專利名稱：：異種(人類)免疫球蛋白在克隆轉基因有蹄類動物中的表達的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明為帶有或者部分或者整個異種抗體基因座的遺傳修飾有蹄類動物，所述基因座經歷了重排并且表達一個趨異抗體分子群體。特別是，所述異種抗體基因可以來源于人類。另外，本發(fā)明提供其中所述內源抗體基因的表達或者被減少或者被消除的有蹄類動物。運用核轉移和分子技術的組合，制備所述有蹄類動物(例如牛)中的遺傳修飾。這些克隆轉基因有蹄類動物提供了一種可更新的、理論上無限的異種多克隆抗體(特別是人抗體)的供應，所述異種多克隆抗體可具有例如作為治療藥、診斷藥的用途和可用于純化目的。
背景技術：
：1890年，ShibasaburoKitazato和EmilBehring報道了一個有著特別結果的實驗；特別是，他們證明，通過從免疫動物取出血清，并將其注射到未免疫動物體內，可以使免疫從一只動物轉移至另一只動物。這一里程碑性的實驗成為將被動免疫引入臨床實踐的基礎。今天，人免疫球蛋白(Ig)的制備及其在被動免疫方面的應用是標準的醫(yī)學實踐。僅在美國，人Ig每年的銷售額為$1,400,000,000，每年有16公制噸的人抗體用于抗體靜脈治療。在工業(yè)最發(fā)達國家的經濟中有相當水平的消耗，可以預期在發(fā)展中國家中其需求將快速增長。目前，用于被動免疫的人抗體得自人類供體的混合血清。這意味著在可用于治療和預防的人抗體的量存在固有的限制。其需求已經超過了供應，并且通常是嚴重短缺。為了解決與人Ig供應不足相關的一些問題，已經開發(fā)了各種技術。例如，通過重組方法在組織培養(yǎng)物中生產人Ig是常規(guī)技術。特別是，人Ig在CHO表達系統中的重組表達是眾所周知的，目前用來生產現在用于治療的幾種人免疫球蛋白(Ig)和嵌合抗體。已經產生供生產人抗體(例如單克隆抗體)用的保留未經重排的人免疫球蛋白基因的小鼠(參見例如WO98/24893；WO96/33735；WO97/13852；WO98/24884；WO97/07671(EP0843961)；美國專利5,877,397；美國專利5,874,299；美國專利5,814,318；美國專利5,789,650；美國專利5,770,429；美國專利5,661,016；美國專利5,633,425；美國專利5,625,126；美國專利5,569,825；和美國專利5,545,806)。另外，WO00/10383(EP1106061)描述了通過微細胞融合修飾人染色體片段并且將所述片段轉移到某些細胞中。此外，WO01/35735描述了牛IgM重鏈敲除。1998年12月15日授予Meade等的美國專利5,849,992以及1998年10月27日授予Meade等的美國專利5,827,690描述了在包括小鼠、綿羊、豬、牛和山羊在內的轉基因動物的乳中生產單克隆抗體，其中所述轉基因動物在保證人抗體在乳房上皮細胞中表達的啟動子控制之下表達所述人Ig基因。從本質上講，這導致所述抗體在這類動物(例如牛)的乳中表達。然而，雖然先前已經報道了這些，但非常需要在血流中產生所需物種的抗體(特別是多克隆抗體)、尤其是人Ig并且產生一系列不同的對所需抗原特異性的抗體的改進方法和增強的轉基因動物，尤其是牛。更尤其是在有蹄類動物中生產人Ig將特別有益，因為(1)牛可以產生大量的抗體，(2)?？梢杂萌祟惒≡w或其它病原體免疫，并且(3)?？梢杂脕碇苽淇谷祟惪乖娜丝贵w。大量多克隆抗體的可得性對于傳染病的治療和預防、免疫系統的調節(jié)、人細胞例如癌細胞的清除以及特定人類分子的調節(jié)有利。雖然已經在小鼠中表達了人Ig，但人Ig在牛中或是在其它有蹄類動物中是否部分重排和表達是不可預測的，因為在抗體基因結構、抗體產生機制和B細胞功能方面存在差異。特別是，與小鼠不同，牛和羊在其免疫生理學方面與人類有所不同(Lucier等，J.Immunol.1615438，1998；Parng等，J.Immunol.1575478，1996；和Butler，Rev.Sci.Tech.1743，2000)。例如，與抗體基因的多樣化在人類和小鼠中依賴于基因重排相比，抗體基因的多樣化在牛和羊中更多地依賴于基因轉變。此外，在人類和小鼠中B細胞的主要位置是在骨髓中，而在牛和羊中B細胞位于回腸淋巴集結中。因此，預測在牛(或其它有蹄類動物)的B細胞譜系中是否發(fā)生人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白重排和多樣化，在本發(fā)明之前即使并非是不可能的，也是困難的。另外，也一直難以預測牛在無其內源Ig的情況下或者在人抗體的干擾下是否能夠生存，即誘發(fā)其正常的免疫功能。例如，不能確定表達人Ig的牛B細胞是否正確地遷移至牛的回腸淋巴集結中，因為這在人類中是不發(fā)生的。也不清楚介導補體激活、細胞因子釋放的誘導以及抗原清除的人Fc受體功能在牛系統中是否正常。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個目的是產生重排并表達人類或其它物種Ig基因座的轉基因有蹄類動物(例如轉基因牛)。優(yōu)選通過穩(wěn)定地導入含有人Ig基因的人染色體片段以產生除內源Ig之外或者代替內源Ig而具有人Ig或另一種物種Ig的B細胞的轉基因有蹄類動物(例如牛)來實現這一點。這也可以通過將編碼異種免疫球蛋白鏈或異種抗體的核酸整合到有蹄類動物的染色體中來實現。本發(fā)明的另一個目的是產生其內源Ig的表達已被減少或敲除的轉基因有蹄類動物(例如轉基因牛)。例如，可以將無義突變或缺失突變引入編碼內源免疫球蛋白鏈或抗體的核酸中。