專利名稱：：與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的fto基因克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于家畜基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
,具體涉及一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)的FTO基因克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬肉是我國人民動(dòng)物蛋白的主要來源。在過去數(shù)十年時(shí)間里，隨著國外高瘦肉率和快生長速度種豬的引進(jìn)，我國豬肉生產(chǎn)在數(shù)量上逐漸滿足了市場(chǎng)的需求。但是，對(duì)瘦肉率和生長速度過度選擇而培育的'神豬在肌肉品質(zhì)方面卻不及中國地方豬。隨著生活水平的提高和消費(fèi)觀念的改變，色、香、味俱佳且安全、營養(yǎng)的瘦肉越來越受到消費(fèi)者的青睞。因此，肌肉品質(zhì)的改良已成為當(dāng)今優(yōu)質(zhì)豬育種工作的重要目標(biāo)，相關(guān)分于標(biāo)記的尋找是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。肌肉品質(zhì)是一個(gè)綜合性狀，常常通過肌肉pH值、肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋、系水力、剪切力、滴水損失、肉色、嫩度、肌纖維直徑等指標(biāo)進(jìn)行度量。這些指標(biāo)之間并不是獨(dú)立的，而是彼此聯(lián)系，共同決定最終的肌肉品質(zhì)。對(duì)于豬肌肉品質(zhì)等復(fù)雜性狀的分子標(biāo)記篩選通常采用QTL掃描結(jié)合候選基因克隆的策略，即首先構(gòu)建一個(gè)資源群體，測(cè)定肌肉品質(zhì)相關(guān)的各種指標(biāo)，并進(jìn)行全基W組的QTL掃描，再在QTL區(qū)域內(nèi)采用功能候選基因法或位置克隆的策略篩選相應(yīng)的標(biāo)記。依據(jù)PigOTLdb(http:〃www.animalgenome.org/OTLdb/pig.html)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL已經(jīng)超過1000個(gè)，幾乎分布在豬所有的染色體上，其中2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、15號(hào)和17號(hào)染色體上與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL最為密集。盡管大量與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL被定位，但是影響肌肉品質(zhì)的基因及分子標(biāo)記研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于此。目前，國內(nèi)外已經(jīng)鑒定的影響肌肉品質(zhì)的主效基因包括(l)WJ7f7基因(Fujii,J等，Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.Sc/ence,1991，253:448-451)，研究表明該基因的C1843T錯(cuò)義突變是導(dǎo)致豬產(chǎn)生應(yīng)激綜合癥而發(fā)生肌肉品質(zhì)下降的主要原因。(2)戶7A^aj基因(Milan,D等，AmutationinPRKAG3associatedwithexcessglycogencontentinpigskeletalmuscle.Sc,'ence,2000，288:1248-1251)，研究表明該基因的一個(gè)突變是導(dǎo)致漢普夏豬產(chǎn)生"酸肉"的主要原因。這兩個(gè)基因的致因突變均已被鑒定，且得到了很好的分子生物學(xué)解釋，因此己被作為分子標(biāo)記用于淘汰"氟垸"敏感基因和"酸肉"基因的育種實(shí)踐中。而其他一些與肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因盡管現(xiàn)在還沒找到致因突變，但是卻發(fā)現(xiàn)其多態(tài)與肌肉品質(zhì)性狀存在顯著相關(guān)，這些基因包括(1)C45T基因(Ciobanu,DC等，Newallelesincalpastatingen",associatedwithmeatqualitytraitsinpigs.Jouma/ofAn,'ma/Sc/'ence,2004,82:2829-2839),研究表明該基因的多個(gè)SNP與肌肉嫩度等多個(gè)肉質(zhì)性狀存在顯著相關(guān)。(2)/W^aP基因(Gerbens，F(xiàn)等'Theeffectofadipocyteandheartfattyacid-bindingproteingenesonintramuscularfatandbackfatcontentinMeishancrossbredpigs.Jowma/of/An/'ma/Sc/'ence,2000,78:552-559),研究表明該基因的突變與肌'內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)。(3)基因(Wang,HL等，MolecularcharacterizationandassociationanalysisofporcineCA3.CytogeneticandGenomeResearch,2006,115:129-133),研究表明該基因的突變與肌內(nèi)脂肪含量及腿臀比例存在極顯著相關(guān)。與已經(jīng)定位的QTL相比，己經(jīng)鑒定出致因突變或發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，說明大量的與肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因有待進(jìn)一步鑒定。