同時篩選到2個候選基因JWKZ)/和/GF-//,.位于豬9號染色體上的肌細(xì)胞生成素(M;;ogem'")是MyoD基因家族的成員，TePas等(1999)在兩個大白豬群中檢測了該基閑的多態(tài)性，分析發(fā)現(xiàn)不同基因型的個體在出生重、生長速度和瘦肉量等性狀上有顯著差異。對兩個選擇系肌肉的A/;;oi)基因家族成員mRNA表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn)F-系(選擇生長速度)中;^ogew'"、WJ/-5、MyoZ)/的mRNA表達(dá)水平比L一系(選擇瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚與成肌細(xì)胞的表達(dá)成負(fù)相關(guān)(TePasMF等，Influencesofmyogeningenotypesonbirthweight,growthrate,carcassweight,backfatthickness,andleanweightofpigs.JAnimSci,1999,77:2352-2356);Fujii等(1991)發(fā)現(xiàn)氟烷基因(WW)是導(dǎo)致豬產(chǎn)生灰白水樣肉(Pale,soft,exudativepork，PSE肉)的主效基因，該基因的編碼產(chǎn)物為鈣釋放通道蛋白(calciumreleasechannel,C及C)或蘭尼定受體l(ryanodinereceptor1,CTK/義如果豬只攜帶兩個隱性突變基因(朋)就發(fā)生豬應(yīng)激綜合征(Porcinestresssyndrome,PSS)，嚴(yán)重影響到豬的存活率和豬肉品質(zhì)，導(dǎo)致豬的應(yīng)激死亡和產(chǎn)生劣質(zhì)肉(PSE肉)，但隱性基因卻對胴體性狀具有正效應(yīng)(Hamilton,etal.,2000)。進(jìn)一步的研究也證明，iKR7位點(diǎn)的突變雖然對肉質(zhì)性狀具有負(fù)效應(yīng)，但對幾乎所有的胴體組成性狀均具有正效應(yīng)，有商業(yè)價值的iK^位點(diǎn)基因型的簡化DNA檢測法已成為專利并得到廣泛應(yīng)用(彭中鎮(zhèn)等，1999);，(RendementNapole)基因又稱酸肉基因，LeRoy等(1990)首先在漢普夏豬及其雜種中發(fā)現(xiàn)不利等位基因Ayr可使肌肉中肌糖原含量升高，終端pH值降低，造成酸肉和烹調(diào)損失，豬肉工藝學(xué)品質(zhì)下降，影響火腿的產(chǎn)量。Milan等(2000)通過對候選區(qū)域進(jìn)行大規(guī)模的測序分析，發(fā)現(xiàn)單磷酸腺苷活化酶Y3亞基基因(AMP-activatedproteinkinase(AMPK)，Y—subunit3,/ffiK4tfJ)編碼第200位氨基酸的密碼子的錯義突變與漢普夏豬的酸肉表型直接相關(guān)，RN—豬的該位點(diǎn)均為不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(2001)在1800個商品豬群中對該基因進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新的等位基因與肌糖原含量相關(guān)并進(jìn)一步影響肉質(zhì)性狀。與Milan等發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)不同的是，這個位點(diǎn)的不同等位基因不僅僅在漢普夏豬中分離，它在典型的商品豬群中多態(tài)性也比較豐富，對育種具有更廣泛的適用價值；豬FOS原癌基因(proto-oncogene)被認(rèn)為是骨骼肌肌纖維特性的候選基因，位于豬7號染色體上影響肌纖維的QTL區(qū)域內(nèi)(Reiner,etal.,2002)。Reiner等(2002)報道了^OS染色體區(qū)域與骨骼肌纖維特性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)代表歐洲豬種的BB基因型個體比AA基因型梅山豬的白肌纖維多10.9%。W"http://^是MuRF(Muscle-specificRINGfinger,MuRFs)蛋白家族的成員之一，該家族包括有三個成員，分別是浙W尸厶#^/^及#"必％它們只特異性的在心肌和骨骼肌中表達(dá)。該家族三個蛋A在結(jié)構(gòu)上具有較高的保守性，它們都包含有一個N末端的高保守的環(huán)指結(jié)構(gòu)，以及緊隨其后的鋅結(jié)合B-box結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)(SpencerJA等.RegulationofmicrotubuledynamicsandmyogenicdifferentiationbyMURF,astriatedmuscleRING-fingerprotein.JCellBiol,2000,150:771—784;CentnerT等.Identificationofmusclespecificringfingerproteinsaspotentialregulatorsofthetitinkinasedomain.JMolBiol,2001,306:717—726.)。由于這種結(jié)構(gòu)上的共性，MuRF家族蛋白又被認(rèn)為是RBCC(RING-B-box-coiled-coiled)蛋白家族的成員。目前研究表明，RBCC蛋白家族的成員在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化生長以及組織形成過程中發(fā)揮重要作用(FreemontPS.RINGfordestruction.CurrBiol,2000，10:R84-R87)。