本發(fā)明的一個更具體的目的是產生轉基因有蹄類動物(例如轉基因牛)，其中輕鏈基因座的恒定區(qū)外顯子和/或μ恒定區(qū)外顯子已被敲除，并且已經穩(wěn)定地摻入了含有編碼另一物種(優(yōu)選人類)免疫球蛋白的基因座的人工染色體。本發(fā)明的一個更具體的目的是利用核轉移和同源重組方法產生克隆有蹄類動物(例如克隆牛)，其中輕鏈基因座的內源恒定區(qū)外顯子和/或重鏈基因座的μ恒定區(qū)外顯子已被敲除，并且穩(wěn)定地導入了包含異種重鏈和輕鏈Ig基因的人工染色體，優(yōu)選含有人重鏈和輕鏈Ig基因座的人類人工染色體，產生了產生另一種物種(優(yōu)選人類)的Ig、而不產生其內源Ig的轉基因有蹄類動物。本發(fā)明的另一目的是產生有蹄類動物(例如牛)的體細胞或胚胎干(ES)細胞，優(yōu)選成纖維細胞或B細胞，更優(yōu)選雄性體細胞，其中內源IgM重鏈基因中的一個或兩個等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的一個相關目的是產生克隆有蹄類動物(例如牛)胎兒和后代，其中所述IgM重鏈基因座中的一個或兩個等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的再一目的是產生有蹄類動物(例如牛)的體細胞或ES細胞，優(yōu)選成纖維細胞或B細胞，例如雌性或雄性體細胞，其中所述IgM重鏈基因中的一個等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的一個相關目的是產生克隆有蹄類動物(例如牛)胎兒或后代，其中所述內源重鏈IgM基因中的一個等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的又一目的是通過讓分別帶有突變例如內源IgM中的一個等位基因被破壞或Ig輕鏈中的一個等位基因被破壞的雄性和雌性有蹄類動物(例如牛)交配，或者通過連續(xù)同源重組，產生雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)胎兒和有蹄類動物幼仔。本發(fā)明的另一目的是產生純合敲除(Homo(同)H/L)胎兒，其中IgM基因的兩個重鏈等位基因以及所述Ig輕鏈的兩個等位基因都通過連續(xù)同源重組或者通過讓上述雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者(M和FHemiH/L)交配而被破壞。本發(fā)明的另一具體目的是插入含有非有蹄類動物Ig或其重鏈或輕鏈的功能表達所必需的基因的核酸(例如人工染色體)。這些Ig最好是通過將編碼這些Ig或Ig鏈的核酸導入Homo或HemiH/L有蹄類動物(例如牛)體細胞(優(yōu)選成纖維細胞)并且產生克隆有蹄類動物(例如克隆牛)而產生的人Ig，其中所述核酸(例如人類人工染色體DNA)被傳遞至種系中。本發(fā)明的再一目的是通過核轉移將含有保證Ig表達的基因的人工染色體(優(yōu)選人類人工染色體(HAC))導入上述純合敲除者(HomoH/L)細胞中，并且產生對免疫應答而表達非有蹄類動物Ig(優(yōu)選人Ig)并且經歷親和性成熟的有蹄類動物(例如牛)。本文所用的“人工染色體”是指具有人工修飾諸如加入選擇標記、加入克隆位點、缺失一個或多個核苷酸、取代一個或多個核苷酸等的哺乳動物染色體或其片段?！叭祟惾斯と旧w(HAC)”是指由一個或多個人染色體產生的人工染色體。人工染色體可以獨立于宿主細胞的內源染色體而在宿主細胞中保持。在這種情況下，HAC可以與內源染色體一道穩(wěn)定地復制和分離?；蛘?，它可能被易位或插入到宿主細胞的內源染色體中?？梢酝瑫r或順序將兩個或兩個以上的人工染色體導入宿主細胞中。例如，可以導入來源于人類14號染色體(包含所述Ig重鏈基因)、人類2號染色體(包含所述Igκ鏈基因)和人類22號染色體(包含所述Igλ鏈基因)的人工染色體?；蛘撸梢詫爰劝惙NIg重鏈基因又包含Ig輕鏈基因的人工染色體，例如ΔHAC或ΔΔHAC。所述重鏈基因座和輕鏈基因座最好位于不同的染色體臂(即位于中心粒的不同側)。在再一優(yōu)選實施方案中，所述HAC的總大小小于或等于大約10、9、8或7兆堿基。本發(fā)明的又一目的是提供來源于轉基因有蹄類動物(例如轉基因牛)的供被動免疫用的人Ig或其它Ig源，所述轉基因有蹄類動物含有并表達在所導入的含有人Ig重鏈和輕鏈基因的核酸(例如人工染色體，優(yōu)選人類人工染色體(HAC))上攜帶的Ig基因。在本發(fā)明中，這些核酸(例如HAC)包括人染色體(人染色體片段)的天然排列的區(qū)段或者包含人工工程化人染色體片段(即它們相對于人類基因組而言可以是重排的)的人工染色體。本發(fā)明的另一目的是用來源于上述轉基因有蹄類動物(例如轉基因牛)的B細胞生產雜交瘤和單克隆抗體。本發(fā)明的再一目的是生產包含多克隆人Ig的有蹄類動物抗血清或乳。這類人Ig、優(yōu)選人IgG可以用作靜脈免疫球蛋白(IVIG)以治療或預防人類疾病。所述多克隆人Ig最好對感興趣的抗原具有反應性。本發(fā)明的又一目的是產生在一個或多個內源基因中具有一個或多個突變的轉基因有蹄類動物。所述轉基因有蹄類動物通過將細胞、得自細胞的染色質或得自細胞的細胞核插入到卵母細胞中而產生。所述細胞在內源基因中具有一個所述細胞天然不表達的第一突變。將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。