FTO(Fatmassandobesityassociated)基因是近年來通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)的與人類肥胖相關(guān)的一個(gè)新基因，其分子生物學(xué)功能目前尚未知曉。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示該基因與體質(zhì)指數(shù)(BodyMassIndex(BMI):是用體重公斤數(shù)除以身高米數(shù)平方得出的數(shù)字，是目前國際上常用的衡量人體胖瘦程度以及是否健康的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn))顯著相關(guān)(Frayling,T.M.，Genome-wideassociationstudiesprovidenewinsightsintotype2diabetesaetiology.NatureReviewsGenetics,2007,8:657-62)。目前在人FTO基因中已經(jīng)鑒定出一系列SNP,其中部分SNP與糖尿病和BMI指數(shù)有極人關(guān)聯(lián)(Dina,C.等，VariationinFTOcontributestochildhoodobesityandsevereadultobesity.NatureGenetics'2007,39:724-6)。'JsKl卩rs9939609就是其中的一個(gè)典型代表，它與人類二型糖尿病顯著相關(guān)，每增加一個(gè)等位基因A,BMI平均增長0.4kg/m2(Shoulders，C.C.TheFTO(fatmassandobesity-associated)gene:biginadipocytelipolysisJournalofLipidResearch,2008,49:495-6.)。FTO基因在大多數(shù)組織中都有表達(dá)，但在下丘腦、腦垂體和腎上垂體前葉高度表達(dá)(Dina,C.等，VariationinFTOcontributestochildhoodobesityandsevereadultobesity.NatureGenetics,2007,39:724-6)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FTO基因在小鼠各組織中的表達(dá)量揭示該基因?qū)δ芰糠€(wěn)態(tài)的調(diào)控起主要作用(Fredriksson,R.等，Theobesitygene,FTO,isofancientorigin,up-regulatedduringfooddeprivationandexpressedinneuronsoffeeding-relatednucleiofthebrain.Endocrinology,2008，149:2062-71.)，并且它在BMI不同的人體脂肪組織中的表達(dá)量是不同的，因此研究推測(cè)FTO基因通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用于脂肪細(xì)胞，起到解脂作用(Wahlen，K.等，Thecommonrs9939609genevariantofthefatmass-andobesity-associatedgeneFTOisrelatedtofatcelllipolysis.JournalofLipidResearch,2008,49:607-11)。由此可見，F(xiàn)TO基因可能在脂肪沉積中發(fā)揮重要功能。但是目前，對(duì)豬FTO基因的研究尚未開展，該基因是否影響豬的脂肪沉積，從而影響豬肉品質(zhì)也尚未可知。研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個(gè)非常有力的手段。所以申請(qǐng)人對(duì)這個(gè)基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期研究該基因的功能，并鑒定與肌肉品質(zhì)相關(guān)的分子標(biāo)記。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因片段'為豬標(biāo)記輔助選擇提供一種分子標(biāo)記。本發(fā)明通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人克隆得到一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)的打O基因片段'它的cDNA序列如序列表SEQIDNO:1所述。所獲得的cDNA序列全長為4320bp,包含1518bp的完整CDS,編碼505個(gè)氨基酸。依據(jù)獲得的如序列表SEQIDNO:1所述cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增和測(cè)序獲得了/TO基因的第三外顯子部分DNA序列，其序列如序列表SEQIDNO:2所述。該序列長度為200bp,其中第37bp處有一個(gè)A37-G37的堿基突變，導(dǎo)致5sWZtf/PCR-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明設(shè)計(jì)了所述基因片段堿基突變的引物對(duì)，所述引物的正向引物為一5'GGGACTCCACAAAGAGGTTCA3'，反向引物為5'TTGCATCAGAGCCCTTCACT3'。一種制備與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)FTO基因分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟用人FTO基因mRNA序列為探針，作同源序列篩選，獲得同源性90%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST);然后拼接豬EST-重疊群；根據(jù)EST-重疊群序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增獲得如序列表SEQIDNO:1所述的mRNA序列；依據(jù)該mRNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)豬基因組DNA,獲得如序列表SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。