專利名稱：與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
我國是世界上養(yǎng)豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)第一大國，在我國的肉類食品消費(fèi)結(jié)構(gòu)中，豬肉的消費(fèi)量高達(dá)2/3。養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)是我國發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)，增加農(nóng)民收入的支柱產(chǎn)業(yè)之一。目前，我國養(yǎng)豬生產(chǎn)面臨的突出問題是疾病，它嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。疾病一方面造成養(yǎng)豬死亡率高、出欄率低，效益降低，另一方面為了控制疾病大量使用藥物導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降，而且大量使用藥物導(dǎo)致耐藥菌株、強(qiáng)毒株的出現(xiàn)使疾病的控制更加復(fù)雜。豬病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，美國每年由于豬病付出的費(fèi)用超過15億美元，發(fā)展中國家由于豬病造成的經(jīng)濟(jì)損失更大，約占養(yǎng)豬生產(chǎn)總值的30％。因此，尋找新的抗病策略，培育抗病品系，已成一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。
目前抗病育種的途徑有直接選擇和間接選擇兩種。直接選擇是在直接接觸或人工接種病原體的情況下對(duì)抗病個(gè)體進(jìn)行直接選擇。該法具有很強(qiáng)的直觀性，但由于很多疾病的發(fā)生難以定性，攻擊的病原程度和標(biāo)準(zhǔn)難以確定，疾病性狀遺傳力較低，大規(guī)模疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較大，所以直接選擇很難被采用。目前主要通過間接選擇進(jìn)行來進(jìn)行育種，主要是對(duì)一些免疫指標(biāo)以及與免疫指標(biāo)相關(guān)的分子標(biāo)記來進(jìn)行選育。隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種已成為研究的熱點(diǎn)和趨勢(shì)。應(yīng)用分子技術(shù)闡明免疫應(yīng)答的分子機(jī)理和遺傳控制機(jī)制，結(jié)合免疫性狀指標(biāo)進(jìn)行抗病育種，必將大大加快動(dòng)物抗病育種的進(jìn)程。
分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的核心是抗病主效基因以及抗病相關(guān)的分子標(biāo)記的鑒定。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)豬免疫力相關(guān)的基因進(jìn)行了大量的研究。找到了一些與豬抗病相關(guān)的遺傳標(biāo)記以及抗病基因。豬的MHC定名為豬的淋巴細(xì)胞抗原(SLA)。SLA有關(guān)基因涉及到一系列免疫應(yīng)答的控制、補(bǔ)體成分及參與抗原傳遞的主要分子。豬單倍型SLAa/a對(duì)感染支氣管敗血性波氏桿菌高反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)(Rothschild等，Breed andswine lymphocyte antigen haplotype differences in agglutination titers following vaccinationwith B.bronchiseptica.J Anim Sci 1984，59，643-9)，單倍型SLAd/d、SLAd/g、SLAg/g在特定抗原反應(yīng)上優(yōu)于SLAa/a、SLAa/c、SLAa/d、SLAc/c、SLAc/d(Mallard等，Genetic and other effects on antibody and cellmediated immune response in swine leucocyte antigen(SLA)-defined miniature pigs.Anim Genet1989，20，167-78)。Sinclair微型豬的黑色素瘤由兩個(gè)位點(diǎn)控制，一個(gè)在SLA內(nèi)，控制其表型；另一為非SLA控制的突變基因，能啟動(dòng)瘤的發(fā)育(Tissot等，Esophageal Abrikosov’s tumor，preoperativediagnosis with echoendoscopy.1987 J Chir(Paris)，124，372-4)。引起斷奶后仔豬腹瀉和水腫病的E.coli F18受體的候選基因是α(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1(FUT1)，在第103位堿基突變導(dǎo)致了氨基酸由Ala變成Thr，研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)位點(diǎn)與大腸桿菌的易感性相關(guān)(Meijerink等，A DNA polymorphisminfluencing alpha(1，2)fucosyltransferase activity of the pig FUT1 enzyme determinessusceptibility of small intestinal epithelium to Escherichia coli F18 adhesion.2000Immunogenetics，52，129-36)。豬應(yīng)激綜合征(PSS)是由I型蘭尼定受體基因(RYRI)控制，該基因物理定位于SSC6q1.1—1.2，又稱鈣離子釋放通道基因(CRC)或氟烷敏感基因(Haln)，隱性純合子(HalnHaln)發(fā)病。分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)是cDNA第1843堿基由C突變成T，從而使編碼的氨基酸由Arg615改變成Cys615，引起一系列生理變化導(dǎo)致PSS的發(fā)生(Fujii等，Identification of a mutation in porcine ryanodinereceptor associated with malignant hyperthermia.1991 science，253，448-51)。
