專利名稱：高強(qiáng)度蛛絲蛋白的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生編碼蛛絲蛋白質(zhì)的DNA片段的新方法。本發(fā)明還涉及編碼蛛絲蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用上述DNA序列生產(chǎn)蛛絲蛋白質(zhì)的新方法。本發(fā)明還涉及純化這些蛛絲蛋白質(zhì)和用它們制造纖維和薄膜的方法。
通過本發(fā)明所開發(fā)的克隆生產(chǎn)商業(yè)用量的高分子量蛛絲蛋白質(zhì)，其分子量范圍從90,000到250,000以上，其分子量是從Nephilaclavipes所獲得的天然主要ampulate(拖絲)蛛絲蛋白的40％到100％以上。由于從這些高分子量蛋白質(zhì)制造的絲具有優(yōu)越的物理特性，如高抗張強(qiáng)度和很大的彈性，本發(fā)明所克隆的絲蛋白質(zhì)有可觀的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
已通過本發(fā)明的幾種方法克隆了這些蛛絲蛋白質(zhì)并已在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生這些天然序列的蛛絲克隆。然后已將這些表達(dá)系統(tǒng)用于生產(chǎn)各種部分或完整長(zhǎng)度的天然蛛絲蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)已經(jīng)以每升細(xì)胞量超過2克的水平表達(dá)。然后純化這些蛛絲蛋白質(zhì)并用于許多目的如精紡纖維，形成膜以及絲織有關(guān)的其他應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，絲是由許多目的動(dòng)物產(chǎn)生的(例如，昆蟲，蜘蛛和蛆)。例如蜘蛛產(chǎn)生天然的高抗張強(qiáng)度的網(wǎng)和拖絲。另一方面，蠶雖然以高產(chǎn)率產(chǎn)生絲卻具有被認(rèn)為物理性質(zhì)不如蛛絲蛋白質(zhì)的絲蛋白質(zhì)。例如蠶絲蛋白質(zhì)具有的抗張強(qiáng)度遠(yuǎn)低于蛛絲蛋白質(zhì)的抗張強(qiáng)度。球形織工(Orb weaver)和其他蜘蛛雖然自然產(chǎn)生少量的絲線(經(jīng)濟(jì)上不足以商業(yè)化)，卻是強(qiáng)的絲線。事實(shí)上，蛛絲可比Kevlar的絲強(qiáng)數(shù)倍(9.5×104/3×104Jkg-1)。這些優(yōu)越的強(qiáng)度特性使蛛絲蛋白絲線成為降落傘，帆，防護(hù)服和需要強(qiáng)力絲線的其他應(yīng)用的優(yōu)先選擇。此外，這些蛛絲用做許多重金屬和包括生物學(xué)武器在內(nèi)的有機(jī)物的吸收膜。它們還有作為選擇性結(jié)合DNA的吸收劑和作為許多其他化學(xué)物質(zhì)，調(diào)料和香料的吸收劑的用途。
雖然可設(shè)想從培養(yǎng)蜘蛛可生產(chǎn)蛛絲，但幾個(gè)方面的原由都說明這是行不通的。首先，除很難養(yǎng)育之外，在生長(zhǎng)密度很高時(shí)蜘蛛會(huì)吃掉它們的近鄰。其次，蜘蛛僅產(chǎn)生少量絲蛋白使得即使微克量的生產(chǎn)也驚人的昂貴。由于這些限制，生產(chǎn)商業(yè)用量的蛛絲蛋白質(zhì)的唯一可行方法是將該蜘蛛基因克隆到一個(gè)可用來大規(guī)模生產(chǎn)的載體中。本發(fā)明達(dá)到了這個(gè)目的。
先前通過制造短的堿基對(duì)片段然后使用大量重復(fù)單位的方法已生產(chǎn)出合成的絲蛋白基因。已通過此方法得到有中等分子量的蛋白質(zhì)(范圍在20,000到80,000)。為達(dá)到各種物理性質(zhì)，對(duì)這個(gè)方法做了改變并已生產(chǎn)出不同序列的合成蛋白質(zhì)。例如，以前的工人已經(jīng)使用通過用短的天然絲蛋白質(zhì)并改變其序列而得到的序列。
然而這些先前使用的方法產(chǎn)生的材料次于天然絲。而且，在某些情況下，這種先前的技術(shù)還產(chǎn)生了不適合長(zhǎng)期使用的克隆，而長(zhǎng)期使用是商業(yè)應(yīng)用所需要的。因此，本發(fā)明的目的之一是克服聚合短DNA序列所發(fā)生的上述問題。本發(fā)明通過產(chǎn)生編碼高強(qiáng)度，高分子量絲蛋白質(zhì)的長(zhǎng)DNA而達(dá)到了這個(gè)目的。
由于高強(qiáng)度大的ampulate(拖絲)蜘蛛絲有這種潛力，已經(jīng)研究了球形織工如Nephila clavipes的絲以期了解其強(qiáng)度的分子基礎(chǔ)。研究人員還試圖通過嵌入與蛛絲纖維高強(qiáng)度相關(guān)的重復(fù)元件，用有限的成功來克隆該天然蛋白或制造合成絲基因。
然而，伴隨克隆絲蛋白有許多問題。首先，天然氨基酸序列由許多重復(fù)亞單位組成，因此沒有許多可用于克隆該天然基因的單一位點(diǎn)。文獻(xiàn)表明Nephila clavipes的拖絲蛛絲蛋白羧基端是顯示出單一性的唯一區(qū)域。這導(dǎo)致了僅有少數(shù)克隆該天然基因的在先嘗試，結(jié)果更多是制造合成蛋白的在先嘗試。然而，由于被模擬的DNA序列的重復(fù)性，制做穩(wěn)定的克隆及其產(chǎn)生的合成蛛絲蛋白質(zhì)存在許多問題，例如有大量重復(fù)(特別是GCA重復(fù))的DNA是不穩(wěn)定的，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄錯(cuò)誤和高幾率重組缺失導(dǎo)致DNA經(jīng)常改變。由于這些問題，許多克隆的完整性便成為疑問。
在自然界，絲基因是十分穩(wěn)定的，因?yàn)橹貜?fù)和非重復(fù)區(qū)是混雜的。不幸的是，合成的基因沒有將這種結(jié)構(gòu)借給自身重組，特別是重組缺失的高度不穩(wěn)定的。它們是因?yàn)闆]有足夠量的基因被克隆而無法得到穩(wěn)定的克隆，因此沒有得到可構(gòu)成其天然穩(wěn)定性基礎(chǔ)的非重復(fù)區(qū)。因此，獲得有非重復(fù)及重復(fù)區(qū)的穩(wěn)定克隆即是本發(fā)明的目的之一。
克隆拖絲蛛絲的另一個(gè)問題是該基因的大小。蛛絲蛋白質(zhì)一般是200,000kDa或更高并且相應(yīng)的基因還至少有一個(gè)內(nèi)含子。這樣，設(shè)想DNA片段的大小將是界于5-10Kb范圍再加上任何內(nèi)含子。用目前技術(shù)，這么大的基因仍是十分難于克隆的。本發(fā)明克服了這個(gè)困難。
由于其機(jī)械強(qiáng)度性質(zhì)，大部分注意力被放在克隆蛛絲蛋白質(zhì)方面。在了解Nephila clavipes拖絲絲方面的一個(gè)主要進(jìn)展是由Xu等取得的(Proc.Natl.Acad.Sci.877120，1990)。Xu等確定了來自一個(gè)部分克隆的蜘蛛拖絲絲的重復(fù)序列的一部分。雖然這個(gè)重復(fù)單位編碼達(dá)34個(gè)氨基酸，它不是完全保守的，因?yàn)樵谀承┲貜?fù)中該序列有缺失和改變。
然而，Xu等人發(fā)現(xiàn)在該序列中有兩個(gè)重要區(qū)域--賦予蛛絲某些重復(fù)區(qū)性質(zhì)的重復(fù)區(qū)和一個(gè)非重復(fù)(羧基端)區(qū)。Hinan和Lewis(J.Biol.Chem.26719320，1992)報(bào)道了一個(gè)第二cDNA克隆，它被推測(cè)是來自第二蜘蛛蛋白。該序列有一個(gè)類似于Xu等人發(fā)現(xiàn)的重復(fù)區(qū)和一個(gè)羧基末端的非重復(fù)末端。Hinan和Lewis重復(fù)單位較長(zhǎng)，它編碼51個(gè)氨基酸并是高度可變的。
在由Lewis等人于1991年10月23日在歐洲專利申請(qǐng)EP0452925A2，發(fā)表的蛛絲蛋白質(zhì)的表達(dá)中，只有小蛋白質(zhì)片段以低產(chǎn)量被明顯產(chǎn)生。這些小蛋白質(zhì)片段可能不具有商業(yè)價(jià)值因?yàn)榱己玫臋C(jī)械性質(zhì)僅來自于大蛋白質(zhì)，特別是接近全長(zhǎng)的大蛋白質(zhì)。Lombardi等于1991年10月31日發(fā)表的國(guó)際專利申請(qǐng) WO91/16351還以十分低的產(chǎn)量生產(chǎn)出重組蛛絲蛋白，但由于其小分子量這些克隆表現(xiàn)出低機(jī)械強(qiáng)度。
還推測(cè)因此而開發(fā)的蛛絲克隆不代表天然基因的真實(shí)拷貝。這一點(diǎn)通過許多研究得到證實(shí)例如Beckwith & Arcidiancono(J.Biol.Chem.269(9)6661，1994)表明兩種蜘蛛蛋白質(zhì)有高同源性并且事實(shí)上可能代表相同的蛋白質(zhì)。
雖然許多研究者已承認(rèn)天然表達(dá)系統(tǒng)作為絲變異體是有用的。這些系統(tǒng)不能解決密碼子偏愛方面的難題。如果認(rèn)為使用高保守重復(fù)區(qū)可產(chǎn)生改進(jìn)的蛋白質(zhì)，這些合成的基因表達(dá)系統(tǒng)遇到DNA穩(wěn)定性問題，低的表達(dá)速率和生成的蛋白質(zhì)性質(zhì)不如天然蛛絲的性質(zhì)稱心的麻煩。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是解決這些問題。
Ferrari等在1988年5月19日發(fā)表的國(guó)際專利申請(qǐng)WO88/03553公開了合成的基因，這類基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有絲-樣性質(zhì)。此外，一些擬天然纖維蛋白質(zhì)的短的重復(fù)序列蛋白質(zhì)由Cappello等開發(fā)出來，它們被發(fā)表在1990年5月17日國(guó)際專利申請(qǐng)WO90/05177。Floyd(國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/29450，1994年12月22日發(fā)表)還試圖用一些Xu等發(fā)現(xiàn)的天然重復(fù)單位開發(fā)一種蛛絲合成基因。然而所有這些克隆具有小的分子量從而使它們不具有所期望的天然蛛絲的性質(zhì)。
本發(fā)明涉及部分和全長(zhǎng)的蛛絲蛋白克隆的新合成。某些部分長(zhǎng)度克隆還被聚合成分子量達(dá)到和超過天然蛛絲分子量的其他克隆。本發(fā)明已使開發(fā)具有全范圍性質(zhì)的天然絲樣克隆成為可能。熟悉分子生物學(xué)的人員可使用這些克隆作為創(chuàng)建其他有用的絲性質(zhì)，如強(qiáng)度，流動(dòng)點(diǎn)，黏度和彈性的克隆的起點(diǎn)。而且，這些新序列可被用做設(shè)計(jì)其他合成基因的起點(diǎn)。因?yàn)槟承┲┲雽㈩伾蛏亟Y(jié)合到其絲蛋白質(zhì)中，這些方法還可容許天然著色的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染的宿主在培養(yǎng)基中發(fā)酵的獨(dú)特化學(xué)方法。通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)絲蛋白質(zhì)的主要難題之一是蛋白質(zhì)被蛋白酶部分降解。事實(shí)上，由蛋白酶產(chǎn)生的蛋白質(zhì)降解速率在某些情況下可大于高分子量絲蛋白表達(dá)的速率，由此使商業(yè)操作成為不可實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明克服了這個(gè)潛在難題。
這些以及其他目的和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)從下面描述中被表現(xiàn)出來。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示編碼蛛絲蛋白的2KbDNA序列發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)編碼絲蛋白的DNA片段的方法，其步驟包括(i)選擇從產(chǎn)絲蜘蛛得到的靶DNA，該靶DNA包括多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)；(ii)選擇至少10個(gè)核苷酸的單鏈DNA引物，該引物有一個(gè)與靶DNA中一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的DNA序列；和(iii)將該DNA引物反復(fù)與變性的靶DNA結(jié)合，并將結(jié)合的DNA引物和靶DNA核苷酸及有校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵，以產(chǎn)生DNA片段。其中DNA片段與所述靶DNA互補(bǔ)并至少是2Kb。在更具體的實(shí)施方案中，可產(chǎn)生至少5Kb的DNA片段。
