專利名稱：：一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬的養(yǎng)殖是養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，目前我國已是世界上最大的養(yǎng)豬生產(chǎn)國。豬的皮、骨、肉、脂可供食用或用作工業(yè)原料，豬的器官(心臟、肝臟、皮膚等)正被研究用于人體器官移植，豬的排泄物可做肥料。所以，不管是對(duì)于滿足人類的需要來說，還是增加經(jīng)濟(jì)效益來說，豬的養(yǎng)殖都是非常重要的。我國的養(yǎng)豬生產(chǎn)水平在近幾十年得到了較大的提高，但仍落后于歐美一些國家。生產(chǎn)效率不高削弱著養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，而生產(chǎn)效益則可以通過提高母豬繁殖力和肉豬出欄率得到提高。衡量母豬生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)是母豬能否生產(chǎn)出較重的初生重和斷奶重的子豬。子豬的初生重和斷奶重成為豬養(yǎng)殖業(yè)中影響經(jīng)濟(jì)效益的兩個(gè)重要指標(biāo)。平均初生重大，變異系數(shù)小，說明窩整齊度好，對(duì)提高仔豬成活率非常有好處，平均初生重大也可以剌激母豬多產(chǎn)奶。大量調(diào)查數(shù)據(jù)證明，仔豬初生重1500-1600克的豬場經(jīng)濟(jì)效益要比出生重1200-1300克的豬場好的多。在2006年國際豬獸醫(yī)學(xué)會(huì)(IPVS)會(huì)議上，明尼蘇達(dá)州大學(xué)JohnDeen運(yùn)用預(yù)測統(tǒng)計(jì)模型論述了子豬初生重對(duì)斷奶重和斷奶前死亡率的影響初生重小斷奶重就小，初生重每增加1克，平均斷奶重增加2.34克；初生重每增加100克，斷奶前死亡率可能會(huì)降低10%。斷奶重小，斷奶過渡就難，保育期死亡率增加、育肥期增重速度慢、飼料效率變差，出欄時(shí)間就會(huì)延長。斷奶重偏小是國內(nèi)豬場普遍存在的問題，大多數(shù)豬場28天斷奶重6.5-7.5千克，管理好的豬場28天斷奶重可達(dá)到8-9.3千克以上。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供的輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型的豬。II基因型為基因組DNA中具有序列l(wèi)所示DNA片段的純合體。所述DD基因型可為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的純合體；所述ID基因型可為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的雜合體。n基因型為基因組DNA中具有序列4所示DNA片段的純合體。所述方法具體包括如下步驟1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物對(duì)為序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果PCR產(chǎn)物只有一種，且含有序列表的序列1所示的DNA片段，待測豬為II基因型；如果PCR產(chǎn)物只有一種，且不含有序列表的序列1所示的DNA片段，待測豬為DD基因型；如果PCR產(chǎn)物有兩種，一半含有序列表的序列1所示的DNA片段的，另一半不含有序列表的序列1所示的DNA片段的，待測豬為ID基因型。DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。所述待測豬具體可為長白豬。本發(fā)明還保護(hù)核苷酸序列為序列表的序列1所示的DNA片段。含有序列表的序列1所示的DNA片段的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對(duì)，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段所述引物對(duì)可應(yīng)用于輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀。所述引物對(duì)還可應(yīng)用于制備輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒，所述試劑盒含有所述特異性引物對(duì)。所述方法、所述DNA片段、所述引特異性引物對(duì)、所述試劑盒均可應(yīng)用于豬的育種。本發(fā)明提供的DNA片段在豬群中具有缺失多態(tài)。基因型為DD的待測豬的初生重與基因型為ID的待測豬的初生重存在顯著性差異(P〈0.05);基因型為DD的待測豬的斷奶重與基因型為ID的待測豬的斷奶重存在極顯著性差異(P<0.01);DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。本發(fā)明的DNA片段可用于檢測豬的初生重和斷奶重等生長性狀，從而為豬的分育種提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明的DNA片段、引物對(duì)、試劑盒和方法將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。圖1為三種基因型的樣本的電泳結(jié)果。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100-1500bpladder)。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)施例1、特異性DNA片段的發(fā)現(xiàn)和不同豬群的基因頻率統(tǒng)計(jì)一、特異性DNA片段的發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)樣本的信息見表l。表1試驗(yàn)樣本信息品種組合樣本數(shù)類型購買途徑五指山豬Wuzhishan36近交系小型豬中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所巴馬香豬Bamaxiangpig45近交系小型豬廣西大學(xué)巴馬香豬近交繁育中心長白豬Landracepig329長白純種廣東溫氏集團(tuán)提取每個(gè)樣本的基因組DNA，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR的引物對(duì)如下PLInDell:5，-TGATGTGACCAACAAGGACT-3'(如序列表SEQIDNO:2);PRInDell:5，-GGATCGAACCTGCATCTC-3'(如序列表SEQIDNO:3)。PCR體系(20pL):豬基因組DNA約100ng，含IXbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150ixmol/L，引物終濃度為0.2umol/L，2U7鄰DNA聚合酶(PromegeO。PCR擴(kuò)增程序94。C5min，循環(huán)30次(94°C、30s，61°C、30s，72°C、30s)，最后72'C延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，樣本共顯示3種帶型。將PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明33個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物只有一種，PCR產(chǎn)物為序列表的序列4所示的DNA片段(341bp)，將其命名為II基因型；262個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物只有一種，PCR產(chǎn)物為序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的DNA片段(297bp)，將其命名為DD基因型；115個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物為兩種DNA片段的混合物，將其命名為ID基因型。應(yīng)用以上PCR引物對(duì)對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若得到單一341bp片段，則其基因型為II純合體；若得到單一297bp片段，則其基因型為DD純合體;若得到341bp和297bp兩個(gè)片段，其基因型為ID雜合體。