本發(fā)明的具體實(shí)施方案如《具體實(shí)施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的/^TO基因的mRNA序列。序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明中用于分型所用的豬尸7D基因DNA序列片段。圖l:是本發(fā)明技術(shù)流程圖。圖2:是本發(fā)明中用于加W2M/PCR-RFLP分型所用的豬iT0基因DNA序列片段，所述引物用下劃線表示，第37位(^Q代表A-G突變。圖3:是本發(fā)明克隆的豬FrO基因第3外顯子的&W"WPCR-RFLP的三種基因型電泳結(jié)果。圖中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1/TO基因的核苷酸序列克隆及SNP掃描1.F7"0基因的cDNA克隆(1)引物設(shè)計(jì)利用人FTO基因的mRNA序列(GenBank收錄號(hào):NM—001080432)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的ESTs(片段長度大于100bp)，利用DNAStar軟件中的S叫Man程序構(gòu)建豬/TO基因EST-重疊群，據(jù)此分別設(shè)計(jì)用于'5'SXt6和3'RACE以及用于編碼區(qū)(CDS)及3'非翻譯區(qū)(3'UTR)擴(kuò)增的引物，引物DNA序列如表1所示表1:用于基因cDNA克隆的引物序列設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>FTO-UStgctcaccactcgccagaac6022953'UTR擴(kuò)增FTO-URtgacctctct魄ccccttac(2)RACE及RT-PCR擴(kuò)增參照TriZoL試劑盒(美國GIBCO公司產(chǎn)品)說明書步驟，利用該試劑盒從成年通城豬肌肉組織中提取總RNA;利用經(jīng)DEPC處理的超純水溶解總RNA，利用DnaseI酶(美國Promega公司產(chǎn)品)于37。C處理30分鐘、并經(jīng)等體積的酚-仿抽提進(jìn)行RNA的純化；通過DU640核酸-蛋白質(zhì)濃度測(cè)定儀(美國Beckman公司產(chǎn)品)測(cè)定RNA的濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。利用RACE試劑盒(美國CLONTECH公司產(chǎn)品)首先進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，cDNA第一鏈合成之后首先以此產(chǎn)物為擴(kuò)增模版，利用基因特異性外側(cè)引物(FTO-50和FTO-30)及上述RACE試劑盒中的通用引物，用金牌快速T叫酶(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按照該試劑盒說明書配置；擴(kuò)增條件為95°C5min;2*(94'C,20sec,68。C,10sec,72。C，10sec);3*(94。C,20sec,65'C，10sec,72。C，10sec);25*(94。C，20sec，62。C，10sec，72。C，10sec);72°C,5min;15'C，2min。在此基礎(chǔ)上，將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，以此稀釋液為模版，利用基因特異性內(nèi)側(cè)引物(FTO-5I和FTO-31)及RACE試劑盒中的內(nèi)側(cè)通用引物，用銀牌快速Taq酶(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按照說明書配置，PCR反應(yīng)條件與第一輪擴(kuò)增條件相同。以上述cDNA第一鏈為擴(kuò)增模板，利用FTO-CS與FTO-CR配對(duì)擴(kuò)增FTO基因的編碼區(qū)，利用FTO-US與FTO-UR配對(duì)擴(kuò)增FTO基因的3'非翻譯區(qū)，PCR反應(yīng)均采用上述銀牌快速Taq酶完成，擴(kuò)增條件為95。C5min;34*(94°C20sec,6(TC,10sec，72"C，15sec);72°C,5min。(3)產(chǎn)物克隆與測(cè)序?qū)ACE及RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(美國Promega公司產(chǎn)品)連接，連接反應(yīng)總體積是5[il，其中包括2.5plSoulutionl，0.5^1的pGEM-T載體，2nl的PCR產(chǎn)物，于4'C冰箱連接過夜；無菌狀態(tài)下取100120nl感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中，將5nl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400pl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)45min。取100pl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-P-D-galactoside，異丙基硫代—(3-D—半乳糖苷沐X-gal的瓊脂平板上，37'C平放1h后倒置培養(yǎng);用牙簽挑取單克隆置于l.SmlEppeMorf管中，37。C培養(yǎng)68小時(shí)，取lpl菌液作為PCR擴(kuò)增的模版，利用RACE擴(kuò)增的內(nèi)側(cè)引物(GSP5I/GSP31)配合通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有陽性擴(kuò)增產(chǎn)物者即為陽性克隆子；陽性菌液送由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。豬FH基因cDNA克隆的結(jié)果:通過Seqman拼接測(cè)序序列并去掉外源的通用引物已獲得豬尸TO基因cDNA序列4320bp,通過ORF預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬F7U基因編碼505個(gè)氨基酸。