LGP2基因RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)信號(hào)通路的重要抑制基因。RIG-I信號(hào)通路是新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于Toll信號(hào)通路的新的抗病毒信號(hào)通路(Komuro等，Negative regulation of cytoplasmicRNA-mediated antiviral signaling.2008，Cytokine.)。目前發(fā)現(xiàn)RIG-1信號(hào)通過的主要組成有RIG-1，MAD5(melanoma differentiation-associated gene 5)以及Cardif。RIG-1，MAD5都是RNA解螺旋酶，具有相似的結(jié)構(gòu)，都具有2個(gè)N末端CARD(two amino-terminal caspase recruitment domains)和一個(gè)DExD/H-box RNA解螺旋酶結(jié)構(gòu)域(Yoneyama等，Shared and unique functions of the DExD/H-Box helicasesRIG-I，MDA5，and LGP2 in antiviral innate immunity.2005，J.Immunol，175，2851-2858)。當(dāng)RIG-1或者M(jìn)AD5結(jié)合dsRNA病毒基因組后，它們發(fā)生構(gòu)象變化，使得N末端的CARD結(jié)構(gòu)域打開，進(jìn)而和Cardif上CARD結(jié)構(gòu)域發(fā)生互作傳遞信號(hào)，最終激活I(lǐng)FN表達(dá)抵抗感染。LGP2和RIG-1、MAD5同源也具有DExD/H-boxRNA解螺旋酶結(jié)構(gòu)域，但是缺少CARD結(jié)構(gòu)域，因此它可以和dsRNA病毒基因組結(jié)合，但是不能傳遞信號(hào)，在RIG-1信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)節(jié)的作用(Rothenfusser等，The RNA helicase Lgp 2 inhibits TLR-independentsensing of viral replication by retinoic acidinducible gene-I.2005，J.Immunol.175，5260-5268)。本發(fā)明申請(qǐng)中，克隆了豬LGP2基因，并找到了一個(gè)與豬免疫性狀密切相關(guān)的突變位點(diǎn)。為豬的抗病育種提供了新的分子標(biāo)記。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，通過PCR擴(kuò)增LPG2基因部分DNA片段，尋找突變位點(diǎn)，篩選一種與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，利用該分子標(biāo)記進(jìn)行豬免疫性狀的標(biāo)記輔助選擇關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。
申請(qǐng)人:通過基因克隆方法，得到一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所述。在其126bp處有一個(gè)G126-C126的堿基突變，導(dǎo)致KpnI-RFLP多態(tài)性。
設(shè)計(jì)了一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段突變的引物對(duì)，所述的引物對(duì)的正向引物為5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物為5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’。
公布一種制備如上述與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段的方法，按照以下步驟 (1)用人LGP2基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；提取豬脾臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計(jì)引物對(duì)，其中所述引物對(duì)的正向引物為5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物為5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法擴(kuò)增豬LGP2基因的cDNA片段，PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序，通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO1所述的序列； (2)根據(jù)SEQ ID NO1所述的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述的引物對(duì)的正向引物為5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物為5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’擴(kuò)增豬基因組DNA；將PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序、通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。
在本發(fā)明的實(shí)施例中申請(qǐng)人已將制備的與豬免疫性狀相關(guān)分子標(biāo)記應(yīng)用在豬分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。
更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式
》。
本發(fā)明的效果是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為豬的抗病育種提供了新的分子標(biāo)記。。



序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的免疫相關(guān)基因LGP2的cDNA片段序列。
序列表SEQ ID NO2是本發(fā)明克隆的免疫相關(guān)基因LGP2的DNA片段序列。
圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程示意圖。
圖2是克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因LGP2部分cDNA序列。
圖3是克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因LGP2基因部分DNA序列，其中第126位堿基處的的突變位點(diǎn)是G126-C126。
圖4本發(fā)明中LGP2基因部分DNA序列的RFLP-Kpn I的三種基因型(GG GC CC)電泳圖譜。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施實(shí)例1 (一)LGP2基因部分cDNA序列PCR擴(kuò)增及部分DNA序列擴(kuò)增 (1)引物設(shè)計(jì) 用人LGP2基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；提取豬脾臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計(jì)引物對(duì)，其中所述引物對(duì)的正向引物為5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物為5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法擴(kuò)增豬LGP2基因的cDNA片段，PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序，通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO1所述的序列；根據(jù)SEQ ID NO1所述的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述的引物對(duì)的正向引物為5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物為5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’擴(kuò)增豬基因組DNA；將PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序、通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。在SEQ ID NO2所述的序列的126bp處有一個(gè)G126-C126的堿基突變，導(dǎo)致KpnI-RFLP多態(tài)性。