iW尸i通過與肌纖維，微管以及細(xì)胞核因子的結(jié)合來發(fā)揮其作為細(xì)胞骨架接頭及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用(PizonV等.TransientassociationoftitinandmyosinwithmicrotubulesinnascentmyofibrilsdirectedbytheMURF2RING-fingerprotein.JCellSci，2002,115:44694482)，在原代培養(yǎng)的雞胚胎骨骼肌細(xì)胞中利用反義RNA技術(shù)抑制i/i^F溯表達(dá)，可明顯觀察到成肌細(xì)胞融合和肌原纖維生長延遲，使得肌纖維的伸縮性受到影響(McElhinnyAS等,Muscle-specificRINGfinger-2(MURF-2)isimportantformicrotubule,intermediatefilamentandsarcomericM-linemaintenanceinstriatedmuscledevelopment.JCellSci，2004117:3175-3188)。鑒于M"/F2基因?qū)Τ杉〖?xì)胞的作用，我們認(rèn)為它很可能在豬的肌纖維發(fā)育過程中起到重要作用，進(jìn)而影響豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀一生產(chǎn)性狀。研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它對生產(chǎn)性狀的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與豬胴體性狀相關(guān)的MW/^基因片段，尋找突變位點(diǎn)，篩選一種與豬胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，利用該分子標(biāo)記進(jìn)行豬胴體性狀的標(biāo)記輔助選擇及應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與豬胴體性狀相關(guān)的傲/AK基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。在序列表SEQIDNO:1所述的的第112bp處有1個A112-G112的堿基突變，導(dǎo)致歷/j/7-RFLP多態(tài)性。申請人設(shè)計(jì)了一種檢測基因片段突變的引物對，所述引物對的正向引物為5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3';反向引物為5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'。一種制備所述的與豬胴體性狀相關(guān)的ifeBK基因片段的方法，按照以下步驟(1)以鼠Afe/^2基因的mRNA為信息探針，做同源序列篩選，獲得豬四號染色體上部分核苷酸序列，用該核苷酸序列與鼠cDNA序列比對，預(yù)測豬Mw/F2cDNA序列，以該預(yù)測的cDNA序列作模板設(shè)計(jì)引物，以成年中國地方豬品種通城豬的肌肉組織總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，通過序列拼接獲得豬Mw/F2基因cDNA序列；(2)提取豬基因組DNA,設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得豬Af"iF2基因片段核苷酸序列，以該基因片段的核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)突變引物，獲得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施例中申請人已將制備的與豬生產(chǎn)性狀相關(guān)分子標(biāo)記應(yīng)用在豬分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。更詳細(xì)的技術(shù)方案請參見《具體實(shí)施方式》中的實(shí)施例。本發(fā)明的效果是發(fā)現(xiàn)了一個與豬胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個新的分子標(biāo)記。序列表SEQIDNO:l是本發(fā)明克隆的與豬胴體性狀相關(guān)的傲W/^基因片段的核苷酸序列；圖l:是本發(fā)明技術(shù)流程圖2:是本發(fā)明中豬MW/^基因cDNA序列(它包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR)，圖中起始密碼子和終止密碼子用標(biāo)有下劃線的加粗斜體顯述；圖3:是本發(fā)明中豬浙/y/^基因用于尋找SNP位點(diǎn)的部分DNA序列，圖中有加粗下劃線的為突變位點(diǎn)；圖4:是本發(fā)明中豬浙說e基因用于性狀關(guān)聯(lián)分析的核苷酸序列，圖中有加粗下劃線的為突變位點(diǎn)；圖5:是本發(fā)明中豬浙W/^基因用于性狀關(guān)聯(lián)分析DNA序列擴(kuò)增電泳結(jié)果，圖中泳道M:DNAMarkerl;圖6:是本發(fā)明中豬#"http://2>基因測序發(fā)現(xiàn)的A-G突變；圖7:是本發(fā)明中豬J/"兄K基因CDS區(qū)的歷'"/7-RFLP的三種基因型(AAAGGG)電泳結(jié)果，圖中泳道M:DNAMarkerl。