在其它優(yōu)選實施方案中，通過將包含一個盒的核酸插入到所述細胞中，所述盒包含與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種或多種與待突變內源基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子，從而將所述盒整合到所述基因的一個內源等位基因中，而導入所述第一突變。在其它優(yōu)選實施方案中，通過將包含第一盒的核酸插入到所述細胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與待突變內源基因有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子，從而將所述第一盒整合到所述基因的第一內源等位基因中，而導入所述突變，產生第一轉基因細胞。將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉基因細胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與所述基因有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。第二選擇標記不同于第一選擇標記，將所述第二盒整合到所述基因的第二內源等位基因中，產生第二轉基因細胞。在另外的優(yōu)選實施方案中，從所述胚胎、胎兒或者從所述胎兒產生的后代分離出細胞，并且將另一突變引入所述細胞的基因中。然后用所得的細胞、得自所述細胞的染色質或者得自所述細胞的細胞核，進行第二輪核轉移，產生具有兩個或兩個以上突變的轉基因有蹄類動物。所述突變位于基因的相同或不同等位基因中，或者位于不同基因中。在優(yōu)選實施方案中，被突變的細胞為成纖維細胞(例如胎成纖維細胞)。被突變的內源基因最好與在成纖維細胞中無活性的內源啟動子操作上連接。在其它優(yōu)選實施方案中，與所述被突變的內源基因操作上連接的內源啟動子的活性比與內源管家基因例如GAPDH操作上連接的內源啟動子活性低80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％。啟動子活性可以用任何標準測定來測量，所述測定例如測量所述基因所編碼的mRNA或蛋白的水平(參見例如Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology，volume2，第11.13.1-11.13.3頁，JohnWiley&Sons，1995)。這種產生轉基因有蹄類動物的方法的優(yōu)點是使得在供體細胞(即作為核轉移所用的遺傳材料來源的細胞)中不表達的基因可以被突變。因此，要求保護的本發(fā)明的特征在于具有一種或多種編碼整個或部分異種免疫球蛋白(Ig)基因的核酸的轉基因有蹄類動物，所述基因經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸基本上是人類核酸。所述核酸最好編碼異種抗體，例如人抗體或多克隆抗體。在各種實施方案中，所述Ig鏈或抗體在血清和/或乳中表達。在其它實施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實施方案中，所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在另外的實施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。在其它實施方案中，所述核酸包括未經重排的抗體輕鏈核酸區(qū)段，其中編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。在另外的實施方案中，所述核酸包括未經重排的抗體重鏈核酸區(qū)段，其中或者(i)編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸，和/或(ii)編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。在另一優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物在內源Ig基因、α-(1，3)-半乳糖基轉移酶基因、朊病毒基因和/或J鏈基因中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于具有減少內源抗體表達的突變的轉基因有蹄類動物。所述突變最好減少功能性IgM重鏈的表達，或者基本上消除功能性IgM重鏈的表達。在其它優(yōu)選實施方案中，所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達，或者基本上消除功能性Ig輕鏈的表達。在另外的優(yōu)選實施方案中，所述突變減少功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達，或者所述突變基本上消除功能性IgM重鏈和功能性IgM輕鏈的表達。所述有蹄類動物最好在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中也有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在另一優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，所述基因經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子。所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸基本上是人類核酸。