(2)PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序 PCR擴(kuò)增SEQ ID NO110μL體系雙蒸水5.9μL、10×buffer 1μL、25mM Mg2+ 0.6μL、2.5mMdNTP 0.8μL、正向引物0.3μL、反向引物0.3μL、5U/μL Taq酶0.1μL、長白豬cDNA 1μL。擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸90s、35個(gè)循環(huán)、72℃再延伸5min。共10管。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
SEQ ID NO2 10μL體系雙蒸水7μL、10×buffer 1μL、2.5mM dNTP 0.8μL、正向引物0.3μL、反向引物0.3μL、5U/μL Taq酶0.1μL，溫氏群體基因組DNA 0.5μL。擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s、35個(gè)循環(huán)、72℃再延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。共302個(gè)樣本。
SEQ ID NO1 PCR產(chǎn)物的回收使用博大泰克公司小量DNA回收試劑盒。在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL Ependorff管中，按每100μgl％凝膠加入700μL溶膠液的比例，加入溶膠液，于65℃溫育至凝膠完全融化。將膠液上柱，體積過大可分幾次上柱，9000rmp離心30s。倒掉收集管中液體，在吸附柱中加入500μL漂洗液，1200rmp離心30s，倒掉收集管中液體，重復(fù)此操作一次。將柱子1200rmp離心2min，除去乙醇。將吸附柱放入新的1.5mL Ependorff管中，往柱子中央加入30μL雙蒸水，室溫放置2分鐘，1200rmp離心2min，得到回收產(chǎn)物。檢測(cè)，送公司測(cè)序。
(3)DNA序列同源性檢索鑒定 通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該cDNA序列的功能信息。
(二)PCR-RFLP診斷方法建立 RFLP檢測(cè)10μL酶切體系雙蒸水3.8μL、10×Buffer 1μL、限制性內(nèi)切酶Kpn I 0.2μL(10U/μL)、PCR產(chǎn)物5μL。將樣品混勻后離心，37℃培養(yǎng)箱放置12h。2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。
擴(kuò)增豬基因組DNA得到了334bp特異性擴(kuò)增片段(詳見圖4)，序列分析結(jié)果表明在126bp處存在G126-C126突變，并導(dǎo)致RFLP-Kpn I多態(tài)性。該基因突變位點(diǎn)由兩個(gè)等位基因控制，其中G是沒有形成酶切位點(diǎn)的等位基因，C是形成酶切位點(diǎn)的等位基因。這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型，其中GG型為未發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)只有334bp一條DNA帶)，CC型為發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)208bp和126bp兩條DNA帶)，GC為雜合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)334bp、208bp和126bp三條DNA帶)。
實(shí)施例2 利用PCR-Kpn I-RFLP檢測(cè)了廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的“長白豬”群(一種具有國外豬血緣的豬種)，豬群的基因型頻率、基因頻率見表1。研究結(jié)果顯示LGP2基因各基因型在長白豬種均有分布，在344個(gè)個(gè)體中GG基因型有120個(gè)，GC基因型有171個(gè)個(gè)體，CC基因型有53個(gè)個(gè)體。G等位基因頻率為60％，C等為基因頻率為40％。G等位基因占優(yōu)勢(shì)。
表1 本發(fā)明的PCR-Kpn I-RFLP多態(tài)性在長白豬中的分布
實(shí)施例3 基因型與免疫性狀關(guān)聯(lián)分析所用的實(shí)驗(yàn)豬群來自廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的長白豬群。父母代及子一代全部進(jìn)行了基因型檢測(cè)，子代在0、17、32日齡采集抗凝血和非抗凝血，用于血常規(guī)和抗體水平檢測(cè)。
所分析的性狀主要是免疫性狀，包括子一代豬分別在0、17、32三個(gè)日齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水平、偽狂犬抗體水平及血常規(guī)18項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，申請(qǐng)人運(yùn)用混合模型來統(tǒng)計(jì)分析LGP2基因SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與免疫指標(biāo)的關(guān)系 Y＝Xβ+Zγ+e 其中Y為免疫性狀測(cè)定值向量；X為固定效應(yīng)關(guān)聯(lián)矩陣；β為固定效應(yīng)參數(shù)向量，包括性別效應(yīng)、胎次效應(yīng)、線別效應(yīng)、候選基因的基因型效應(yīng)；Z為混合模型中的隨機(jī)效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣；γ為所有隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)向量，包括公畜效應(yīng)、公畜內(nèi)母畜效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)；采用SAS(Version 8.0)軟件中MIXED MODELS程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
對(duì)豬LGP2基因DNA片段第Kpn I-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分免疫性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。所分析的免疫性狀主要是子一代豬分別在0、17、32三個(gè)日齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水平、偽狂犬抗體水平及血常規(guī)18項(xiàng)指標(biāo)，不同基因型之間性狀差異顯著性的結(jié)果如表2-4所示，所得到相關(guān)的性狀是0日齡紅細(xì)胞分布寬度(見表5)、17日齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平，17日齡白細(xì)胞，17日齡淋巴細(xì)胞絕對(duì)值，17日齡血小板分布寬度，17日齡血小板體積以及17日齡大血小板比率如表6所示。