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:(一)豬俯W/^基因的CDS克隆及部分DNA序列擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)用鼠M/ZP/2"基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM—001081281)為信息探針，利用NCBI的BLAST工具在GenomicBiology豬基因組數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得豬四號染色體上部分同源DNA序列，然后用此DNA序列與鼠CDS序列比對，預(yù)測出抓/Z^i完整的cDNA序列，以此預(yù)測序列作模板利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)兩對引物分段擴(kuò)增浙/zKS因cDNA，對兩序列進(jìn)行拼接獲得浙My^cDNA序列(包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR);利用BLAST獲得的i/"^^DNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增豬MuRF2部分核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)一個堿基突變位點(diǎn)(A779-G779)。擴(kuò)增#"7/^基因cDNA序列的引物對如下所示MuRF2CDSl正向引物5，AGCCCAGCCTGAAACAATG3'，反向引物5'CTTTCTGATGAGAGCACGG3';MuRF2CDS2正向引物5，TGAACTGCTMGTCCCCACG3'反向引物5，GAGGTCCCTATCATCATCGG3，擴(kuò)增i/WP/^基因部分核苷酸序列的引物對如下所示MuRF2SNP正向引物5'CCTMCCCACCTAACAGGAATG3''反向引物5'CTACCCAGTGCTAMTGCCC3'。(2)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增反應(yīng)利fflTRIzoL試劑盒(購自美國GIBC0公司)從成年"通城豬"(一種具有中國地方豬血緣的地方豬種)肌肉組織中提取總RNA，具體操作方法參照TRIzoL試劑盒說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的的合成反應(yīng)總體積為50u1,首先將總RNA2yg與oligod(T)u4n1，隨機(jī)引物1u1，DEPC水9ul混合于一離心管中'TO。C變性5min以解除RNA的二級結(jié)構(gòu)，立即置于冰上冷卻以避免二級結(jié)構(gòu)的重新生成，經(jīng)短暫離心后加入M-MLV1.5u1,5Xbuffer10u1，dNTP2.5u1，RNASE抑制劑1u1和DEPC水20nl,于42'C溫育1h后將溫度升至95'C滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于-2(TC保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)反應(yīng)總體積為10ul，其中豬cDNA模板0.5u1,雙蒸水6.9ul，bufferlul，Mg2+0.6ul，10mM正向引物和反向引物各O.3ul，dNTP0.2ul，T叫酶0.2u1(1U/ul)。PCR反應(yīng)條件為:94r預(yù)變性5min后，循環(huán)35次94'C變性30s、62t:退火30s、72。C延伸25s，最后72。C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR產(chǎn)物的純化使用小量DNA回收試劑盒(購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)。在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切卜含目的片段的凝膠，放入1.5mLEpendorff管中，按每IOOnglW凝膠加入700^L溶膠液的比例，加入溶膠液，于65'C溫育至凝膠完全融化。將膠液上柱，體積過大可分幾次上柱，9000rmp離心30s。倒掉收集管中液體，在吸附柱中加入50(HiL漂洗液，1200rmp離心30s，倒掉收集管中液體，重復(fù)此操作一次。將柱子1200rmp離心2min，除去乙醇。將吸附柱放入新的1.5mLEpendorff管中，往柱子中央加入30nL雙蒸水，室溫放置2分鐘，1200rmp離心2min，得到回收產(chǎn)物。連接反應(yīng)將純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5ul，其中包括SolutionI2.5ul，pMD18-T0.5ul，純化PCR產(chǎn)物2ul，4'C過夜。感受態(tài)細(xì)胞的制備從37。C培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5a單菌落接種于2mlLB中，于37'C振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接lml菌液于含有30mlLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37'C振蕩培養(yǎng)約4h,待ODs。。