在其它優(yōu)選實施方案中，所述核酸編碼異種抗體，例如得自另一屬的抗體(例如人抗體)或者多克隆抗體。在各種實施方案中，所述Ig鏈或抗體在血清中表達。在其它實施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實施方案中，所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。本發(fā)明也提供得自任何本發(fā)明有蹄類動物的細胞或者可用于產生任何本發(fā)明有蹄類動物的細胞。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于具有一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸的有蹄類動物體細胞，所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸編碼一種異種抗體。在各種實施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實施方案中，所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述細胞的染色體中。在另一實施方案中，所述核酸基本上是人類核酸。所述異種抗體優(yōu)選為得自另一屬的抗體，例如人抗體。所述細胞最好在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。示例性的有蹄類動物細胞包括胎成纖維細胞和B細胞。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于在編碼Ig重鏈和/或輕鏈的核酸中有突變的有蹄類動物體細胞。在優(yōu)選實施方案中，所述細胞在IgM重鏈或所述Ig輕鏈中的一個或兩個等位基因中有突變。示例性的突變包括無義突變和缺失突變。所述細胞最好在在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在優(yōu)選實施方案中，所述細胞也具有一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸優(yōu)選基本上為人類核酸和/或編碼異種抗體，例如得自另一屬的抗體(例如人抗體)。在各種實施方案中，所述核酸包含在染色體片段中，從而使所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。優(yōu)選的染色體片段包括ΔHAC和ΔΔHAC。在另外的實施方案中，所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述細胞的染色體中。示例性的有蹄類動物細胞包括胎成纖維細胞和B細胞。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于通過本發(fā)明的有蹄類動物B細胞與骨髓瘤細胞融合而形成的雜交瘤。所述雜交瘤最好分泌外源抗體，例如人抗體。本發(fā)明也提供用本發(fā)明的有蹄類動物生產抗體的方法。一種這樣的方法涉及給予具有一種或多種編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物一種或多種感興趣的抗原。所述基因座中的所述核酸區(qū)段經歷重排，導致產生對所述抗原特異性的抗體，然后從所述有蹄類動物回收所述抗體。在各種實施方案中，編碼所述異種抗體基因座的核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。所述染色體片段優(yōu)選獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它優(yōu)選實施方案中，所述抗體的輕鏈和/或所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。所述抗體可以為單克隆抗體或者為多克隆抗體。針對特定抗原的單克隆抗體和多克隆抗體有各種各樣的用途；例如，它們可以用作針對致病微生物例如細菌或病毒感染的預防或治療組合物中的組分。在各種實施方案中，從所述有蹄類動物的血清或乳中回收所述抗體。在優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有減少內源抗體表達、減少功能性IgM重鏈表達、或者減少功能性Ig輕鏈表達的突變。所述有蹄類動物優(yōu)選在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在一個相關方面，本發(fā)明的特征在于另一種生產抗體的方法。該方法涉及從具有編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物回收異種抗體。所述基因座中的所述核酸區(qū)段經歷重排，導致產生異種抗體。在各種實施方案中，所述編碼異種抗體基因座的核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。在特定實施方案中，所述核酸獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在特定實施方案中，所述抗體的輕鏈和/或所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。所述抗體可以為單克隆抗體或者為多克隆抗體。在特定實施方案中，無需用特定抗原免疫所述有蹄類動物而產生的多克隆抗體例如IgG抗體，用作用人血清生產的IVIG(靜脈免疫球蛋白)的治療代用品。