2.fTO基因的SNP掃描利用上述RNA提取及純化方法，同時(shí)利用外來豬長白豬和中國地方豬通城豬兩種不同來源的肌肉組織提取總RNA并純化'采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司產(chǎn)品)制備cDNA。利用上述用于豬FTO基因CDS及3，UTR擴(kuò)增的引物同時(shí)擴(kuò)增兩種來源的cDNA'PCR產(chǎn)物經(jīng)天根生化科技(北京)有限公司的純化試劑盒回收后，直接送交北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。利用DNAStar軟件的S叫man程序進(jìn)行拼接和序列比對(duì)，搜尋其中的SNP位點(diǎn)。Fr0基因的SNP掃描結(jié)果通過比較兩種擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)了位于第三外顯子的90bp處的一個(gè)A-G堿基突變，位于第三外顯子的471bp處的一個(gè)C-G堿基突變和位于第四外顯子的62bp處的一個(gè)T-C堿基突變。實(shí)施例2基因A37G勘W"6！PCR-RFLP基因型遺傳多樣性檢測(cè)及與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析1.^sW236JPCR-RFLP檢測(cè)方法的建立(1)引物設(shè)計(jì)針對(duì)發(fā)現(xiàn)的第二外顯子的90bp處A-G堿基突變，設(shè)計(jì)了下列擴(kuò)增引物FTO-S:5'GGGACTCCACAAAGAGGTTCA3',FTO-R:5'TTGCATCAGAGCCCTTCACT3'。依據(jù)突變位點(diǎn)在擴(kuò)增片段中位于第37位，將此突變命名為A37G。(2)PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積10nl，其中包含約100ng豬基因組DNA，含1XPCRBuffer,1.5mmol/LMgCl2，150nmol每種dNTP，0.3)jmol每條引物，1單位7^DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序是94'C5min，(94'C30s，60°C30s，72°C20s)循環(huán)35次，72°C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)feW236/RFLP基因分型PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是5nl，其中10x及Buffer0.5PCR產(chǎn)物2pl，限制性內(nèi)切酶fisW236/為2U，用滅菌水補(bǔ)充至5nl，將樣品混勻后離心，37'C水浴10小時(shí)，用2°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。利用引物FTO-S與FTO-R配對(duì)擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200bp,序列如圖2所示。分析發(fā)現(xiàn)該片段包含的A37G可以引起&W"6I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(5-CGCTG-3)的丟失與保留，即當(dāng)該位點(diǎn)為A等位基因時(shí)，不能被&WW6I所酶切，而當(dāng)該位點(diǎn)為G等位基因時(shí)，能夠被&WB6I酶所切開。因此，AA純合型個(gè)體不被酶切，形成一條大小為200bp的片段，而GG純合型個(gè)體酶切產(chǎn)生的片段大小分別為164bp和36bp，AG雜合型則形成三種大小的條帶。因此，通過PCR擴(kuò)增首先獲得200bp的產(chǎn)物，經(jīng)過酶切可以區(qū)分三種不同的基因型個(gè)體，部分電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。2.遺傳多樣性檢測(cè)利用上述建立的F7D基因A37G突變PCR-RFLP檢測(cè)方法在國外三個(gè)商業(yè)品種和國內(nèi)七個(gè)地方品種共213個(gè)無親緣關(guān)系的個(gè)體中檢測(cè)兩種等位基因的頻率，結(jié)果如表2所示表2.FTO基因A37G突變?cè)诓煌贩N中等位基因頻率檢測(cè)結(jié)果品種Breed個(gè)體數(shù)NumberAAAGGG頻率(。/。)(Frequency)AG杜洛克178720.680.32約克夏1821060.390.61長白115600.730.27二花臉30003001<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過上述等位基因檢測(cè)結(jié)果可以看出，國外品種的豬A等位基因占優(yōu)勢(shì)，而國內(nèi)地方品種中G,等辟基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，說明該突變?cè)趪鴥?nèi)外瘦肉型與脂肪型豬中存在相對(duì)的差異。2.標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用組建的通城豬群(通城豬為湖北省通城縣地方豬種，為公開推廣應(yīng)用的一個(gè)地方豬品種)、長白豬群和大白豬群進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，制備了195個(gè)DNA樣品用于基因型檢測(cè)，并建立了如下線性模型Y=|i+Xgenotype+Xbreed+Xbatch+&jk，其中，Y是性狀觀察值，tl為總體均數(shù)，X辟n。加e為基因型效應(yīng)，Xb加h為性別效應(yīng)，Xb咖d為組合的效應(yīng)，Eijk為隨機(jī)誤差。在一個(gè)通城豬實(shí)驗(yàn)群體中對(duì)i^O基因第三外顯子1PCR-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分生產(chǎn)與肉質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，這些肉質(zhì)性狀包括肌肉pH值、大理石紋評(píng)分、滴水損失、剪切力、肌肉顏色等。