表2 LGP2基因片段126G/C多態(tài)性與0日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)
注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表3 LGP2基因片段126G/C多態(tài)性與17日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)
注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表4 LGP2基因片段126G/C多態(tài)性與32日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)

注**表示P<0.01，*表示P<0.05。
表5LGP2基因片段DNA序列的126G/C突變位點(diǎn)不同基因型對(duì)0日齡免疫性狀的影響
注a，b表示P<0.05。
表6LGP2基因片段DNA序列的126G/C突變位點(diǎn)不同基因型對(duì)17日齡免疫性狀的影響
注a，b表示P<0.05。
由表6可知，GG基因型個(gè)體的17日齡白細(xì)胞記數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、血小板分布寬度以及大血小板比率顯著高于CC或GC基因型(P<0.05)；因此，G等位基因是17日齡白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、血小板分布寬度以及大血小板比率的有利等位基因。另外，我們發(fā)現(xiàn)GG基因型個(gè)體的17日齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平較低。白細(xì)胞數(shù)也越高表明機(jī)體對(duì)于疾病的抵抗力越強(qiáng)，而且豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平低說明感染程度較低。因此，選擇G等位基因?qū)ωi抗病性狀選擇是有利的。
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用
<130>
<141>2008-10-06
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2574
<212>DNA
<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2574)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(243)..(2288)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(2556)..(2574)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<223>
<400>1
cctttctgtc tgccctgctt ctgaagctcg tagttttttt cggaggggca gggaagggag 60
agtcttagtt tgatctctgc tgggctagct cctcccttca gtttcagttt ccatttcctt 120
ctcagcaagc ccagcggcat ctgggctaag cccgcagagc gcagagcggc cagtgagacg 180
ctgagggagc aggtgtggtc cttagtcctc tgcctcccct cctacccaga taaggttcct 240
ga atg gag ctg cga ccc tac cag tgg gag gtg atc atg ccc gct ctg 287
etu eu Arg Pro r n rp u a I e et Pro A a eu
1 5 10 15
gag ggc agg aat atc atc ata tgg ctg ccc acg ggc gct ggc aag acc335
uArg Asn I e I e I erp eu Pro r A asr
20 25 30
agg gcg gct gct tat gtg gcc aag agg cat ctg gag act gtg gat gga 383
Arg Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly
35 40 45
gcc aag gtg gtt gtg ctg gtc aac agg gta cac ctg gtg acc cag cat 431
Ala Lys Val Val Val Leu Val Asn Arg Val His Leu Val Thr Gln His
50 55 60
tgt gag gag ttc agc cgc atg ctg gac aga cgc tgg gcc att acc acc 479
Cys Glu Glu Phe Ser Arg Met Leu Asp Arg Arg Trp Ala Ile Thr Thr
65 70 75
ctg agc ggg gac atg ggg cca cga gcc ggc ttt ggc cac ctg gcc cgg 527
Leu Ser Gly Asp Met Gly Pro Arg Ala Gly Phe Gly His Leu Ala Arg
80 85 90 95
agc cat gat ctg ctc atc tgc aca gct gag ctg cta cag aag gcg ctg 575
Ser His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ala Leu
100 105 110
acc agc gag gag gag gag gag cac gtg gag ctc aac gtc ttctcc ctg623
Thr Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu
115120 125
ctg gtg gtg gatgag tgt cac cac aca cac aaa gac acc gtctac aac 67l
Leu Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn
130 135 140
atc atc ctg agc cag tac ctg aag cat aaa ttc cag agg acg aag cca 719
Ile Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro
145 150 155
ctg ccg cag gtg ctt ggg ctc aca gcc tcc cca ggc aca ggc agg gcc 767
Leu Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala
160 165 170 175
tcg aca ctc gat ggc gcc att gac cac atc ctg cag ctc tgt gcc aac 815
Ser Thr Leu Asp Gly Ala Ile Asp His Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asn
180 185 190
ctg gat acg tgg cgc atc atg tca ccc cag aactcc cgctcc cag ctg 863
Leu Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu
195 200 205
cag gag cac agc cgg cag ccc tgc aaa cag tac gac ctc tgc cac cag 91l
Gln Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln
210215 220
cgt gcc cag gac ccg ttt ggg gcc aag ctg aag aag ctc atg gac aaa 959
Arg Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys
225 230 235
atc cac cgc cat ctg gag atg ccg gag ttg aga cgg gac ttt ggg act 1007
Ile His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr
240 245 250 255
cag aca tac gag cag caa gtg gtg gag ctg agc caa gct gcg gct gag 1055
Gln Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu
260 265 270
gcg ggg ctc cag gag cgg agg gtg tat gcg ctt cac ctg cgt cgc tac 1103
Ala Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr
275 280 285
aac gat gcg ctg ctc atc cac gac aca gtc cgc gcg gtg gac gcc ctg 1151
Asn Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu
290 295 300
gcc acg ctg cgg gat ttc cac acc agg gag cgc gcc acc aag acc cag 1199
Ala Thr Leu Arg Asp Phe His Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln
305 310 315
atc cta cag gct gag cgc tgg ctg ctg gcg ctg ttt gat gat cac aag 1247
Ile Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys
320 325330 335
aat gag ctg gcc cgc ctg gca gct gat ggc cca gag aac ccg aaa ctg 1295
Asn Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu
340 345 350
gag gtg ctg aaa gaa atc ctg cag aag cag ttc aag ggt ccc aag agc 1343
Glu Val Leu Lys Glu Ile Leu Gln Lys Gln Phe Lys Gly Pro Lys Ser
355 360 365
ccc cgg ggc atc atc ttc acc cga acc cgc cag agc gct cac tcc ctc 1391
Pro Arg Gly Ile Ile Phe Thr Arg Thr Arg Gln Ser Ala His Ser Leu
370 375 380
ctg ctg tgg ctc cag cag cag ccg agc ctg cag act gtg gac atc agg 1439
Leu Leu Trp Leu Gln Gln Gln Pro Ser Leu Gln Thr Val Asp Ile Arg
385 390 395
gcc cag ctg ttg att ggg gct ggg aac agc agc cag agc acc ccg atg 1487
Ala Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met
400 405 410 415
acc cag atg acc cag agg gac cag caa gaa gtg atc cag aag ttc cgg 1535
Thr Gln Met Thr Gln Arg Asp Gln Gln Glu Val Ile Gln Lys Phe Arg
420 425 430
act ggt gcc ttg aac ctc ctg gtg gcc acg agc gtg gca gag gag ggg 1583
Thr Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly
435 440 445
ctg gac atc ccc cag tgc aac gtg gtg gtg cgctat ggg ctc ctg acc 1631
Leu Asp Ile Pro Gln Cys Asn Val Val Val Arg Tyr Gly Leu Leu Thr
450455 460
aat gag atctcc atg gtc cag gca agg ggc cgg gcc cgg gcc agt caa 1679
Asn Glu Ile Ser MetVal Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln
465 470 475
agc gta tac tcg ttt gtg gca gcc caa ggc agc cgg gag ctg cgg cgg 1727
Ser Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg
480 485 490 495
gag cag acc aat gag gcg ctg gag agt ctg atg gaa cag gcg gtg gct 1775
Glu Gln Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ser Leu Met Glu Gln Ala Val Ala
500 505 510
gct gtg cag gcg atg gac cag gcc gag tac cag gcc aag atc cag gag 1823
Ala Val Gln Ala Met Asp Gln Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ile Gln Glu
515 520 525
ctg cag cgg gca gcc ttg gtt aag cgg gca gcc cgg gca gcc cag cag 187l
Leu Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln
530 535 540
aag agt cgg cag cag aag ttc ctg gca gag caa gtg cag ctc ctg tgc 1919
Lys Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys
545 550 555
atc aac tgc atg gtg gcc atg ggc tac ggg agt gac ctg cgg aag gtg 1967
Ile Asn Cys Met Val Ala Met Gly Tyr Gly Ser Asp Leu Arg Lys Val
560 565 570 575
gag agt gcc cac cat gtc aac gtg aac ccc aac ttc aag atc tac tac 2015
Glu Ser Ala His His Val Asn Val Asn Pro Asn Phe Lys Ile Tyr Tyr