達(dá)到0.3-0.4時將鹽水瓶從搖床取山，冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4'C4000rpm離心10min，棄去培養(yǎng)液，用lOml冰預(yù)冷的O.1mo1/1的CaCL重懸沉淀，冰浴30rain，重復(fù)4'C4000rpm離心10min，用4ml冰預(yù)冷的0.lmo1/1的CaCh重懸沉淀，置4'C保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100-120ul感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml離心管中，將5ul的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30rain,42。C熱激90s,其間不要搖動離心管，取出后冰浴3-4min，加入400u1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)45min。取100u1涂布于已提前4h涂布了異丙基硫代-P半乳糖苷(IPTG)和X-gal的瓊脂平板上，37'C平方夂1h后倒置培養(yǎng)?？寺y序是挑取單個陽性克隆子用于測序，序列測定由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，每個基因片段至少測兩個克隆子。(4)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件'將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的己知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。(一)PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列由于該A/G堿基突變未能引起限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的改變，因此設(shè)計(jì)突變引物引入內(nèi)切酶&^/7酶切位點(diǎn)(GTANTC),PCR擴(kuò)增包含此突變位點(diǎn)的DNA序列(137bp),如序列表SEQIDN0:1所示，突變位點(diǎn)位于其112bp處。pol正向引物5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3'反向引物5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'該引物擴(kuò)增片段長度為137bp。(2)PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積lOu1，其中豬基因組DNA模板ln1，雙蒸水7.lul，10Xbuffer1n1,lOraM正向引物和反向引物各0.3n1，dNTPO.2ul，Taq酶O.ltil(5U/ul)。PCR反應(yīng)條件為:94'C預(yù)變性5min，94。C變性30s、54。C退火30s、72。C延伸15s,循環(huán)35次，72。C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)RFLP檢測PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10u1,其中PCR產(chǎn)物5ul，雙蒸水3.8ul，IXbufferTango限制性內(nèi)切酶氾"/I為0.2ul(10U/lU)，將樣品混勻后離心，37'C培養(yǎng)箱放置4h，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了137bp特異性擴(kuò)增片段，該片段的第112位是1個A-G堿基轉(zhuǎn)換，通過設(shè)計(jì)突變引物使得該突變位點(diǎn)能導(dǎo)致恥'fif/酶切位點(diǎn)(GTANTC)的變化，其中第112bp-113bp處為/fe/7^"/^多態(tài)性酶切位點(diǎn)。酶切產(chǎn)生三種基因型，AA基因型只有137bp—條帶，GG基因型有112bp和25bp兩條帶，雜合子AG基因型有137bp，112bp和25bp的三條帶。其中25bp片段太小在瓊脂糖凝膠電泳中難以分辨，但不影響判型，如圖7所述。實(shí)施例2:利用-RFLP(參見J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)檢測了本申請人所在動物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室通城試驗(yàn)豬群，包括5個豬品種其中通城豬為中國地方豬血緣品種，長白豬、大白豬為外來豬血緣，長大通、大長通為中國地方豬與外來豬雜交的品種。該突變位點(diǎn)在不同血緣豬種中的基因型和基因頻率如表l所示，結(jié)果顯示浙///^基因各基因型在各豬種中均有分布，在通城豬、長白豬和長大通豬中G等位基因占優(yōu)勢，在大白豬和大長通豬中A等位基因占優(yōu)勢。表1不同血緣豬品種中浙ww基因沿Vj/1多態(tài)性的基因型和基因頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>五個血緣豬品種間基因型頻率的卡方檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示。xS檢驗(yàn)表明，通城豬與K:白豬、大白豬及大長通豬之間存在極顯著差異，與長大通豬之間存在顯著差異；其他豬種間基因型頻率差異不顯著。