II、DD、ID三個(gè)基因型樣本的帶型見圖1。二、不同豬群的基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)在分析的3個(gè)豬群中，基因型及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。_表2特異性DNA片段在3個(gè)豬群中的分布_突變位點(diǎn)InDell(45bp)一品種數(shù)量等位基因頻率不同基因型個(gè)體的數(shù)量IDIIIDDD450.83330.166730150360.34720.6528319143290.12310.8769081248結(jié)果表明在所檢測的3個(gè)豬品種中，中國地方豬群(巴馬香豬和五指山豬)都是II、ID基因型占優(yōu)勢(shì)，而國外豬群(長白豬)是DD基因型占優(yōu)勢(shì)。巴馬香豬B咖axiang五指山Wuzhishan長白豬Landrace實(shí)施例2、特異性DNA片段與豬初生重和斷奶重性狀的關(guān)聯(lián)分析用于性狀關(guān)聯(lián)分析的材料為實(shí)施例1中的329頭長白豬。一、模型的建立首先建立如下的分析模型以消除性別、組合及屠宰批次對(duì)表型值的影響Yijk=n+BATCHYSEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+(SC)jk+Sijk，其中，Yijk是性狀觀察值，p為總體均數(shù)，BATCHi為批次效應(yīng)，SEXj為性別效應(yīng)，COMBINATIONk為組合效應(yīng)，(BS);j為批次和性別的互作效應(yīng)，(BC)jk為批次和組合的互作效應(yīng)，(SC)jk為性別和組合的互作效應(yīng)，Sijk為隨機(jī)誤差，假定服從N(0，a2)分布。應(yīng)用該模型對(duì)每個(gè)性狀進(jìn)行分析并獲得一個(gè)新的性狀值，即標(biāo)準(zhǔn)化的殘差值，然后將所獲得殘差值作為新的性狀值，再建立如下的分析模型Yi產(chǎn)u+GEN0TYPEi+e!」Yij是新的性狀值，u是新的性狀值的總體均值，GENOTYPEi為基因型效應(yīng)，e;j為隨機(jī)誤差，假定服從N(0,o2)分布。至此該模型已經(jīng)消除了性別、組合及屠宰批次的系統(tǒng)誤差。應(yīng)用該模型就可以直接分析基因型的效應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行基因型間的兩兩比較。二、關(guān)聯(lián)分析試驗(yàn)豬群基因型與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析是應(yīng)用SPSS軟件中的一般線性模型程序來完成的。利用實(shí)施例l獲得的基因型檢測結(jié)果，對(duì)每頭豬進(jìn)行基因型與生長性狀以及免疫性狀間的關(guān)聯(lián)分析。在消除了品種、屠宰批次以及性別之間的差異后，基因型間性狀的簡單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，248個(gè)基因型為DD的個(gè)體與81個(gè)基因型為ID的個(gè)體在初生重存在顯著性差異(P<0.05)，在斷奶重存在極顯著差異(P<0.01)。表3基因型與豬初生重和斷奶重性狀的關(guān)聯(lián)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注肩注*表述P〈0.05;肩注**表述P〈0.01。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所<120>—種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒〈130>CGGNARY92079〈160>4〈210>1〈211〉45〈212〉DNA〈213>豬屬豬(Sus)〈400〉1taaatcaaaactcataatggccattaaatcaaaactcataatggc45<210>2<211>20〈212>賺〈213>人工序列<220>〈223><400>2tgatgtgaccaacaaggact20<210>3<211〉18<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉<400>3ggatcgaacctgcatctc18<210〉4<211〉341〈212〉腿<213>豬屬豬(Sus)〈400>4tgatgtgax:c肌c肪ggacttaMccctg8肪tataca肌tagcttatacagctc肪taa60caaaaaaccaaac肌cccaattg3aacatgggcag2iag2icctaiaeitaaac3ttttggcaa120agacgatatacagatggccaataggcacatgaa犯aBtgctcaccattgctaattattag180agaatgcaaatcaaaactcataatggccattaaatc肌aactcataatggcwttaaatc240aaaactcataatggccattaaaaagtctataagaggagttcccactgtggccacaatggg300gtcatcagtgtcttgggagcactgagatgcaggttcgatcc34權(quán)利要求1、輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型的豬。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述DD基因型為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第21卜255位核苷酸的雜合體。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對(duì)進(jìn)行PC財(cái)廣增；所述特異性引物對(duì)為序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4、核苷酸序列為序列表的序列1所示的DNA片段。5、含有權(quán)利要求4所述DNA片段的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6、輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對(duì)，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段。7、權(quán)利要求6所述特異性引物對(duì)在輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求6所述特異性引物對(duì)在制備輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒中的應(yīng)用。9、一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求6所述特異性引物對(duì)。10、權(quán)利要求1至3中任一所述方法、權(quán)利要求4所述DNA片段、權(quán)利要求6所述特異性引物對(duì)、權(quán)利要求9所述試劑盒在豬的育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。本發(fā)明還提供了輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對(duì)，是序列表的序列2和序列3所示的DNA片段。本發(fā)明還提供了與豬初生重和/或斷奶重性狀相關(guān)的DNA片段，如序列1所示。本發(fā)明的DNA片段可用于檢測豬的初生重和斷奶重等生長性狀，從而為豬的分子育種提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明的DNA片段、引物對(duì)、試劑盒和方法將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)C12N15/12GK101603087SQ20091008969公開日2009年12月16日申請(qǐng)日期2009年7月24日優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日發(fā)明者何文波,唐中林,彭克美,勇李,奎李,楊述林,牟玉蓮,王志偉申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所