在上述產(chǎn)生編碼絲蛋白的DNA片段之方法的進(jìn)一步實(shí)施方案中，該方法包括使用兩個(gè)不同的DNA引物代替一個(gè)引物的步驟。在仍是用一個(gè)單鏈DNA引物或兩個(gè)不同的DNA引物產(chǎn)生DNA片段的該方法之進(jìn)一步實(shí)施方案中，該靶DNA是通過反轉(zhuǎn)錄編碼蛛絲的全長(zhǎng)mRNA制得的cDNA，并且該方法進(jìn)一步包括步驟(i)在該方法所制得的第一鏈cDNA的氨基末端加入一個(gè)引物位點(diǎn)和(ii)用該cDNA的多聚T區(qū)作為第一聚合酶引發(fā)區(qū)。仍是在這些生產(chǎn)DNA片段的方法的進(jìn)一步實(shí)施方案中，用聯(lián)接盒在該DNA的未知末端創(chuàng)建第二引物位點(diǎn)。仍是在進(jìn)一步實(shí)施方案中，用末端轉(zhuǎn)移酶在該DNA的未知末端創(chuàng)建第二引物位點(diǎn)以產(chǎn)生一個(gè)選自包括多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位點(diǎn)。
產(chǎn)生DNA片段的上述方法所用DNA引物可選自由起始和終止序列(i)-(xx)所代表的DNA給出如下GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGCNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN，
其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
產(chǎn)生DNA片段的該方法的另一實(shí)施方案中，通過與至少含上述序列(i)-(xx)之一的DNA探針雜交選擇該靶DNA，該探針被可逆結(jié)合到一個(gè)支持物上以富集編碼絲的DNA片段。
在產(chǎn)生編碼絲蛋白DNA片段的另一方法實(shí)施方案即被稱作聚合方法中，該方法包括步驟(i)選擇一個(gè)編碼從產(chǎn)絲蜘蛛獲得的絲蛋白的靶DNA，該靶DNA包括多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)；(ii)選擇第一對(duì)不同的DNA引物，兩引物與該靶DNA中的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)，并且第一對(duì)引物中至少有一個(gè)由序列(i)-(xxvi)所代表；(iii)通過第一對(duì)DNA引物與變性靶DNA的重復(fù)結(jié)合并將結(jié)合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵以產(chǎn)生第一DNA片段，該第一DNA片段與靶DNA互補(bǔ)并至少是2Kb。此聚合方法進(jìn)一步包括步驟(iv)選擇第二對(duì)不同的DNA引物，該第二對(duì)DNA引物與第一對(duì)DNA引物的兩個(gè)序列相比至少有一個(gè)是不同的，并且第二對(duì)DNA引物中至少有一個(gè)由序列(i)-(xxvi)所代表；(v)通過第二對(duì)DNA引物與變性靶DNA重復(fù)結(jié)合并將該結(jié)合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和校讀能力的DNA聚合酶一起溫孵來生產(chǎn)第DNA片段，與第一DNA片段相比第二DNA片段是不同的，并且還與靶DNA互補(bǔ)，該第DNA片段至少是2Kb；(vi)限制性酶解第一和第二DNA片段；并(vii)將第一和第二DNA片段的限制酶解部分重組到被聚合的DNA中，該聚合的DNA編碼蛛絲蛋白并至少是4Kb長(zhǎng)。
在上述聚合方法的更具體的實(shí)施方案中，全部引物都由序列(i)-(xxvi)所代表。在另一具體聚合方法實(shí)施方案中，全部引物都是不同的。在仍是一個(gè)更具體的聚合方法實(shí)施方案中，聚合的DNA至少是6Kb到8Kb長(zhǎng)。
在DNA序列實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼蛛絲蛋白的一個(gè)DNA序列，其中該DNA序列包括多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)并有至少2Kb長(zhǎng)。在更具體的實(shí)施方案中，該DNA序列有至少5Kb長(zhǎng)。在仍是本發(fā)明的一個(gè)更具體的DNA序列實(shí)施方案中，該DNA包括如圖1描述的序列。
在產(chǎn)生絲蛋白方法的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括步驟(i)選擇一個(gè)DNA；(ii)將該DNA插入一個(gè)表達(dá)載體；(iii)用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(iv)在培養(yǎng)基中發(fā)酵被轉(zhuǎn)染的宿主以生產(chǎn)絲蛋白；和(v)回收絲蛋白。在更具體的絲蛋白生產(chǎn)方法實(shí)施方案中，用于發(fā)酵被轉(zhuǎn)染的宿主的培養(yǎng)基含有蛋白酶抑制劑。在一個(gè)更進(jìn)一步絲蛋白生產(chǎn)方法的實(shí)施方案中，該方法包括步驟(i)用超聲能量破壞宿主細(xì)胞；(ii)用超聲能量重懸浮絲蛋白；和(iii)離心破碎的宿主細(xì)胞以使細(xì)胞膜與絲蛋白分開。在這些絲蛋白生產(chǎn)方法中，絲蛋白的純化通過超濾或乙醇沉淀來完成。
精紡絲蛋白所用的方法實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法包括步驟(i)濃縮由超濾或乙醇沉淀純化的絲蛋白；(ii)將濃縮的絲蛋白拉成纖維；(iii)精紡絲纖維以生產(chǎn)絲線；和(iv)洗絲線以除去任何增溶劑試劑。增溶劑選自六氟異丙醇，氫氧化鈉，氫氧化鉀，尿素，尿素磷酸酯，鋰鹽，有機(jī)溶劑，鹽酸胍，硫酸銨，醋酸，磷酸，二氯醋酸，甲酸和硫酸。精紡絲還有一種更具體的方法，該方法進(jìn)一步包括用錫或鈦的氧化物包被絲纖維或絲線的步驟。
在纖維實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含根據(jù)本發(fā)明的任何方法制造的蛛絲線的一種纖維。在進(jìn)一步的纖維實(shí)施方案中，該纖維包括根據(jù)本發(fā)明的任何方法結(jié)合Kelvlar，石墨或碳纖維，以及蠶絲制成的蛛絲線。
該蛋白可被用做涂層，擠壓成纖維或制成聚合膜。
發(fā)明詳述產(chǎn)絲蜘蛛DNA來源在本發(fā)明的方法被專門開發(fā)以克隆Nephila clavipes大的ampulate(拖絲)蛛絲?？寺『蜕a(chǎn)絲蛋白質(zhì)的方法可用于所有的產(chǎn)絲蜘蛛。
作為群體，蜘蛛的絲分泌腺可達(dá)8種。雖然沒有一個(gè)蜘蛛的種有全部8種絲分泌腺，所有的蜘蛛至少有3種絲分泌腺并且多數(shù)蜘蛛有5種分泌腺。每種分泌腺產(chǎn)生不同類型的絲，它們具有不同的性質(zhì)。例如，某些絲干燥得快，而其他的絲保持粘性。
蜘蛛歸屬于節(jié)肢動(dòng)物門，蜘蛛綱和蜘蛛目。真正的蜘蛛歸于Labidognatha亞目。其他蜘蛛類型包括梳足(comb footed)，蟹形(crab)，捕魚者(fisher)，漏斗網(wǎng)(funnel web)，麻梳斑(hackled-band)，球形織工(orbweavers)，跳蛛(jumping)和魔面枝(ogre faced stick)。來自下面任何屬的蜘蛛可按照本發(fā)明被使用Micrathena，Mastophora，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha。
球形織工是其中結(jié)果最好的的蜘蛛群，因?yàn)樗鼈兺鲁龅慕z有很高的強(qiáng)度和柔韌性。球形織工被稱為Argiopidae并包括箭頭型Micrathena sagittata，流星錘蜘蛛Mastophora sornigera，迷宮Metepeira labysrinthea，石斑Araneus marmoreus，黑黃花園Argiope bruennichi，金絲Nephila clavipes，和棘身Gasteracantha cancriformis。
因?yàn)镹ephila clavipes的絲線結(jié)實(shí)并且其絲分泌腺大而易于切割，已對(duì)Nephila clavipes進(jìn)行了最多的遺傳研究。其他的球形織工也產(chǎn)生結(jié)實(shí)的絲線。
雖然所有的蜘蛛都產(chǎn)絲，形成絲線的蛋白質(zhì)的分子組成變化很大并有不同的用途。例如，Antrodiatus蜘蛛吐出只含兩種蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單類型的絲。相反，被稱為網(wǎng)織者的Araneoidea科蜘蛛產(chǎn)生達(dá)8種不同類型的絲。球形織工用數(shù)種蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種絲以生成較大強(qiáng)度和柔韌性的網(wǎng)。
蛛絲蛋白質(zhì)還有不同的質(zhì)量，取決于其是由那一種絲分泌腺分泌出。已知最強(qiáng)的絲來自球形織工的大的ampulate分泌腺。在球形織工產(chǎn)生的8種絲中，大的ampulate(拖絲)絲由于其物理強(qiáng)度和非粘性質(zhì)而被選擇用于這個(gè)研究。雖然碳水化合物與該纖維有關(guān)，這種拖絲絲由蛋白質(zhì)組成。在蜘蛛的吐絲器中，液體絲經(jīng)過不可逆轉(zhuǎn)變成為含高相對(duì)比例的丙氨酸和甘氨酸的不溶性形式。這種纖維包含一個(gè)具有靈活界面的反平行β折疊。這種絲的氨基酸組成(在下表中顯示)模擬本發(fā)明的克隆的氨基酸組成。
Nephila clavipes大的ampulate蛛絲的氨基酸組成百分比氨基酸 蛋白質(zhì) 220Kd帶 190kD帶谷氨酸8.52 9.77 9.35絲氨酸3.51 2.57 2.79甘氨酸 41.6645.8844.80精氨酸1.28 1.98 2.28丙氨酸 25.2528.5728.35脯氨酸0.78 0.37 0.51酪氨酸4.20 3.25 3.26亮氨酸4.82 4.62 4.48
絲聚合物，ACS，論文集，絲氨酸，544，1994。
克隆兩個(gè)引物PCR的克隆雖然許多研究試圖用PCR技術(shù)克隆重復(fù)的絲基因，至少已出現(xiàn)兩個(gè)問題。這些PCR技術(shù)對(duì)長(zhǎng)度為8-15Kb的基因不能以良好的忠實(shí)性轉(zhuǎn)錄DNA。事實(shí)上，在這類文獻(xiàn)中所報(bào)道的大多數(shù)克隆轉(zhuǎn)錄都有轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤。因此，本發(fā)明開始克服這些缺點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)通過使用某種程度的簡(jiǎn)并引物可產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)PCR產(chǎn)物。
使用了來自Nephila clavipes腹部的基因組DNA。為從蜘蛛分離該DNA，嚴(yán)格遵循了Sambrook等的分子克隆一實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1989)中描述的制備方法。這個(gè)方法產(chǎn)生超過2Kb的高分子量基因組DNA。
發(fā)明者用許多與Xu等人公開的序列數(shù)據(jù)相關(guān)的引物做了實(shí)驗(yàn)。所用的某些引物在上文作為序列(i)-(xx)公開。雖然Bechwith &Arcidiacono也試用了這些引物，本發(fā)明者是用雙引物PCR克隆系統(tǒng)產(chǎn)生達(dá)2Kb長(zhǎng)度的蛛絲蛋白之第一人。本發(fā)明者還能用被要求專利保護(hù)的cDNA和下述單位點(diǎn)克隆方法生產(chǎn)較高Kb的蛛絲蛋白質(zhì)。