在各種實施方案中，從所述有蹄類動物的血清或乳中回收所述抗體。所述有蹄類動物優(yōu)選具有減少內源抗體表達、減少功能性IgM重鏈表達、或者減少功能性Ig輕鏈表達的突變。所述有蹄類動物優(yōu)選在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。本發(fā)明也提供用于產生轉基因有蹄類動物的方法。這些方法可以用來產生具有所需突變或者具有所需異種核酸的轉基因有蹄類動物。在一個這樣的方面，本發(fā)明的特征在于一種產生轉基因有蹄類動物的方法，所述方法涉及將細胞、得自細胞的染色質或者得自細胞的細胞核插入到卵母細胞中。所述細胞在內源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中包括一個第一突變。將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。用于產生所述轉基因有蹄類動物的細胞在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在其它實施方案中，所述細胞包括一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸編碼異種抗體。在其它實施方案中，所述核酸整合到所述細胞的染色體中。所述異種抗體優(yōu)選為得自另一屬的抗體，例如人抗體。在特定實施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。在其它特定實施方案中，所述染色體片段獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在上述方面的各種實施方案中，所述方法也包括從所述胚胎、所述胎兒或者由所述胎兒產生的后代分離細胞，并且在所述細胞的內源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中引入第二突變。將所述細胞、得自所述細胞的染色質、或者得自所述細胞的細胞核插入到卵母細胞中，并且將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或者所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。在上述方面的其它實施方案中，用來產生所述轉基因有蹄類動物的細胞通過包括下述步驟的方法制備將具有一個盒的核酸插入所述細胞中，所述盒包括與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子。將所述盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸中的一個內源等位基因中。在其它實施方案中，所述細胞通過將具有第一盒的核酸插入到所述細胞中而產生，所述第一盒包括與編碼第一選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子。將所述第一盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第一內源等位基因中，產生第一轉基因細胞。向所述第一轉基因細胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括與編碼第二選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。所述第二選擇標記不同于所述第一選擇標記。將所述第二盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第二內源等位基因中，產生第二轉基因細胞。再一方面，本發(fā)明的特征在于另一種產生轉基因有蹄類動物的方法。該方法涉及將具有一種或多種異種核酸的細胞插入到卵母細胞中。所述異種核酸編碼整個或部分異種Ig基因，并且所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子。將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。所述編碼整個或部分異種Ig基因的核酸優(yōu)選編碼異種抗體。在其它優(yōu)選實施方案中，所述抗體為多克隆抗體。在另外的優(yōu)選實施方案中，所述免疫球蛋白鏈或抗體在血清和/或乳中表達。在各種實施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。所述核酸可以獨立于宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持或者整合到所述細胞的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它實施方案中，所述異種抗體為得自另一屬的抗體，例如人抗體。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在再一相關方面，本發(fā)明的特征在于另一種產生轉基因有蹄類動物的方法。該方法涉及將細胞、得自細胞的染色質或得自細胞的細胞核插入到卵母細胞中。所述細胞在所述細胞天然不表達的內源基因中包括一個第一突變。將所述卵母細胞或者由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。被突變的基因最好編碼抗體、α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒蛋白或J鏈。