580 585 590
aac gtc tcc cag gag cct gtg gtc att gac aga gtc ttc aag gac tgg 2063
Asn Val Ser Gln Glu Pro Val Val Ile Asp Arg Val Phe Lys Asp Trp
595 600 605
agg ccc ggg ggt gtc att cgc tgc agg aac tgt ggg gag agc tgg ggc 2111
Arg Pro Gly Gly Val Ile Arg Cys Arg Asn Cys Gly Glu Ser Trp Gly
610 615 620
atg cag ata atc tac aag tcc gtg aag ctg cca gtg ctc aaa gtc cgc 2159
Met Gln Ile Ile Tyr Lys Ser Val Lys Leu Pro Val Leu Lys Val Arg
625 630 635
agt gtg ctt ctg gag acg ccc aac ggg cgg atc cag gtc aag aaa tgg 2207
Ser Val Leu Leu Glu Thr Pro Asn Gly Arg Ile Gln Val Lys Lys Trp
640 645 650 655
tcctgc gtg ccc ttc ccg gtg cct gac ttc gat tac acg cag tat tgc2255
Ser Cys Val Pro Phe Pro Val Pro Asp Phe Asp Tyr Thr Gln Tyr Cys
660 665 670
acc gag agc ctg acc gac ctc tcc ctg gactga ccgccttgtc cctgcagtgc 2308
Thr Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp
675 680
ccggctcagc ctgcaggggg cgggagactc cgcggccgcc acctgggtcc agcccggtct 2368
cctgagctgg agtctgcgcg ctgaccagct acggaggaac cccaggcccc caggctggct 2428
tacacactga gaaagtagcc aaagagccat ggctggtccc cagccccccctcacatgtac 2488
gcagcttcat atggaccggc tggagaaccg ggacacggtg ccaggaatca ccaggttcct 2548
gtggcctcga cattcctttc ctgcca 2574
<210> 2
<211> 681
<212> PRT
<213> 豬(Sus scrofa)
<400> 2
Met Glu Leu Arg Pro Tyr Gln Trp Glu Val Ile Met Pro Ala Leu Glu
1 510 15
Gly Arg Asn Ile Ile Ile Trp Leu Pro Thr Gly Ala Gly Lys Thr Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly Ala
35 40 45
Lys Val Val Val Leu Val Asn Arg Val His Leu Val Thr Gln His Cys
5055 60
Glu Glu Phe Ser Arg Met Leu Asp Arg Arg Trp Ala Ile Thr Thr Leu
65 70 75 80
Ser Gly Asp Met Gly Pro Arg Ala Gly Phe Gly His Leu Ala Arg Ser
85 90 95
His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ala Leu Thr
100 105 110
Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu Leu
115 120 125
Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn Ile
130 135 140
Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Thr Lys Pro Leu
145 150 155 160
Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala Ser
165 170 175
Thr Leu Asp Gly Ala Ile Asp His Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asn Leu
180 185 190
Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gln
195 200 205
Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln Arg
210 215 220
Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys Ile
225 230 235 240
His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr Gln
245 250 255
Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu Ala
260 265 270
Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr Asn
275 280 285
Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu Ala
290 295 300
Thr Leu Arg Asp Phe His Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln Ile
305 310 315 320
Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys Asn
325 330 335
Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu Glu
340 345 350
Val Leu Lys Glu Ile Leu Gln Lys Gln Phe Lys Gly Pro Lys Ser Pro
355 360 365
Arg Gly Ile Ile Phe Thr Arg Thr Arg Gln Ser Ala His Ser Leu Leu
370 375 380
Leu Trp Leu Gln Gln Gln Pro Ser Leu Gln Thr Val Asp Ile Arg Ala
385 390 395 400
Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met Thr
405 410 415
Gln Met Thr Gln Arg Asp Gln Gln Glu Val Ile Gln Lys Phe Arg Thr
420 425 430
Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly Leu
435 440 445
Asp Ile Pro Gln Cys Asn Val Val Val Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Asn
450 455 460
Glu Ile Ser Met Val Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln Ser