使用從如Xu等人和Hinman和Lewis定義的spidrin 1得到的引物生成PCR克隆的初始條件。用有Taq聚合酶(Stratagene產(chǎn)品號(hào)600131，許可證來自Perkin Elmer，Stratagen，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA)的常規(guī)PCR，發(fā)明者僅能得到達(dá)700-1000bp的PCR產(chǎn)物。這證實(shí)了其它人的發(fā)現(xiàn)。甚至這些小片段也被認(rèn)為是質(zhì)量上可疑的。用Taq延伸因子(Stratagene產(chǎn)品號(hào)600148)，得到一些達(dá)1900左右的帶如實(shí)施例1所示。然而，當(dāng)使用另一種有校讀作用的聚合酶時(shí)(Takara Taq LA)，僅得到一條主要的帶如下面實(shí)施例2中所描述的。
實(shí)施例1用Taq聚合酶克隆在本實(shí)施例中，通過Beckwith&Arcidiacono的方法分離的Nephila clavipes DNA被與下面兩引物一起使用引物(i)GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT，和(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(i)編碼基于正向閱讀框的聚丙氨酸重復(fù)序列。將框內(nèi)起始密碼和BamH1和EcoR I前導(dǎo)限制性位點(diǎn)插入作為懸垂以便于克隆的前導(dǎo)序列還被插入到引物中。引物(ii)是基于Xu等的反向序列的PCR引物(bp2218到2242)。這個(gè)序列還有一個(gè)框內(nèi)終止密碼子和一個(gè)EcoR I限制位點(diǎn)。如本實(shí)施例和實(shí)施例2中所示，結(jié)果取決于PCR條件并且在無更新的聚合酶時(shí)是非陽(yáng)性的。常規(guī)的Taq和Taq的延伸因子產(chǎn)生的結(jié)果不同，推測(cè)是由于錯(cuò)讀或假引發(fā)的結(jié)果。
PCR混合液如下5微升Taq延伸因子緩沖液(Stratagene)；1微升Taq聚合酶5微克/微升(Stratagene)；1微升的1微克/微升DNA模板(蜘蛛基因組DNA)；1微升的2微摩爾引物(i)于水中；1微升的2微摩爾引物(ii)于水中；5微升NTP’s(各2微摩爾的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，pH7.0)；45微升的Taq延伸因子(Stratagene)；和水到總體積100微升。
PCR循環(huán)條件如下94℃放置2分鐘；和PCR條件(30循環(huán))60℃退火1分鐘；和94℃變性1分鐘?；蛘撸?0℃退火1分鐘和72℃延伸2分鐘的PCR條件可用72℃處理2分鐘代替。
取5微升一份該反應(yīng)混合物用1％瓊脂糖電泳顯示DNA帶進(jìn)行分析。用此技術(shù)，達(dá)到7條DNA帶，它們被推測(cè)為代表該序列中的一些丙氨酸重復(fù)區(qū)。最大的DNA片段是1900-2000bp(并被認(rèn)為是2Kb片段)。這基本上與實(shí)施例2中得到的是同樣的帶。用Gene CapsuleTM(貨號(hào)786-001自Gene Technology Inc.，3830 Washington Blvd.，St.Louis，MO63108)從膠中切下帶，用酚和乙醇沉淀。用下面實(shí)施例中描述的方法將這些帶克隆到E.coliXL1 MRF’超感受態(tài)細(xì)胞。在用引物(ii)和(iii)使用實(shí)施例2中描述的Takara Ex Taq LA聚合酶PCR條件時(shí)也發(fā)現(xiàn)了2Kb片段。
實(shí)施例2用Takara Taq LA聚合酶克隆用研缽和研杵研磨蜘蛛腹部分離基因組DNA并按照Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1989)的方法提取。
本實(shí)施例的克隆用下列引物完成引物(iii)GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC，和引物(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(iii)從Mello等，絲聚合物，ACS，論文集，Ser 544(1994)描述的肽序列4制得。引物(ii)如上述實(shí)施例1的描述制得。
使用下述PCR混合液和條件。PCR混合液5微升10X Takara LAPCR緩沖液；5微升Takara dNTP混合液；1微升引物(iii)(2微摩爾)；1微升引物(ii)(2微摩爾)；1微升校讀活性的TakaraEx Taq；1微升蜘蛛基因組DNA；水到總體積50微升；和50微升的礦物油。Takara LA PCR緩沖液，dNTP混合液，和Takara Ex Taq由Panvera公司565Science Dr.，Madison，WI 53711分銷的Takara Roll試劑盒提供。PCR循環(huán)條件如下初始放置94℃1分鐘；PCR條件(30循環(huán))68℃1分鐘退火和延長(zhǎng)；并4℃下后放置。
為插入該2Kb片段到E.coli中，選用熟悉的載體pUC18，因?yàn)樵撡|(zhì)粒有數(shù)個(gè)克隆位點(diǎn)并能表達(dá)好蛋白質(zhì)。還知道該載體適合于用熟知的引物進(jìn)行序列分析。為插入該2Kb片段到E.coli XL1 MRF’中，pUC18首先在從Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178-9916獲得的1微克/微升DNA制備液中制備。限制酶也類似的被使用以消化該插入片段。限制酶實(shí)驗(yàn)方案如下5微克或以下的質(zhì)粒或DNA插入片段；5微升的限制酶10X緩沖液；5微升1毫克/毫升乙?；疊SA；5微升限制酶(EcoR I)；水到終體積50微升；并37℃溫孵3小時(shí)。
在酚抽提后還要對(duì)載體處理并用EcoR I限制酶徹底酶解。該載體類似的被小牛腸堿性磷酸酯酶(CIAP)處理。該處理防止載體重連接。
除了限制性實(shí)驗(yàn)方案外，CIAP實(shí)驗(yàn)方案如下10微升CIAP 10X緩沖液含500毫摩爾tris-HCI，pH9.0，10毫摩爾氯化鎂，1毫摩爾氯化鋅和10毫摩爾亞精胺；1單位CIAP；水到終體積100微升；和37℃溫孵60分鐘。在37℃，一CIAP單位每分鐘將水解6.0毫摩爾的對(duì)硝基苯磷酸酯。在含1.0毫摩爾氯化鋅，1.0毫摩爾氯化鎂，pH10.4的0.1摩爾甘氨酸緩沖液中測(cè)定這些單位。下一步是連接該插入片段到pUC18中。為達(dá)此目的，用酚提取和乙醇沉淀純化該DNA并然后按下述實(shí)驗(yàn)方案連接。
連接實(shí)驗(yàn)方案100毫微克載體DNA；100毫微克或以下的DNA插入片段；1單位T4DNA連接酶(Weiss Unite)；1微升連接酶10X緩沖液；加水補(bǔ)足終體積10微升；和室溫溫孵1小時(shí)。
然后用Clonetech方法將該新載體插入從Clonetech Laboratories，Inc.，4030 Fabian Way，Palo Alto，CA 94303獲得的E.coli XL1 MRF′中以便進(jìn)入超感受態(tài)細(xì)胞。
通過青霉素抗性在LB肉湯中篩選轉(zhuǎn)化子，10克/升細(xì)菌蛋白胨，5克/升酵母膏，和5克/升氯化鈉，用50微克/微升青霉素。通過首先查看適當(dāng)大小的質(zhì)粒(約4.3Kb)檢查克隆中的適當(dāng)插入片段。還用生物素標(biāo)記的探針和雜交檢測(cè)檢查插入片段。對(duì)轉(zhuǎn)化中的5個(gè)最好的插入檢測(cè)了被插入的蛋白的表達(dá)，因?yàn)樵谶@種方式時(shí)蛋白質(zhì)應(yīng)在pUC18中表達(dá)。
用上述PCR技術(shù)容易生成該2Kb的插入片段。這個(gè)技術(shù)產(chǎn)生的結(jié)果比下面三個(gè)方法都好通過基于肽序列分析的探針篩選絲的鳥槍克隆庫(kù)(Xu等)；來自絲分泌腺的cDNA插入片段(Hinman和Lewis)；和使用Taq聚合酶或其他非校讀聚合酶的PCR(Beckwith和Arcidiacono)。
與上述三個(gè)方法比較，實(shí)施例2的PCR技術(shù)快速，不向序列引入其他報(bào)道的方法明顯引入的錯(cuò)誤。并且只直接對(duì)目的基因。本技術(shù)僅用蛛絲的氨基末端或羧基末端的少量序列就能對(duì)除主要ampulate(拖絲)絲以外的絲或有類似性質(zhì)的其他蜘蛛絲進(jìn)行測(cè)序。
為確定是否蛋白質(zhì)正在E.coli宿主中表達(dá)，開展抗體檢測(cè)以便確定蛛絲蛋白。下面討論這些抗體檢測(cè)。此外，SDS膠表明2Kb的插入片段正在以高產(chǎn)率產(chǎn)生94kDa蛋白。按照Mellow等，Silk Polymerw，ACS，Symposium Ser.544(1994)的方法進(jìn)行凝膠電泳。用LB肉湯，從該細(xì)菌生產(chǎn)的總蛋白質(zhì)產(chǎn)率范圍在0.1-10％。用Bio-Rad Laboratories，3300Regatta Blvd.，Richmond，CA94804，的BioRad試劑盒#170-6460進(jìn)行的Western印記也證實(shí)該蛋白質(zhì)是絲蛋白，并且它是抗體反應(yīng)所顯示的唯一蛋白質(zhì)。
按照正常條件用Promega銀序列分析儀，貨號(hào)Q4130Promega公司，2800Woods Hollow Rdlk Madison，WI 53711-5399，對(duì)此2Kb插入片段以及本發(fā)明者開發(fā)的其他插入片段測(cè)序。用多引物，缺失克隆和基于實(shí)施例1的其他克隆進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。圖1中給出的DNA和蛋白質(zhì)序列對(duì)該序列作了表征。
來自cDNA的克隆許多研究者試圖克隆Nephila clavipes蛛絲卻少有成功因?yàn)榭寺〉叫∑螘r(shí)。從dDNA克隆所牽涉的問題包括不能得到全長(zhǎng)的mRNA，蛋白質(zhì)的反轉(zhuǎn)錄和可靠性都不好。另一主要問題是從絲分泌腺不能得到滿意量的mRNA。本發(fā)明的cDNA技術(shù)(于下面描述)解決了這些難題。
實(shí)施例3A.全長(zhǎng)mRNA的開發(fā)在本克隆技術(shù)成功之前，必須解決獲得全長(zhǎng)mRNA問題。由于在蜘蛛的絲分泌腺中mRNA拷貝數(shù)十分低，就決定用蠶絲Bombyx mori以開發(fā)出從蜘蛛絲分泌腺取得全長(zhǎng)mRNA的類似方法。在嘗試了數(shù)個(gè)分離mRNA方法之后發(fā)現(xiàn)PerSeptive Diagnostics(Cambridge，MA)的mRNA純化試劑盒能始終如一的分離到全長(zhǎng)mRNA而沒有任何可見的降解。此mRNA純化技術(shù)用生物磁珠分離法和寡(dT)20顆粒分離mRNA。
B.長(zhǎng)而精確的PCR技術(shù)的開發(fā)開發(fā)過程的下一步是將mRNA轉(zhuǎn)變成良好的第一鏈模板，然后可靠的復(fù)制DNA。用Invitrogen Cycle mRNA反轉(zhuǎn)錄儀，3985 B SorrentoValley Blvd.，San Diego，CA 92121的Invitrogen公司的cDNA循環(huán)試劑盒L1310-01和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)證明不令人滿意，因?yàn)樯傻囊镏贿m合于擴(kuò)增小片段mRNA。此后，發(fā)明者決定開發(fā)他們自己的技術(shù)以獲得一個(gè)10Kb的mRNA。此方法的第一個(gè)部分是使反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最佳化。通過嘗試各種反轉(zhuǎn)錄酶，包括AMV(Avian Myelobastosis病毒)，反轉(zhuǎn)錄酶(M5101)和被修飾成除去了核酸酶H活性的(M-MLV(MoloneyMurine Lerkemia病毒)反轉(zhuǎn)錄酶(M5301)找出了生成第一鏈的優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄酶。見Tanese & Goff，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.851977(1988)。M5101和M5301均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Road，Nadison，WI 53711。按照Promega指導(dǎo)使用的M-MLV是優(yōu)選的，因?yàn)樗o出最高的可靠性和最長(zhǎng)的產(chǎn)物長(zhǎng)度。因此推薦使用M-MLV和下列反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)方案2微升10X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液；2微升M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)；2微升二巰基蘇糖醇；1微升多聚d(T)20；和13微升mRNA。