表2不同血緣豬品種中ifo^^基因多態(tài)性基因頻率的x2檢驗(yàn)結(jié)果品種長白豬大白豬長大通豬大長通豬通城豬21.1752"27.3094"18,4172.40.4619"長白豬5.15822.069214.24265大白豬13.17831.50252長大通豬_12.3492注肩注'表述P<0.05:肩注"表述PO.01;df=8，x20.05(8)=15.50731，x20.01(8)=20.09024實(shí)施例3用Mw/^2基因檢測了通城試驗(yàn)豬群159頭豬，對MwiF2基因的該位點(diǎn)歷^-RFLP多態(tài)檢測的三種基因型與通城試驗(yàn)豬群部分生產(chǎn)性能進(jìn)行了初步相關(guān)分析。所分析的性狀有部分生長性狀，部分胴體性狀和部分肉質(zhì)性狀。對基因型資料用如下模型進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>Y,jkhn表示觀測值，n表示均值，G,表示基因型效應(yīng)，Bj表示組合效應(yīng)，Sk表示性別效應(yīng)，&表示父系效應(yīng)，Eij!dm表示殘差，假定服從N(0,Icj2)分布，分析軟件為SPSS13.0軟件?；蛐蜋z測結(jié)果表明在159個個體中AA基因型有26個，AG基因型有65個個體，GG基因型有68個。分析結(jié)果表明，該位點(diǎn)的基因型與胴體直長存在顯著相關(guān)，AA型和GG型之間無顯著差異，AG型胴體直長顯著低于純合基因型AA和GG型；_表3豬#"必^基因歷7z/7酶切基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種作為分子標(biāo)記的與豬胴體性狀相關(guān)的MuRF2基因片段克隆及應(yīng)用<130><141>2008-10-29<藤1〈170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211>137<212>DNA<213〉豬(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..(137)<223><220><221>primer—bind<222〉(113)..(137)<223>〈220><221>primer—bind<222>(l)..咖<223><220><221〉mutation<222>(112)..(112)<223><400>1cccaaggctatcacactttacacagtgac8aaaagtggcaactggtctttgttgcagaatttctgaagC3tcgaaggcatUcagatgg3gaaaatagaacatggttatgagaeitatgsatcacttcacagtcaacc權(quán)利要求1、一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與豬胴體性狀相關(guān)的MuRF2基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因片段，其特征在于在序列表SEQIDNO:l所述的的第112bp處有1個A112-G112的堿基突變，導(dǎo)致歷/7/7-RFLP多態(tài)性。3、檢測權(quán)利要求2所述的基因片段突變的引物對，所述引物對的正向引物為5'CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3';反向引物為5'GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3'。4、制備如權(quán)利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步驟(1)以鼠M"及i^基因的mRNA為信息探針，做同源序列篩選，獲得豬四號染色體上部分核苷酸序列，用該核苷酸序列與鼠cDNA序列比對，預(yù)測豬M"7F2cDNA序列，以該測的cDNA序列作模板設(shè)計(jì)引物，以成年中國地方豬品種通城豬的肌肉組織中總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，通過序列拼接獲得豬MWF2基因cDNA序列；(2)提取豬基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得豬M"及i^基因片段核苷酸序列，以該基因片段的核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)突變引物，獲得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列。5、權(quán)利要求2所述的基因片段在豬標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬分子標(biāo)記的與豬胴體性狀相關(guān)的MuRF2基因片段的克隆及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由豬MuRF2基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，在序列表SEQIDNO1的第112位堿基處有一個A112-G112的堿基突變，導(dǎo)致HinfI-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了獲得上述分子標(biāo)記的制備方法和多態(tài)性檢測的應(yīng)用，為豬的標(biāo)記輔助選擇的關(guān)聯(lián)分析提供了一個新的分子標(biāo)記。文檔編號C12N15/11GK101418298SQ20081019744公開日2009年4月29日申請日期2008年10月30日優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日發(fā)明者梅余,榜劉,徐學(xué)文,朱猛進(jìn),李新云,李長春,斌樊,鶴沈,趙書紅申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)