465 470 475 480
Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg Glu
485 490 495
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500 505 510
Val Gln Ala Met Asp Gln Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ile Gln Glu Leu
515520 525
Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln Lys
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Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys Ile
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580 585 590
Val Ser Gln Glu Pro Val Val Ile Asp Arg Val Phe Lys Asp Trp Arg
595 600 605
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610 615 620
Gln Ile Ile Tyr Lys Ser Val Lys Leu Pro Val Leu Lys Val Arg Ser
625 630 635640
Val Leu Leu Glu Thr Pro Asn Gly Arg Ile Gln Val Lys Lys Trp Ser
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Cys Val Pro Phe Pro Val Pro Asp Phe Asp Tyr Thr Gln Tyr Cys Thr
660 665 670
Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp
675 680
<210>3
<211>334
<212>DNA
<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(334)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(315)..(334)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(126)..(126)
<223>
<400>3
tccggactgg tgccttgaac ctcctggtgg ccacgagcgt ggcagaggag gggctggaca 60
tcccccagtg caacgtggtg gtgcgctatg ggctcctgac caatgagatc tccatggtcc 120
aggtarccga agcatccctc cccaaaacag ccctcaaagg atgctgggtg gaccccagcc 180
ccaccactca cccctctgtt ttctccttcc ccaggcaagg ggccgggccc gggccagtca 240
aagcgtatac tcgtttgtgg cagcccaagg cagccgggag ctgcggcggg agcagaccaa 300
tgaggcgctg gagagtctga tggaacaggc ggtg 33權(quán)利要求
1、一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所述。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段，其特征在于在其126bp處有一個(gè)G126-C126的堿基突變，導(dǎo)致KpnI-RFLP多態(tài)性。
3、檢測(cè)權(quán)利要求2所述的一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段突變的引物對(duì)，所述的引物對(duì)的正向引物為5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物為5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’。
4、制備如權(quán)利要求2所述的與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段的方法，按照以下步驟
(1)用人LGP2基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；提取豬脾臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計(jì)引物對(duì)，其中所述引物對(duì)的正向引物為5’-CCTTTCTGTCTGCCCTGCTTC-3’，反向引物為5’-TGGCAGGAAAGGAATGTCG-3’，用RT—PCR方法擴(kuò)增豬LGP2基因的cDNA片段，PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序，通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO1所述的序列；
(2)根據(jù)SEQ ID NO1所述的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述的引物對(duì)的正向引物為5’-TCCGGACTGGTGCCTTGAAC-3’，反向引物為5’-CACCGCCTGTTCCATCAGAC-3’擴(kuò)增豬基因組DNA；將PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序、通過序列分析獲得如序列表SEQ ID NO2所述的序列。
5、權(quán)利要求2所述的所述的一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段在豬分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
6、權(quán)利要求3所述的一種與豬免疫性狀相關(guān)的LGP2基因DNA片段的引物對(duì)在豬分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜基因工程分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用的與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由豬LGP2基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。序列表SEQ ID NO2所示序列的第126位堿基處有一個(gè)G126-C126的堿基突變，導(dǎo)致RFLP-Kpn I多態(tài)性。本發(fā)明還公開了獲得上述分子標(biāo)記的制備方法和多態(tài)性檢測(cè)方法的應(yīng)用，為豬的標(biāo)記輔助選擇的關(guān)聯(lián)分析提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101392254SQ20081019721
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者趙書紅, 李新云, 韓春梅, 朱猛進(jìn), 李長春 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)