生成第一鏈后，有必要擴(kuò)增該mRNA片段(在用酚抽提和乙醇沉淀后)。由于mRNA有多聚A末端，使用多聚T的引物。在另一端，需要標(biāo)記序列并存在幾種可能性。若將一個(gè)標(biāo)記盒放在一個(gè)加工過的末端，該技術(shù)對(duì)低數(shù)目的第一鏈DNA有低的連接幾率。由于mRNA的多A末端接近編碼該蛋白質(zhì)的羧基端，標(biāo)記一個(gè)末端的方法是現(xiàn)成的。因此，采用僅標(biāo)記一個(gè)末端的方法并使用末端轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選的方法是使用末端轉(zhuǎn)移酶加多A到第一鏈的3’端。這通過單引物法從mRNA的cDNA兩端擴(kuò)增來完成。該方法如下10微升末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液(Promega配方)；1微升末端轉(zhuǎn)移酶(Promega)；5微升上述反轉(zhuǎn)錄方法得到的第一鏈DNA；1微升寡d(T)612；1微升d(A)；和7微升水；并在37℃溫孵1小時(shí)。末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液和末端轉(zhuǎn)移酶均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Rd.，Madison，WI 53711-5399，貨號(hào)M1871。
然后再用酚和乙醇沉淀分離DNA，并進(jìn)行PCR。下面描述的技術(shù)產(chǎn)生在一端有多dA而在另一端有dT的DNA鏈。對(duì)這樣一個(gè)需要用多T做引物的長(zhǎng)而精確的cDNA擴(kuò)增方法在長(zhǎng)段DNA上進(jìn)行PCR的問題通過使用下面Takara LA DNA擴(kuò)增法得到解決。cDNA的PCR擴(kuò)增如下1微升來自上述末端轉(zhuǎn)移酶方法的DNA；10微升10XTakara LA緩沖液；10微升dNTPs(Takara)；1微升多d(T)20引物；1微升TakaraEx Taq LA聚合酶；78微升水；和100微升礦物油。PCR條件如下94℃初始放置1分鐘；擴(kuò)增循環(huán)(40)是94℃30秒鐘；55℃2分鐘；和72℃3分鐘；繼之以2℃后放置。
該擴(kuò)增開始顯示一條多重mRNA帶。為得到需要的特異引物，首先，只用編碼絲蛋白非重復(fù)區(qū)的2Kb的引物(ii)擴(kuò)增由最初擴(kuò)增物得到的cDNA，該2Kb片段還通過使用第一次PCR得到的cDNA1微升結(jié)合了終止密碼子。這樣產(chǎn)生的單鏈cDNA僅有一個(gè)末端的多d(A)。此新引物僅擴(kuò)增絲蛋白的選擇性文庫(kù)。這還產(chǎn)生了一條優(yōu)先擴(kuò)增絲蛋白cDNA的帶。其次，使用PCR方法，其中與引物(ii)和多d(T)20一起使用1微升上述反應(yīng)液。完成此反應(yīng)后，用溴乙錠在瓊脂糖凝膠上形成三條清楚的mRNA帶。這些mRNA帶表明形成于蛛絲基因的三個(gè)不同大小的mRNA帶，該三個(gè)基因編碼約95kDa，190kDa，和220kDa的蛋白質(zhì)。在天然蛛絲中，190kDa和220kDa蛋白質(zhì)被加強(qiáng)，而所有三種蛋白質(zhì)都被形成。如電泳所證實(shí)的，在克隆和天然蜘蛛拖絲絲中都產(chǎn)生同樣的三種蛋白質(zhì)。這對(duì)顯示克隆正確的基因是重要的。這些結(jié)果另人信服的表明根據(jù)PCR分析在該蛋白質(zhì)存在三個(gè)起始部位，因?yàn)樗鼈兊淖詈?Kb片段是同源的。這些片段中最大的有14Kb長(zhǎng)。兩個(gè)最大的片段隨后被克隆。如上面實(shí)施例2中注釋的，通過用Sma I平端限制性切開pUC18并用CIAP處理克隆了最大的一個(gè)片段。通過連接它到如上實(shí)施例2所示的載體中而平端插入cDNA。用試劑盒號(hào)200230，Stratagene Cloning Systems，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，CA 92037將其轉(zhuǎn)化超感受態(tài)E.coli XL1 Blue MRF′。
通過用1％瓊脂糖凝膠檢測(cè)插入片段的大小鑒定有插入的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。然后通過使用PCR和多d(T)20引物測(cè)定正確插入的陽(yáng)性插入片段。還通過下面討論的抗體方法測(cè)定這些陽(yáng)性結(jié)果。用SDS電泳膠測(cè)定大的mRNA的抗體檢測(cè)所得的陽(yáng)性結(jié)果并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生三個(gè)不同的蛋白質(zhì)，也提供了多起始位點(diǎn)。一個(gè)蛋白質(zhì)稍微大于2Kb片段而其他兩個(gè)蛋白質(zhì)稍微短于天然蛛絲拖絲蛋白質(zhì)。然而，用Western染色法給這些高分子量染色是困難的，而這對(duì)天然蛋白質(zhì)來說也是一樣。
雖然未試圖插入起始密碼子或肯定閱讀框是正確的，這些克隆產(chǎn)生了大量的蛋白質(zhì)。事實(shí)上，某些克隆產(chǎn)生太多的蛋白質(zhì)以至妨礙了生長(zhǎng)。就發(fā)明者所知，一個(gè)培養(yǎng)物顯示出這樣多的目標(biāo)蛋白質(zhì)的合成還是首次。正如下面發(fā)酵一節(jié)所進(jìn)一步解釋的，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是培養(yǎng)條件，如低溫，幫助提高了蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。已發(fā)現(xiàn)那些蛋白質(zhì)干擾用于測(cè)序的質(zhì)粒DNA的分離，從而當(dāng)DNA編碼細(xì)菌中的蛋白質(zhì)時(shí)，難于得到適當(dāng)?shù)男蛄小Ｈ欢?，這些蛋白質(zhì)中的每一個(gè)的序列的最后部分是相同的(除在氨基末端的少數(shù)不同之外，而這部分在某些克隆是缺失的)。這些克隆在羧基端具有相同的序列(至少1900個(gè)的堿基)因?yàn)樗鼈冮喿x同樣的DNA編碼區(qū)。
從單位點(diǎn)引物系統(tǒng)克隆如前面所述，引物(ii)是獨(dú)有的，因?yàn)樗幋a大的ampulate(拖絲)絲蛋白的羧基端。然而，有必要開發(fā)一種方法，該方法將進(jìn)一步伸入氨基方向并有助于延伸出整個(gè)序列。已開發(fā)出兩個(gè)此類方法。一個(gè)是用鳥槍法制造DNA克隆，這在下面討論。不大可能認(rèn)為有人能將完整的基因克隆到一個(gè)插入片段中并用這個(gè)方法制造蛋白質(zhì)。由于發(fā)明者知道所述羧基端對(duì)其他所關(guān)注的蛛絲是唯一的，他們認(rèn)為可以開發(fā)出一個(gè)PCR方法，它必須以一個(gè)已知的唯一位點(diǎn)為起始點(diǎn)。這個(gè)技術(shù)，即第二個(gè)方法，將連接盒與DNA末端相牽連，盡管使用末端轉(zhuǎn)移酶同樣是有效的。
實(shí)施例4為便利在DNA末端做唯一的標(biāo)記，從而可開發(fā)結(jié)合于該位點(diǎn)的PCR引物，Takara試劑盒的一些序列盒被開發(fā)出來。下面公開的序列盒系統(tǒng)被使用。
序列盒1.Sau3A盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAG-5’序列盒2.EcoR I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCTTAA-5’序列盒3.Hind III盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTTCGA-5’序列盒4.Pst I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCA-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTG-5’序列盒5.Sal I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCAGCT-5’序列盒6.Sba I盒5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAT-3’3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAGATC-5’引物C15’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3’引物C2
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’引物(ii)5’-GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’見Isegawa等，Mol & CeH.Probes 6467(1992)為進(jìn)行此鑒定，有必要在上述限制性位點(diǎn)之一消化高分子量蜘蛛基因組DNA。限制性消化方法如下2微升的1微克/微升基因組DNA；20單位的適當(dāng)限制酶(根據(jù)六個(gè)上述限制性盒之一或所提供的其他盒，同樣的限制性盒與限制酶一起使用)；5微升的10X限制酶緩沖液；蒸餾水到總體積50微升；并在37℃溫孵3小時(shí)。
然后清洗該限制性消化物并通過乙醇沉淀再濃縮和重新溶解于無菌水。然后將序列盒連接到各自的DNA消化物。連接反應(yīng)方法如下5微升基因組DNA消化物；2.5微升一種適當(dāng)?shù)男蛄泻?如上述的1-6)(20毫微克/微升)；7.5微升Takara連接溶液；并室溫溫孵30分鐘。
然后清洗該連接反應(yīng)混合物并用乙醇沉淀再濃縮和重新溶解于5微升無菌水中。因?yàn)門akara試劑盒的Taq沒有校讀活性或高可靠性，使用Takara LA PCR試劑盒的試劑和聚合酶并產(chǎn)生十分精確的轉(zhuǎn)錄。使用的實(shí)驗(yàn)方案描述如下第一個(gè)PCR擴(kuò)增混合液有2微升DNA溶液；1微升序列盒7(引物C1)；1微升序列盒9(引物(ii))；10微升10X LA Ex Taq聚合酶緩沖液；1微升Ex Taq LA聚合酶；10微升dNTPs(每種2.5mM)；和水到總體積100微升。PCR反應(yīng)條件如下94℃開始放置1分鐘；擴(kuò)增(30循環(huán))94℃30秒鐘；55℃2分鐘；和72℃1-3分鐘；2℃后放置。
在第一次PCR擴(kuò)增后，在同樣條件下進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，不同的是基因組DNA溶液用1微升第一PCR的產(chǎn)物替換并且序列盒7(引物C1)被用序列盒8(引物C2)替換。
第二PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠顯示序列盒系統(tǒng)中的三個(gè)帶Pst I，Hind III和EcoR I。這些是長(zhǎng)度大于40Kb和某些是大于100Kb的淺帶。若凝膠中出現(xiàn)明顯的顯帶，則被推斷是由于極端長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物，盡管發(fā)明者沒能發(fā)現(xiàn)任何這樣長(zhǎng)的PCR的報(bào)道。然后從凝膠切下這些PCR產(chǎn)物的每一個(gè)并通過Gene Clean再純化。這些產(chǎn)物都是平端片段并直接克隆到pUC18的Sma I平末端限制位點(diǎn)和轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli XL1 BlueMRF′。若在插入時(shí)全部這些插入片段有某種程度的缺失，它們?nèi)援a(chǎn)生超過20Kb的質(zhì)?？寺?一般約23Kb)，這對(duì)插入完整的拖絲蛛絲基因是足夠長(zhǎng)的。如下面討論的，由于高濃度的絲產(chǎn)生而導(dǎo)致的生化問題，E.coli轉(zhuǎn)化子在肉湯培養(yǎng)中生長(zhǎng)的不太好。