在所檢測(cè)的195個(gè)個(gè)體中，AA型個(gè)體為24個(gè)，AG型個(gè)體為62個(gè)，而GG型個(gè)體為109個(gè)，其中AA型個(gè)體滴水損失顯著高于GG型個(gè)體(P=0.0179)，基因型間性狀觀察值的簡單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)如表3所示。表3.豬FTO基因SNPA37G不同基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*代表達(dá)到0.05顯著水平。序列表<110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120〉與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的FTO基因克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用<130><141>2008-10-07<腸3<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>4320<212>腿〈213〉豬(Susscrofa)〈220〉<221>gene〈222〉(1)..(4320)〈223〉<220><221〉polyA_signal〈222〉(4271).(4276)〈223><220><221>CDS〈222〉(223)..(1740)<223>〈220>〈221〉5'UTR<222〉(1)..(222)<223>〈220〉<221>3'UTR<222>(1741)..(4320)<223><400>1ctacgatcacccagctgttggacctgggaaattctcttgctcca犯ccccgaggcg犯tt60ccggcgtagccgtggtgcgctctgggagtggtsgttctcgcggctccgsgagcg犯tggc120gccaggcggg3gc犯g3tcccgag卿3Ct3csc卿ggeiggcggggtcc3gggcgcgga1803tctscgcggctagcsgtggcgaaggaggctat3gcagcsgcstgaagcgascc234MetLysArgThr1cc3ax;cgccgaggaacgagagcgcgggiget卿s犯ctgaggcttctt282ProThrAlaGluGluArgGluArgGlyAlaLysLysLeuArgLeuLeu5gaagagGluGlugasttcGluPhegaagcaGluAlattcetcPheLeu70atecaalieGin85犯ccccAsnProccctggProTrpggcgccGlyAlag3g￡LCCGluThr150ategaclieAsp165atggggMetGlyctgg犯LeuGlutatTyrggcGly55gC3AlacagGin40ageSerctgLeuGlyLysggctgcGlyCysProgccAla135atelieaxxThrgtgVal120tgcCyscagGingtgValAsp25cagGin10actThrtggTrpgtccctVslProHisLysg3tAspThr105卿LysttgLeu90tacTyrggcGlyC3g3CCGinThrgcgctgAlaLeuccgProgcgAla170gacAsptggcttTrpLeucagctgGinLeug￡igggaGluGly60catHis75etcLeutax:LysTyrtctgatSerAspttcPheg明Glu155tgtCysccttatProTyr30aaatacLysTyr45etcLeuHisggcGlyThretcLeu140g犯GluatalietgcCysProctgLeugcaAla125卿匕ysggcGlycatHisgacAspteatectttSerSerPhe185gccgcctacaacetaactttgttgagegagGlu190ttc15ctgLeua<ccThrcccProcctaagetaProLysLeuLeugtaVal犯cAsn110卿LysetcLeu3aaLystttPhetctSer95ThrgagGlueggArg80cgcArg郷ArggttVal65gacAspetcLeuetcLeuaaaLysattlie50Gin20AspAsp35etccgaLeuArggaagccGluAla330CtggtC3ggLeuValArgtsc肌tgagTyrAsnGluetcgetLeuAlaggtccaGlyProg3CAsp卿Lys160ttcPhetacTyr145gagGlucccProetcLeuttcPhegccAla130ctgLeuattlieThr115gagGlucagGinaaagccaatLysAlaAsnaacAsngccAlagatAsp175gtggac鄉(xiāng)sagsgcValAspArgLysSer195atggatccccagaaaggtGly100gtcValatalieattlieaggArggtcValggcGly180柳Argatg378426474522570618666714762810858AlaAlaTyrAsnLeuThrLeuLeuSerPheMetAspProGinLysMet200205210ccgtacctgaaagaggagccctactttggcatggggaagatggetgtg906ProTyrLeuLysGluGluProTyrPheGlyMetGlyLysMetAlaVal215220225agetggcatcacgatgaaaatctggtggacaggteagcggtggcagtg954SerTrpHisHisAspGluAsnLeuValAspArgSerAlaValAlaVal230235240tac犯、tatagetgtg朋ggccctg肌gaggaaagegaggstgatccc1002TyrAsnTyrSerCysGluGlyProGluGluGluSerGluAspAspPro245250255260cagetcgaaggcagagatcccgatgtgtggcatgttggctttaagate1050GinLeuGluGlyArgA印ProAspValT卬HisValGlyPheLyslie265270275teatgggacatagagacccctggtttggcgataccccttcaccaagga1098SerTrpAsplieGluThrProGlyLeuAlalieProLeuHisGinGly