像前面討論的cDNA轉(zhuǎn)化子那樣，這些轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的不太好并看上去形成像絲樣的絨團(tuán)。為此，本發(fā)明者們開始確定是否產(chǎn)生了蜘蛛絲。下述的抗體和凝集實(shí)驗(yàn)顯示產(chǎn)生了大量的絲蛋白。SDS凝膠電泳檢測(cè)了三種蛋白質(zhì)的存在(推測(cè)是來自于上述實(shí)施例3所描述的cDNA的作用)并且最大的兩個(gè)片段在整個(gè)長(zhǎng)度上與天然蛛絲相配。Western印記也顯示用cDNA所得到的同樣結(jié)果，即，較小的絲片段染色很好。由于沉淀和其他問題，十分大的蛋白質(zhì)在Western雜交中沒有像天然絲那樣顯示陽(yáng)性。實(shí)施例3反應(yīng)像本實(shí)施例。然而在兩種情況下和用天然蛛絲時(shí)較大蛋白質(zhì)染色是陰性的。
在這些克隆中有許多生長(zhǎng)還存在一些值得注意的問題--類似于用cDNA克隆所觀察到的但產(chǎn)量高得驚人。其中的一些克隆在37℃在像LB肉湯類的肉湯培養(yǎng)中生長(zhǎng)不好。有趣的是，據(jù)發(fā)明者推測(cè)隨該克隆帶來了啟動(dòng)子并助長(zhǎng)了生產(chǎn)速率。避免與質(zhì)粒DNA相結(jié)合的全長(zhǎng)絲之測(cè)序問題(它引起在在瓊脂糖凝膠上形成帶)的一個(gè)方法是亞克隆進(jìn)入產(chǎn)生非蛋白質(zhì)或小分子量蛋白質(zhì)的次級(jí)克隆中。這個(gè)問題比上面描述的cDNA克隆所觀察到的問題或下述聚合物所觀察到的問題更嚴(yán)重。這些克隆像cDNA克隆產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)并可被用于大規(guī)模生產(chǎn)。該DNA序列的最后2Kb已經(jīng)被確定以與使該序列成為完整的2Kb插入片段相配。
從基因組絲DNA進(jìn)行鳥槍克隆雖然已知此具體方法用于克隆蠶絲DNA，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)此技術(shù)還適合蛛絲DNA分離。然而預(yù)期將不得不通過雜交探針篩選達(dá)50,000個(gè)克隆以發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)暮暾虻目寺?。與上面討論的其他克隆方法不同，不期望這些克隆(或僅少量克隆)中的任何克隆將不經(jīng)廣泛剪接而產(chǎn)生蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明者開始改進(jìn)這個(gè)技術(shù)。本發(fā)明者研制的改進(jìn)涉及使用生物素標(biāo)記的探針，如那些用于進(jìn)行克隆的，附著在玻璃珠上的生物素探針。已發(fā)現(xiàn)這個(gè)技術(shù)將在克隆前富集至少含部分絲基因的序列。該生物素探針篩選含雜交到該探針的專一區(qū)域的DNA序列。因此，DNA片段可能不含完整的基因。然而，這個(gè)技術(shù)被用于得到蛛絲基因并用做生成蛋白質(zhì)表達(dá)克隆的起點(diǎn)。與實(shí)施例1-4中描述的克隆技術(shù)比較，這些鳥槍法是初步的方法但仍是克隆Nephila和其他蛛絲蛋白質(zhì)的適合方法。
實(shí)施例5借助于生物素探針用雜交探針篩選克隆是已知的。例如，Sigma試劑盒(Cool-1)(Sigma化學(xué)公司，14508信箱，Louis街，MO63178-9916)提供按照BioRad方法雜交的Sigma硝酸纖維素膜上克隆的斑點(diǎn)雜交之最終顯影試劑。這些方法有許多種并且大多數(shù)熟悉分子生物學(xué)的人員已經(jīng)實(shí)踐了這類技術(shù)。
濃縮雜交到生物素標(biāo)記探針的DNA片段的技術(shù)未被人們所熟知。在此系統(tǒng)中，DNAL(Lake Success，NY)M-280玻璃珠被用于用下面方法預(yù)富集基因組DNA。首先，生物素探針與Dynabeads M-280Streptavidin混合于離心管中。100微升的珠和100微升的生物素探針(1微克/微升)混在一起并使之在室溫結(jié)合10分鐘。此珠被裝載于有管磁鐵的離心管中并將液體輕輕倒出。然后用含0.1摩爾氯化鈉的TE緩沖液洗3次。將在95℃2分鐘預(yù)變性的基因組DNA100微升加入到此珠。在42℃讓珠與DNA雜交2小時(shí)，使用等量的結(jié)合溶液，該溶液是2X并含10毫摩爾tris HCI(pH7.5)，1毫摩爾EDTA和2摩爾氯化鈉。然后將溫度降低到室溫并在雜交液中洗珠3次。然后將富集的DNA用含0.1摩爾氯化鈉的0.15摩爾的氫氧化鈉洗脫。將此DNA濃縮到5微升水中并通過插入到pUC18載體的Sma I位點(diǎn)使之克隆。仍用結(jié)合到蛛絲序列的各種生物素標(biāo)記探針篩選正確的片段。對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。此技術(shù)是非常有效的但在篩選上需要做較多工作。由于可富集DNA以致篩選僅需要不到500個(gè)克隆。然而若沒有富集，則必須篩選200,000到2千萬(wàn)個(gè)克隆以得到一個(gè)含絲基因的克隆。
聚合方法使用實(shí)施例1和實(shí)施例2中描述的雙引物克隆技術(shù)和基于Nephila型序列的20多種不同引物，那些2Kb的插入片段是克隆的最大蛛絲片段。由此，推論制造較大片段需要不同的技術(shù)?？紤]到由于根據(jù)蛋白質(zhì)測(cè)序的現(xiàn)有信息未產(chǎn)生較大的片段，需要這種技術(shù)從向氨基端編碼的部分蛋白質(zhì)獲得另外的序列信息。雖然2Kb片段含蓋全長(zhǎng)的40％，聚合方法對(duì)增加長(zhǎng)度特征被認(rèn)為是必要的--因?yàn)殚L(zhǎng)度通常隨絲聚合物的大小而變化。因此，發(fā)明者希望聚合2Kb插入片段以制造比天然基因大的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的發(fā)明者推斷PCR將形成聚合這些插入片段的適當(dāng)方法，因?yàn)樗苊馑鶊?bào)道的序列的重復(fù)。本發(fā)明的聚合方法在下面實(shí)施例中給出。
具有各種有用限制位點(diǎn)的PCR片段構(gòu)造由修飾現(xiàn)有開始和終止引物的懸垂端來完成。其他開始和終止引物如上述的引物(i)和(ii)有不同的限制位點(diǎn)，除缺失了終止框架密碼子因此蛋白質(zhì)將繼續(xù)被翻譯進(jìn)入貫穿所述位點(diǎn)的mRNA外，還使較長(zhǎng)的構(gòu)建物被制造出來。開始時(shí)，起始密碼子被留下來從而存在多個(gè)蛋白質(zhì)幫助檢查缺失和增加轉(zhuǎn)錄。生成有獨(dú)特限制位點(diǎn)的不同2Kb插入片段所用的引物在下面給出。這些引物被稱為(xxi)-(xxvi)。
有BamH I位點(diǎn)的引物(xxi)5’-GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有Hind III位點(diǎn)的引物(xxii)5’-GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有Sal I位點(diǎn)的引物(xxiii)5’-GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’有BamH I位點(diǎn)但無終止密碼子的引物(xxiv)5’-GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’有Hind III位點(diǎn)但無終止密碼子的引物(xxv)5’-GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’有Sal I位點(diǎn)但無終止密碼子的引物(xxvi)5’-GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’實(shí)施例6(4Kb構(gòu)建物)
用pUC18的2Kb插入片段通過引物(i)和(xxv)的PCR生成本實(shí)施例的4Kb構(gòu)建物。引物(ii)和(xxii)被用于獨(dú)立進(jìn)行的反應(yīng)，該反應(yīng)與上述實(shí)施例2相關(guān)，不同的是用起始2Kb的質(zhì)粒代替基因組DNA。用LA(長(zhǎng)而精確)PCR技術(shù)，被發(fā)現(xiàn)的DNA片段是有新的限制位點(diǎn)的2Kb片段和代表完整質(zhì)粒的兩條帶。
然后按照公司的指導(dǎo)手冊(cè)通過1％瓊脂糖凝膠(70伏在8厘米膠上電泳90分鐘)--Gene Capsules(Geno Technology，Inc.St.Louis，MO63108)分離這些帶。用EcoR I和Hind III雙限制性酶切這些帶并用EcoR I切2微克的載體和用如上述實(shí)施例2中的CIAP處理。然后通過酚抽提和乙醇沉淀再純化兩個(gè)2Kb片段的每個(gè)片段和載體并溶解進(jìn)入10微升的TE緩沖液。Sambrook等描述了TE緩沖液。每5微升一份被加入到連接反應(yīng)液中(如上述實(shí)施例2中的連接反應(yīng)中)并連接在一起。用Invitrogen電穿孔儀，貨號(hào)S1670-01(購(gòu)自Invitrogen公司，3985 BSorrento Valley Vlvd，San Diego，CA 92121)，提供的常規(guī)細(xì)菌方法將它們電穿孔到E.coli XL1 Blue MRF′細(xì)胞(試劑盒號(hào)200230)，E.coli TOPP細(xì)胞(試劑盒號(hào)200241)和E.coli Sure細(xì)胞(試劑盒號(hào)200238)中。E.coli細(xì)胞得自Stratagene Coning Systems，11011North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92137。由于較少轉(zhuǎn)化子有缺失，Sure細(xì)胞產(chǎn)生較好的結(jié)果。成功的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生94和188kDa的蛋白質(zhì)，其中的后者類似于在有關(guān)天然蛛絲的文獻(xiàn)中報(bào)道的190kDa蛋白質(zhì)。
實(shí)施例7(6Kb聚合構(gòu)建物)用上述實(shí)施例2的方法通過3個(gè)片段的PCR生成本實(shí)施例中的6Kb構(gòu)建物這個(gè)方法包括用三個(gè)2Kb構(gòu)建物和下面的引物組組1引物(i)和(xxiv)；組2引物(xxi)和(xxv)；和組3引物(xxii)和(ii)。
它們以實(shí)施例6的4Kb聚合構(gòu)建物中描述的同樣方式被構(gòu)建進(jìn)入pUC18。然而發(fā)現(xiàn)在某些使用Sure細(xì)胞的情況，缺失沒有產(chǎn)生比天然絲大的蛋白質(zhì)，在許多情況中如用引物(i)和引物(ii)和轉(zhuǎn)化子DNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠所判斷的，有些缺失沒有發(fā)生。Sure細(xì)胞是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪侵亟M缺陷型。正如所期望的，在DNA大到一定大小以上時(shí)，它變得不穩(wěn)定并缺失了重復(fù)片段。
實(shí)施例8(8Kb聚合構(gòu)建物)
本實(shí)施例的8Kb構(gòu)建物恰如上面實(shí)施例的6Kb構(gòu)建物被生成，不同的是4個(gè)2Kb片段從下面4組引物被生成組1引物(i)和(xxiv)；組2引物(xxi)和(xxv)；組3引物(xxii)和(xxvi)；和組4引物(xxiii)和(ii)。
它們被插入的方式與實(shí)施例6和7的其他插入片段是相同的。即使在幾乎所有情況都發(fā)生了缺失，比天然絲大的蛋白質(zhì)被產(chǎn)生說明該聚合方法可被用于制造性質(zhì)優(yōu)良的合成絲。用這個(gè)技術(shù)和全長(zhǎng)DNA，該序列可被改變以產(chǎn)生天然絲DNA的聚合物單位，該聚合物是有比正常高得多的分子量的終產(chǎn)物。其中的一些克隆產(chǎn)生大小上類似于或大于全長(zhǎng)天然絲的蛋白質(zhì)。
從其他技術(shù)如cDNA法和上述單一位點(diǎn)系統(tǒng)得到的克隆還可被剪接在一起以制造其他聚合物。用全長(zhǎng)克隆或從其剪接的片段經(jīng)過本發(fā)明的聚合技術(shù)使達(dá)800kDa的克隆成為可能。
載體與生產(chǎn)系統(tǒng)對(duì)于蛛絲蛋白質(zhì)的克隆，E.coli和pUC18是優(yōu)選的起始生產(chǎn)系統(tǒng)。兩者都有高可靠性的良好穩(wěn)定的表達(dá)并通過它們的細(xì)胞膜分泌絲蛋白。雖然唯一的一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)實(shí)施例被給出，編碼天然蛋白質(zhì)或從它們獲得的聚合物可用于任何載體或基因組結(jié)合系統(tǒng)方面的應(yīng)用。因?yàn)檩d體和宿主的可能列表長(zhǎng)得不能再長(zhǎng)，下面僅給出少數(shù)實(shí)施例。
細(xì)菌系統(tǒng)E.coli表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的因?yàn)樗鼈冇挟a(chǎn)生很高水平的重組蛋白質(zhì)和分泌它們到細(xì)胞膜外所必要的生物化學(xué)機(jī)制。它們還易于用簡(jiǎn)單發(fā)酵生長(zhǎng)。此外，該系統(tǒng)的許多蛋白質(zhì)生產(chǎn)的主要問題已經(jīng)被解決以至它們屬于最通用的表達(dá)系統(tǒng)。pUC18屬于最常用的載體。除pUC為其中之一的通用人造質(zhì)粒外，基于裂解噬菌體，噬菌體質(zhì)粒嵌合體，和穿梭載體的其他載體也可作為表達(dá)插入的系統(tǒng)。這類質(zhì)粒的實(shí)例包括pBR322，pSP-64，pUR278和pORF1。噬菌體載體的實(shí)例包括λ，12001，λgt10，Charon 40，M13mp19和從天然細(xì)菌噬菌體修飾的其他噬菌體。
芽孢桿菌(Bacillus)表達(dá)系統(tǒng)，包括B.subtilis系統(tǒng)，也可被使用。這些細(xì)菌有通過宿主良好分泌的優(yōu)點(diǎn)，這就導(dǎo)致較少的加工步驟和加工成本。雖然可使用表達(dá)盒，用迄今所研究的載體宿主系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)盒不是必須的。一種可起E.coli和Bacillus穿梭載體作用的噬菌體質(zhì)粒嵌合體是pTZ18R，它可從Pharmacia買到(Piscataway，NJ)。
許多其他細(xì)菌系統(tǒng)可被用于表達(dá)。
被保藏的克隆一個(gè)代表性克隆于1995年7月2日被保藏在American Type CultureCollection(12301 Parklawn Dr. Rockville，Maryland 20852)并給予ATCC號(hào)69832。保藏物包括E.coli XL1 MRF′細(xì)胞，菌種名稱PA21，含帶有全長(zhǎng)蛛絲基因能表達(dá)全長(zhǎng)Nephila clavipes絲蛋白的pUC18質(zhì)粒(23Kb)。
酵母和霉菌系統(tǒng)Saccharoomyces cerevisiae，Schizosaccharomcyces pombe，Pichiapastoris，Asperillus sp.，Hansenula sp.，和Streptomyces sp.可被用做表達(dá)系統(tǒng)。然而Aspergillus和Pichia系統(tǒng)是例外，很少有證據(jù)表明這些系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生比細(xì)菌更多的蛋白質(zhì)或經(jīng)得起驗(yàn)證的產(chǎn)量增大。然而這些系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)生USP或食品等級(jí)的物質(zhì)更合需要，因?yàn)榧?xì)菌發(fā)酵物有毒素和與其結(jié)合的熱原，而這些酵母和霉菌系統(tǒng)中的許多已顯示作為食品級(jí)的物質(zhì)是安全的。
植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)植物系統(tǒng)可被用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)如絲。雖然蛋白質(zhì)的質(zhì)量可能低于微生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)質(zhì)量，植物培養(yǎng)是十分便宜的?？墒褂肁grobacter型轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，它使遺傳學(xué)屬性進(jìn)入植物基因組。用基因槍插入法，電穿孔法或一些其他插入工具可通過細(xì)菌如Agrobactertumafaciens LB4404插入這些系統(tǒng)。一旦被插入，它們可以穩(wěn)定形式和可遺傳方式結(jié)合進(jìn)植物基因組中。這些植物系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn)，如方便培育和大量收獲。農(nóng)民有經(jīng)驗(yàn)栽培這種產(chǎn)業(yè)重要性的植物如煙草，大豆，油菜子和其他野生農(nóng)作物，它們是對(duì)絲生產(chǎn)有意義的主要植物。目前的方法有從煙草和大豆純化高分子量蛋白質(zhì)。
昆蟲系統(tǒng)可使用Baculovirus表達(dá)系統(tǒng)并且該系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞系中高水平表達(dá)蛋白質(zhì)是眾所周知的。通過一些載體包括pBacPAK6，pBacPAK8或pBacPAC9完成復(fù)制和高效轉(zhuǎn)染。它們可被用于高水平表達(dá)盡管它們可能不如其他系統(tǒng)那樣低成本。
其他動(dòng)物系統(tǒng)還有許多載體可被用于插入各種動(dòng)物。雖然它們目前是不具有商業(yè)價(jià)值的載體宿主系統(tǒng)，但可應(yīng)用在該蛋白質(zhì)將來成為有用之物的地方。
發(fā)酵方法被轉(zhuǎn)染宿主的第一次發(fā)酵在LB中進(jìn)行，其中含10克細(xì)菌蛋白胨，5克Bacto酵母提取物和5克鹽和蒸餾水到一升終濃度。在此特定的肉湯中觀察到大量產(chǎn)蛛絲細(xì)菌的沉淀或絮狀物。此觀察是重要的，因?yàn)樗砻髁说鞍踪|(zhì)通過細(xì)胞膜被分泌出來。然而這些高分泌率似乎使細(xì)胞有些滲漏。因此，增加生理鹽濃度可能穩(wěn)定培養(yǎng)物。
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在低溫時(shí)，特別是在室溫或室溫以下，蛋白質(zhì)生產(chǎn)增加。還發(fā)現(xiàn)，較高溫時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)消失得比在室溫或室溫以下快。這個(gè)現(xiàn)象表明在約37℃的較高溫誘導(dǎo)出蛋白酶。值得注意的是，像許多蛋白酶如溶菌酶或蛋白酶K那樣，該蛋白酶似乎不降解蛛絲蛋白質(zhì)。這些不需要的代謝作用在低溫時(shí)最小。這可能是由于在低溫時(shí)誘導(dǎo)出休克蛋白質(zhì)。
還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分影響蛋白酶活性。例如，兩天培養(yǎng)物的尿素SDS凝膠沒有顯示出在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的蛋白質(zhì)降解，但當(dāng)培養(yǎng)物在補(bǔ)充了葡萄糖(10克葡萄糖，10克蛋白胨和5克酵母膏并蒸餾水到一升)的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，24小時(shí)后有大量的蛋白質(zhì)降解。經(jīng)補(bǔ)充的LB培養(yǎng)基和LB肉湯的唯一不同是LB肉湯含10克/升的氯化鈉，而經(jīng)補(bǔ)充的培養(yǎng)基含等量的葡萄糖。
由于這個(gè)蛋白酶的問題的發(fā)現(xiàn)，對(duì)蛋白酶抑制劑做了研究。人們認(rèn)為若一種便宜的蛋白酶抑制劑能夠被發(fā)現(xiàn)并攙入培養(yǎng)基，對(duì)發(fā)酵物的增加是有益的。被測(cè)試的化合物包括氯化鋅，硫酸銅，EDTA二鈉，氯化鈉，硼酸，聚乙二醇(B-二氨基乙酯)，苯甲基磺酰氟，N，N，N′，N′-四乙酸，1，10啡咯啉，1，10啡咯啉鐵復(fù)合物，蔗糖，葡萄糖，乳糖，果糖，甘油，胨和酵母膏。所發(fā)現(xiàn)的最有效的抑制劑是氯化鈉或氯化鉀的鹽添加物。硼酸也被發(fā)現(xiàn)是良好的抑制劑。其他化合物是無效的。事實(shí)上，簡(jiǎn)單的蔗糖，特別是乳糖和葡萄糖，促進(jìn)蛋白酶活性。胨和酵母膏不影響蛋白酶活性。用AOAC官方方法969.11，即用于測(cè)試啤酒中蛋白水解防凍酶的一種方法，測(cè)試這些化合物。為進(jìn)行此測(cè)試，取1毫升培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)試?；钚缘鞍酌复嬖跁r(shí)，僅數(shù)秒內(nèi)該溶液變清。蛋白酶陰性的樣品在60℃半小時(shí)或20℃過夜后顯出渾濁。此測(cè)試被用做快速質(zhì)量控制工具，篩選各種培養(yǎng)基的產(chǎn)蛋白水解酶能力。
試圖使用各種培養(yǎng)基發(fā)酵。業(yè)已發(fā)現(xiàn)復(fù)合培養(yǎng)基表現(xiàn)出色。然而，使用比LB肉湯中所含低10倍的胨和酵母膏達(dá)到可接受的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。這種較簡(jiǎn)單的并且便宜的培養(yǎng)基產(chǎn)生出可觀的蛋白質(zhì)。這種培養(yǎng)基含下列成分1.2克磷酸氫二鉀，1.1克磷酸二氫鈉，4.0克氯化鈉，0.45克硫酸鎂，2.0克硫酸銨，0.04克硝酸鈉，0.03克氯化鈣，0.02克硫酸鐵，0.01克硫酸錳，0.01克硼酸，0.0005克鉬酸鈉，0.005克氯化鈷，0.5克甘氨酸，1.0克丙氨酸，1.0克酵母膏，10克甘油，蒸餾水到1升，pH調(diào)到7.0。寬范圍的培養(yǎng)基成分被用于本發(fā)明的發(fā)酵。這些培養(yǎng)基成分的范圍可包括鹽，甘油(或其他碳源)和酵母膏或其他礦物營(yíng)養(yǎng)成分。若培養(yǎng)基比較便宜，它一般產(chǎn)生低水平的絲蛋白。
其他主要必須的最佳化發(fā)酵條件是氧，營(yíng)養(yǎng)物水平和溫度。30℃時(shí)的厭氧條件被發(fā)現(xiàn)是優(yōu)選的。此外，碳源應(yīng)以相對(duì)高的水平被加入以使生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)最大化。例如，每升使用10克葡萄糖和10克甘油。
抗體測(cè)試抗體測(cè)試被開發(fā)出以確定是否蛛絲蛋白質(zhì)正在E.coli宿主中表達(dá)，用蠶絲和蜘蛛大的ampulate分泌腺絲以三種動(dòng)物宿主進(jìn)行抗體測(cè)試。
為生成這些抗體，蠶絲蛋白質(zhì)取自做繭前第五星級(jí)的Bombyx mori蛆。通過挑選這類蛆，得到的絲是粘性的并且這類蛆看上去是透明的而可辨認(rèn)。用無菌技術(shù)解剖取出黏液絲。然后將絲直接加入到佐劑中。另外，可抽出來自蜘蛛的大的ampulate分泌腺之蛛絲。然而，有必要溶解該蛛絲。通過將其懸浮在8摩爾的溴化鋰在95℃加熱5分鐘進(jìn)行溶解。該蛛絲和蠶絲被用于制造絲的抗體。