280285290gactgctactttatgctggatgatetcaatgccacccaccaacactgt1146AspCysTyrPheMetLeuAspAspLeuAsnAlaThrHisGinHisCys295300305gttttggetggtttaccaccceggtttagttecacccaccgagtggcc1194ValLeuAlaGlyLeuProProArgPheSerSerThrHisArgValAla310315320gagtgctegacgggagccttggattacatettacagcgctgccagttg1242GluCysSerThrGlyAlaLeuAspTyrlieLeuGinArgCysGinLeu325330335340gccctgcagsatgtccgtgatgaggcggacagtggtg肌gtctctttg1290AlaLeuGinAsnValArgAspGluAlaAspSerGlyGluValSerLeu345350355a肌tecttggsgcctgcggtt.ttg3犯C33ggag犯g朋atecacsac1338LysSerLeuGluProAlaValLeuLysGinGlyGluGlulieHisAsn360365370gaggtcgagtttgagtggctg卿cagttttggtUcaaggcaatcga1386GluValGluPheGluTrpLeuArgGinPheTrpPheGinGlyAsnArg375380385tacTyrgagGlu405gttValgccAlacatHis卿LysctgLeu485ctgLeuaaaLys390cttLeu卿ArgateliegccAlacca_Pro470ccgProg肌Glu幼gLystggTrp卿ArgetaLeu鄉(xiāng)Arg455g犯GluUtPhegccAlatgcCys卿LysGlugccAla440tgcCys3CCThr卿LysgggGly425gtgValcagGintgceggCysArggatetcAspLeua犯cccLysPro505AspatgMet410gccAlaetcLeutecSerccgProtggTrp395gaaGlucctPro3CCThrArgtat丁yr475gscAsptggTrpggtGlygtgValactThrattlie460tggTrptgtCysgcgAlag幼GlucgcArg445gccAlag犯Gluc犯Gin￡ICCThrcagGin430cagGinArgLyscccProcatHis415兆cSeraacAsnactThrgatAspMet400getAla8gtSerctgLeuctgLeugstAsp480etcLeuactThrgtgValgacAsp鄉(xiāng)ArgcctPro465cccProcagGincttLeuatelie鄉(xiāng)Arg450gtgValtecSer柳ArgggtGlyacagacactgtggetgaaThrAspThrValAlaGlu490艦tagagaaagageecaagtctcaggtggaggaggctgLeucgtArgctgLeu435g站Glug￡lCAsp￡Lt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IDNO:2的第37bp處為A37-G37的堿基突變，導(dǎo)致1-RFLP多態(tài)性。3、檢測(cè)權(quán)利要求2所述與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的FTO基因片段堿基突變的引物對(duì)，所述弓l物的正向弓l物為5'GGGACTCCACAAAGAGGTTCA3'，反向引物為5'TTGCATCAGAGCCCTTCACT3'。4、權(quán)利要求1或2所述的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的FTO基因片段在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求3所述的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的FTO基因片段堿基突變引物對(duì)在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。6、制備如權(quán)利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步驟用人FTO基因cDNA為探針，作同源序列篩選，獲得同源性90%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST);然后拼接豬EST-重疊群；根據(jù)EST-重疊群序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增獲得如序列表SEQIDNO::1所述的cDNA序列；依據(jù)該cDNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增豬基因組DNA，獲得如序列表SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明屬于家畜基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由FTO基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO2的第37bp處有一個(gè)有一個(gè)A37-G37的堿基替換，該替換導(dǎo)致Bsh1236IPCR-RFLP酶切多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增FTO基因完整cDNA序列和部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測(cè)的方法，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。文檔編號(hào)C12N15/10GK101392255SQ20081019722公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者梅余,榜劉,瑩張,徐學(xué)文,朱猛進(jìn),奎李,斌樊,趙書紅申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)