為生成該抗體，用8摩爾的尿素取代溴化鋰并通過離心最終置于2摩爾的尿素中。一旦該樣品置于尿素中，將兩種絲任何之一與10毫升(1∶10)Freund′s完全佐劑混合。將其腹膜內(nèi)注射給小鼠，兔或山羊以生成抗體。在第21天到28天，用該絲和Freund′s不完全佐劑增強(qiáng)免疫動(dòng)物。到第五周，可以每周采血并收集血清中的抗體。該血清被用于血凝實(shí)驗(yàn)或Western雜交。對(duì)小鼠，兔和山羊使用這個(gè)方法，采血并分離血清。這樣從每種動(dòng)物中產(chǎn)生抗蠶絲和蛛絲的多克隆抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的血凝實(shí)驗(yàn)對(duì)這些血清做抗體滴定并發(fā)現(xiàn)所有的血清至少有256滴度。
血凝實(shí)驗(yàn)通過包被1％RBCs(Sigma Cat#R-3378)進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)。溶解的絲(1毫克)被加入到1毫升的1％RBCs中。在室溫將其渦流混合數(shù)次并于冰箱中過夜。次日晨，通過在磷酸緩沖的生理鹽水(pH7.2)中離心洗RBCs三次以除去任何非吸附蛋白質(zhì)。然后將敏化的RBCs穩(wěn)定在冰箱中2周或更長(zhǎng)時(shí)間。
為進(jìn)行血清血凝實(shí)驗(yàn)，25微升抗血清被連續(xù)稀釋(2倍稀釋)并加入25微升的敏化RBCs。對(duì)照孔也類似連續(xù)稀釋并加入非敏化的(25微升)RBCs。室溫中輕搖微量滴定板10分鐘并將板溫孵在室溫90分鐘，不要攪動(dòng)。用Rose和Friedman方法(臨床免疫學(xué)手冊(cè)，第二版，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(1980))評(píng)估它們。因?yàn)槠渲貜?fù)單位的類似性，許多絲有類似的折疊結(jié)構(gòu)。因此，認(rèn)為由于三級(jí)結(jié)構(gòu)的類似性，可能存在一些交叉反應(yīng)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)蠶絲抗血清與蛛絲蛋白質(zhì)敏化的RBC′s有交叉反應(yīng)并發(fā)現(xiàn)蛛絲蛋白抗血清與蠶絲蛋白R(shí)BC′s有交叉反應(yīng)。這類交叉反應(yīng)成為主要工具以至可以對(duì)兩組抗體測(cè)試一個(gè)培養(yǎng)物確證該絲不是由于另外的E.coli蛋白造成的。
我們還發(fā)現(xiàn)了另外的篩選方法，它基于用絲抗原包被RBC′s。已發(fā)現(xiàn)如果我們超聲洗細(xì)胞，分離細(xì)胞膜并取其上清夜，我們可通過2倍連續(xù)稀釋用它代替血清。在將25微升絲敏化的細(xì)胞鋪在RBC′s上時(shí)，它們呈現(xiàn)典型的血凝實(shí)驗(yàn)，這可被用于轉(zhuǎn)化子的第一次篩選。據(jù)推論，絲蛋白有粘性末端，它在溶液中會(huì)粘連到其他絲蛋白并交聯(lián)到RBC′s。本實(shí)驗(yàn)使用同樣機(jī)制，依此機(jī)制絲蛋白連接并從溶液中沉降出來。我們沒有發(fā)現(xiàn)任何其他基于此機(jī)制的蛋白質(zhì)檢測(cè)參考資料。因此，我們期望這是一個(gè)很特異的絲和絲樣蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
為在菌落上進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，用在PBS中離心洗細(xì)菌培養(yǎng)物3次并最終到100微升PBS中。用Brason 450超聲儀在冰浴中以1/8英寸管尖，40％功率和20％負(fù)載周期對(duì)其超聲處理2分鐘。該溶液用于敏化PBC′s。檢測(cè)在與上面相同的方法進(jìn)行不同的是每次對(duì)一個(gè)不同的細(xì)菌分離物。在所有情況下，成功的產(chǎn)生絲蛋白的培養(yǎng)物有至少16的滴度并通常是256滴度。該方法被用于篩選上述質(zhì)粒瓊脂糖凝膠和雜交所發(fā)現(xiàn)的10個(gè)最有希望的分離物。在2Kb插入的情況，保留少數(shù)最好的分離物供進(jìn)一步使用。
絲蛋白質(zhì)的純化本發(fā)明還包括純化和精紡絲蛋白的技術(shù)。這些步驟對(duì)加工該蛋白質(zhì)成其終產(chǎn)品形式是必要的。該蛋白質(zhì)可被用做涂層深入到纖維中，或制成一種聚合膜。
從發(fā)酵培養(yǎng)基純化絲蛋白可通過兩步工序完成。首先，通過連續(xù)離心可除去細(xì)菌細(xì)胞和沉淀的蛋白質(zhì)。留在肉湯中的其余物質(zhì)通過超濾被分離，因?yàn)榇蠖鄶?shù)分子量在80,000之上的蛋白質(zhì)是絲。然后可將得自連續(xù)離心的蛋白質(zhì)絲系列與超濾方法結(jié)合。在細(xì)胞膜上可發(fā)現(xiàn)大批的其余蛋白質(zhì)。通過用超聲破細(xì)胞，所述細(xì)胞破碎并且其內(nèi)的蛋白質(zhì)被移出。
本發(fā)明的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是使用超聲溶解蛛絲，使其不用被清洗和完全干燥。然后此再溶解的絲蛋白質(zhì)溶液可被離心以除去細(xì)胞膜。除去細(xì)胞膜后，蛋白質(zhì)既可通過超離心被進(jìn)一步純化也可精紡。為精紡絲，保持絲在溶液中是重要的。然而，先前的方法使用十分粗糙的化學(xué)品保留絲的溶解性用于精紡操作。
各種化合物將保持絲蛋白在精紡加工前不沉淀。這些化合物包括各種鹽，鋰鹽，鈉和鉀的氫氧化物，磷酸脲，鹽酸胍，尿素，和六氟異丙醇--他們?nèi)既芙饨z。通過本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)超濾純化后，通過加入乙醇，甲醇，其他醇或類似溶劑可進(jìn)一步進(jìn)行純化。這種純化的絲蛋白物質(zhì)通過超聲或通過加入一種或多種上述鹽化合物可被重新溶解。由絲蛋白溶解中成本和環(huán)境因素所決定的優(yōu)選化合物是鈉和鉀的氫氧化物，氯化鈉，氯化鉀和氯化鋰或結(jié)合超聲或蛋白質(zhì)純化用醇類一起使用的溴化鋰。
類似于其他絲蛋白質(zhì)，蛛絲蛋白不易溶解。雖然有資料表明蛛絲可溶于粗化合物如甲酸(88％)，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)它會(huì)引起全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的降解。然而，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)絲纖維可被再溶于LiSCN，LiBr，LiCI，尿素，六氟異丙醇，鹽酸胍和類似的變性劑。一旦絲蛋白被溶解，較少的蛋白質(zhì)變性劑包括尿素可被用于防止蛋白質(zhì)再沉淀。在不可逆精紡成絲線前最可能推薦的是使用可溶性蛋白質(zhì)。因此已經(jīng)被從完全干燥的絲蛋白再溶解的絲蛋白和從發(fā)酵過程回收后還從未被完全干燥的絲蛋白被推薦用于精紡加工。
進(jìn)一步加工絲蛋白成纖維絲的一般加工蠶絲蛋白一般以下面方式被加工。為使絲纖維的強(qiáng)度足以用于紡織，多至5個(gè)纖維被絞在一起。第一次繅絲后，絲被重繞成絞在一起的絲束。
然后生絲經(jīng)過幾道叫做拈絲的工序。絲束被清洗和纏繞在大線軸或筒管上。這些筒管被放在并絲架上，在那里單絲線被并絲和纏在一起以得到需要的絲線大小。然后該絲線被纏繞并用拈絲架的錠子抽出然后拈絲架的絲筒管被放在水中并且絲在滾筒之間被伸展開。在拈絲架上的伸長(zhǎng)程度影響纖維的直徑。在伸展架上，絲線被制作得光潔而平滑。在最終被織成布料前，拈絲的絲線被煮沸以除去任何殘余水溶性蛋白或其他粘性物質(zhì)。因?yàn)橹蠓胁襟E降低絲的重量，絲被沾入鐵或錫的鹽中以重獲得失去的重量。在此沾入步驟中，絲纖維吸收一些這類鹽而加重但不失其光澤。
蛛絲蛋白的專門加工上述方法產(chǎn)生的蛛絲蛋白質(zhì)以蠶絲蛋白質(zhì)相同的方式可被加工成纖維。這需要精紡或擠壓蛋白質(zhì)或蛋白溶液以得到直徑范圍可在5微米到200微米或以上的絲線。在該加工的第一步是從發(fā)酵液濃縮絲蛋白。濃縮步驟可通過數(shù)種方法來完成，方法包括使用只容許給定分子量范圍的物質(zhì)通過的膜技術(shù)。用這些膜的一個(gè)缺點(diǎn)是成本。其他更具成本效益的濃縮絲蛋白質(zhì)和除去宿主載體的方法包括連續(xù)離心或分批離心。此外，然后可用超聲能量裂解細(xì)菌細(xì)胞壁并使細(xì)胞壁內(nèi)產(chǎn)生的絲蛋白質(zhì)挽出到液體培養(yǎng)基。為使絲蛋白質(zhì)與細(xì)菌細(xì)胞壁分開，高濃度鹽是有幫助的。
這時(shí)，蛋白質(zhì)溶液通過各種醇可被沉淀出培養(yǎng)基。有用的醇包括甲醇，異丙醇和乙醇。以前的技術(shù)達(dá)到在加工中的這一步絲蛋白可被溶解于鋰鹽和含氟的有機(jī)溶劑。然而，這個(gè)方法是昂貴的并且有嚴(yán)重的環(huán)境問題。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用醇類或?yàn)V器濃縮蛛絲蛋白質(zhì)然后通過使用氯化鈉水溶液結(jié)合超聲使其在溶液中保持粘性直到它們被擠壓成絲。如有必要，可加入尿素，鈉或鉀的氫氧化物或鋰鹽如前述技術(shù)加工中公開的那樣。然而，因?yàn)槁然c和超聲，可能僅需要使用很低濃度的這些物質(zhì)。應(yīng)注意的是，在純化時(shí)使用過高的超聲能量，延長(zhǎng)的超聲或高克分子濃度的鋰鹽可降低絲蛋白質(zhì)的分子量。
一旦用小直徑管或其他產(chǎn)生小直徑纖維的方法擠壓該蛋白，該蛋白可以類似于蠶絲的方式被加工。一旦該蛋白被暴露于空氣和被干燥，它就不再溶于氯化鈉或被超聲處理。
然后可用類似于對(duì)蠶絲所使用的設(shè)備對(duì)該絲蛋白預(yù)伸展或拈絲。類似于對(duì)蠶絲所使用的，也可用煮沸方法。煮沸失去的大多數(shù)重量不是如蠶絲纖維加工時(shí)的水溶性蛋白質(zhì)，而是殘留鹽份和發(fā)酵培養(yǎng)基的水溶性營(yíng)養(yǎng)成分。若在此加工步驟期間失去的20-25％的重量通常是來自生蠶絲的話，則預(yù)期當(dāng)經(jīng)受煮沸水以清潔最終的絲或以準(zhǔn)備其用于染色時(shí)失去的不到5％的重量是來自于本發(fā)明的蛛絲。
通過使用本發(fā)明的方法，絲蛋白的天然顏色可通過篩選編碼進(jìn)一步進(jìn)入基因組DNA的引物而得到。本發(fā)明克隆和方法中產(chǎn)生的蛛絲蛋白質(zhì)所觀察到的有白色，黃色，粉紅色和淺紫色。天然顏色的選擇對(duì)編排紡織纖維的生產(chǎn)是有價(jià)值的，因?yàn)樵谠S多情況下它將減小顏色印染的需要和相關(guān)的成本。
通過卷或纏繞兩股或兩股以上的線在一起制造較大的紗線蛛絲蛋白長(zhǎng)絲可被以蠶絲類似的方式處理。此外，這些紗線可與碳或石墨纖維，硼或硼鍍石墨纖維，或Kevlar混紡以制造驚人高強(qiáng)度紡織材料用于防彈服或其他應(yīng)用中。相反，通過使用較小的紗線(包含三到五股纖維并且只含純蛛絲)可生產(chǎn)有非常平滑感覺和光澤的纖維。該最終紡織品的彈性和其他性質(zhì)可部分的通過擠壓和精紡加工后對(duì)長(zhǎng)絲或纖維的加工來控制。在蠶絲業(yè)的拈絲加工標(biāo)準(zhǔn)方面，與蠶絲加工不同的加工參數(shù)的主要改變是當(dāng)它們被從初始蛋白質(zhì)溶液抽絲或擠壓出絲或以后的加工時(shí)，單股長(zhǎng)絲的前延伸或伸展的程度。
除上述之外，蛛絲蛋白長(zhǎng)絲的高強(qiáng)度性質(zhì)容許其他加工改變。一種此類加工變量是絲線的在線涂布，用各種物質(zhì)引入顏色，增加的強(qiáng)度，光澤，虹彩和增加纖維在外觀，感覺或強(qiáng)度上市場(chǎng)化性能的其他質(zhì)量。在線涂布可通過數(shù)種方法包括在擠壓，纏繞或拈絲步驟中使蛛絲長(zhǎng)絲通過各種浴池或槽來完成。在線蒸汽淀積也可被使用。在線蒸汽淀積物質(zhì)到絲蛋白上時(shí)必須考慮到一些殘留的鹽份或其他發(fā)酵化合物可能在長(zhǎng)絲開始被形成時(shí)出現(xiàn)，這些長(zhǎng)絲在形成后易于保持濕度除非用烘箱，風(fēng)扇或其他辦法干燥。在某些情況下，推薦使用擠壓后煮沸以除去全部痕量發(fā)酵培養(yǎng)基和再增溶化學(xué)物質(zhì)--兩者在織入纖維時(shí)均可引起皮膚的過敏反應(yīng)。可蒸汽淀積在蛛絲蛋白質(zhì)上的物質(zhì)包括錫和鈦的氧化物。這些氧化物在長(zhǎng)絲上形成一層，其厚度取決于烘箱的條件。雖然鈦層可產(chǎn)生較高強(qiáng)度的纖維，一些人對(duì)二氧化鈦層有過敏反應(yīng)并且這可能限制其用途在服裝以外的應(yīng)用中。然而氧化錫對(duì)人的皮膚接觸是GRAS(普遍推薦為安全的)并因此可被用于服裝應(yīng)用方面。
蛛絲蛋白質(zhì)的膜可通過包括澆鑄的幾種方法來生產(chǎn)，其中絲蛋白溶液被澆在或?yàn)⒃诎迤匣蛲ㄟ^使用滾筒。膜在澆鑄或滾壓前還可通過加入化合物到蛋白質(zhì)中而被修飾。這包括活性分子的摻入，這些活性分子可起香料，調(diào)料，吸收劑或?qū)Ω鞣N生物試劑或武器的反應(yīng)劑作用。膜可具有在加工中添加的顏色或者來自絲克隆蛋白質(zhì)的天然顏色可被選擇以引入一種天然色。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生編碼絲蛋白的DNA片段的一種方法，包括步驟選擇從產(chǎn)絲蜘蛛收獲的靶DNA，所述靶DNA包括多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)；選擇至少10個(gè)核苷酸的單鏈DNA引物，該引物含與所述靶DNA中一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的DNA序列；和重復(fù)結(jié)合DNA引物與變性DNA，并將所述結(jié)合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵以產(chǎn)生所述DNA片段，其中所述DNA片段與所述靶DNA互補(bǔ)并至少是2Kb。
2.權(quán)利要求1的方法，包括使用兩個(gè)不同的DNA引物的步驟。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述靶DNA是通過將編碼蛛絲的全長(zhǎng)mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA；加入一個(gè)引物位點(diǎn)到所生成的第一鏈cDNA的氨基末端；和使用該cDNA的多聚dT區(qū)作為第一聚合酶引發(fā)區(qū)。
4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第二引物位點(diǎn)通過使用連接盒被創(chuàng)建在DNA的未知末端。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中第二引物位點(diǎn)通過使用末端轉(zhuǎn)移酶被創(chuàng)建在DNA的未知末端以生成一個(gè)選自包含多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位點(diǎn)。
6.權(quán)利要求1或2的方法，包括選擇Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila，或Gasteracantha屬的一種蜘蛛的步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，包括選擇由序列(i)-(xx)代表的引物DNA(i) GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN，其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述靶DNA通過被雜交到含序列(i)-(xx)的DNA探針而被篩選，該探針可逆結(jié)合到支持物以富集編碼絲DNA片段。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述DNA片段是至少5Kb。
10.一個(gè)編碼蛛絲蛋白的DNA序列，所述DNA序列包含多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)并有至少2Kb長(zhǎng)度。
11.權(quán)利要求10的DNA，其中所述DNA序列含至少5Kb長(zhǎng)度。
12.權(quán)利要求10或11的DNA，其中所述蜘蛛屬于Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha屬。
13.權(quán)利要求11的DNA，其中所述蜘蛛是Nephila clavipes。
14.權(quán)利要求12的DNA，其中所述DNA包含圖1說明的序列。
15.一種聚合方法，包括以下步驟篩選編碼從產(chǎn)絲蜘蛛收獲絲蛋白的靶DNA，所述靶DNA包含多個(gè)重復(fù)和非重復(fù)區(qū)；選擇第一對(duì)不同的DNA引物，所述第一對(duì)DNA引物均與所述靶DNA一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)，至少所述第一對(duì)DNA引物中之一由序列(i)-(xxvi)代表(i) GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(ii) GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(iii) GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；(iv) TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；(v) GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；(vi) GAYGAYGGNAAYGCNGT；(vii) TGNTGNCCSGTTCG；(viii) CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；(ix) GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；(x) GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；(xi) TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；(xii) TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；(xiii) TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；(xiv) CCNCGNCCNCTYCC；(xv) GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；(xvi) GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；(xvii) GGWGGACGAGGTGGATTA；(xviii) GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；(xix) CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and(xx) GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCCNGGNGCNGGNGGN；(xxi) GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxii) GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxiii) GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；(xxiv) GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；(xxv) GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；and(xxvi) GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC通過重復(fù)結(jié)合DNA引物與變性DNA并將所述結(jié)合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和對(duì)有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵以產(chǎn)生第一DNA片段，所述第一DNA片段與所述靶DNA互補(bǔ)并至少是2Kb；所述聚合方法進(jìn)一步包括選擇第二對(duì)不同的DNA引物，在與所述第一對(duì)DNA引物的兩個(gè)序列相比時(shí)至少所述第二對(duì)DNA引物之一是不同的，并且至少所述第二對(duì)DNA引物中之一由序列(i)-(xx)代表通過重復(fù)結(jié)合所述第二對(duì)DNA引物與變性靶DNA并將所述結(jié)合的DNA引物和靶DNA與核苷酸和有校讀活性的DNA聚合酶一起溫孵而產(chǎn)生第二DNA片段，與所述第一DNA片段相比，所述第二DNA片段是不同的并也與所述靶DNA互補(bǔ)，所述第二DNA片段至少是2Kb；限制性酶切所述第一和第二DNA片段；和重組所述第一和第二DNA的限制性片段進(jìn)被聚合的DNA，所述被聚合的DNA編碼蛛絲蛋白并是至少4Kb。
16.權(quán)利要求15的聚合方法，其中所有DNA引物由序列(i)-(xxvi)代表。
17.權(quán)利要求16的聚合方法其中所有的DNA引物是不同的。
18.權(quán)利要求15-17的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少6Kb。
19.權(quán)利要求18的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少8Kb。
20.一種生產(chǎn)絲蛋白的方法，包括步驟篩選權(quán)利要求12的DNA，插入所述DNA到一個(gè)表達(dá)載體中；用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；在培養(yǎng)基中發(fā)酵所述的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞以生產(chǎn)絲蛋白；和回收所述絲蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述培養(yǎng)基含蛋白酶抑制劑。
22.權(quán)利要求21的生產(chǎn)絲蛋白的方法，進(jìn)一步包括步驟應(yīng)用超聲能量破碎宿主細(xì)胞；應(yīng)用超聲能量重懸浮絲蛋白；和離心所述被破碎的細(xì)胞以將細(xì)胞膜與所述絲蛋白分開。
23.權(quán)利要求22的生產(chǎn)絲蛋白的方法，進(jìn)一步包括通過超濾或乙醇沉淀純化絲蛋白的步驟。
24.精紡絲蛋白的方法，它包括濃縮權(quán)利要求23的被純化的絲蛋白；抽絲被濃縮的絲蛋白纖維；精紡絲纖維以生產(chǎn)絲線；和清洗絲線以除去任何增溶劑的步驟。
25.權(quán)利要求24的精紡絲方法，其中增溶劑選自氫氧化鈉，氫氧化鉀，六氟異丙醇，鹽酸胍，尿素，尿素磷酸酯，鋰鹽，有機(jī)溶劑，硫酸銨，醋酸，磷酸，二氯乙酸，甲酸和硫酸。
26.權(quán)利要求24的精紡方法，進(jìn)一步包括用錫或鈦涂層所述絲纖維或絲線。
27.一種包含權(quán)利要求24所制造的絲線的纖維。
28.權(quán)利要求27的纖維，進(jìn)一步含蠶絲，Kevlar，石墨或碳纖維。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生編碼來自產(chǎn)絲蜘蛛的絲蛋白質(zhì)之DNA片段的方法。本發(fā)明還涉及編碼該蛛絲蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用上述DNA序列產(chǎn)生蛛絲蛋白質(zhì)的方法?？寺『蜕a(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法可適用于全部產(chǎn)絲蜘蛛。通過這些方法生成的克隆生產(chǎn)商業(yè)用量的高分子量絲蛋白質(zhì)。由于從這類蛋白制造的絲有優(yōu)越的強(qiáng)度特性,本發(fā)明克隆的絲蛋白質(zhì)具有可觀的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1200145SQ96197771
公開日1998年11月25日 申請(qǐng)日期1996年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月22日
發(fā)明者R·M·巴瑟爾, G·R·艾利安 申請(qǐng)人:阿格里科拉技術(shù)有限公司