在另一優(yōu)選實施方案中，用于產生所述轉基因有蹄類動物的細胞為成纖維細胞，例如胎成纖維細胞。在上述方法的各種實施方案中，所述細胞通過下述步驟制備將具有一個盒的核酸插入到所述細胞中，所述盒包括與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述基因具有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述基因的一個內源等位基因中。在其它實施方案中，所述細胞通過將具有第一盒的核酸插入到所述細胞中而產生，所述第一盒包括與編碼第一選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與所述基因具有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子。將所述第一盒整合到所述基因的第一內源等位基因中，產生第一轉基因細胞。向所述第一轉基因細胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括與編碼第二選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與所述基因具有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。所述第二選擇標記不同于所述第一選擇標記。將所述第二盒整合到所述基因的第二內源等位基因中，產生第二轉基因細胞。在上述方面的其它實施方案中，所述方法也包括將第二突變引入到所述轉基因有蹄類動物中。在這些實施方案中，從所述胚胎、所述胎兒或者由所述胎兒產生的后代分離細胞，并且將第二突變引入到所述細胞的內源基因中。將所述細胞、得自所述細胞的染色質或者得自所述細胞的細胞核插入到卵母細胞中，并且將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。本發(fā)明的有蹄類動物可以用來生產含有感興趣抗體的抗血清或乳。在一個這樣的方面，本發(fā)明的特征在于具有多克隆人免疫球蛋白的有蹄類動物抗血清。所述抗血清優(yōu)選得自牛、綿羊、豬或山羊。在另一優(yōu)選實施方案中，所述Ig針對所需抗原。再一方面，本發(fā)明的特征在于具有多克隆人Ig的有蹄類動物乳。所述乳優(yōu)選得自牛、綿羊、豬或山羊。在另一優(yōu)選實施方案中，所述Ig針對所需抗原。在本發(fā)明各個方面的優(yōu)選實施方案中，所述重鏈是μ重鏈，而所述輕鏈是λ或κ輕鏈。在其它優(yōu)選實施方案中，所述編碼異種免疫球蛋白鏈或抗體的核酸為其未經重排形式。最好是在將感興趣的抗原給予轉基因有蹄類動物后，所述異種免疫球蛋白基因座中的所述核酸區(qū)段重排并且產生與感興趣抗原具有反應性的抗體。在其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物產生不止一類異種抗體。在各種實施方案中，所述有蹄類動物產生不止一種不同的異種Ig或抗體。優(yōu)選的核轉移方法包括將本發(fā)明的細胞、得自所述細胞的染色質或者得自所述細胞的細胞核插入到去核或有核卵母細胞中，并且將所述卵母細胞或者由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或者所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。在本發(fā)明各個方面的其它優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物在內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒和/或J鏈核酸中的一個或兩個等位基因中有突變。所述突變優(yōu)選減少或消除所述內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、半乳糖基(α1，3)半乳糖表位、朊病毒蛋白和/或J鏈的表達。在另外的優(yōu)選實施方案中，所述有蹄類動物含有異種J鏈核酸，例如人J鏈核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選產生含人J鏈的人IgA或IgM分子。在本發(fā)明的各種實施方案中，用來使內源有蹄類動物核酸突變的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與待突變基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子)不包含在病毒載體例如腺病毒載體或腺相關病毒載體中。例如，所述核酸可以包含在質?；蛉斯と旧w中，用不涉及細胞的病毒感染的標準方法例如轉染或者脂轉染法，將所述核酸插入到有蹄類動物細胞中。在再一實施方案中，用來使內源有蹄類動物核酸突變的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種與待突變基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子)包含在病毒載體例如腺病毒載體或腺相關病毒載體中。按照該實施方案，用含有所述病毒載體的病毒來感染有蹄類動物細胞，導致所述病毒載體的一部分或者整個病毒載體插入到所述有蹄類動物細胞中。示例性有蹄類動物包括奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)的成員，例如牛屬(Bos)的任何成員。其它優(yōu)選的有蹄類動物包括綿羊、大角羊、山羊、美洲野牛、羚羊、牛、馬、驢子、騾、鹿、駝鹿、北美馴鹿、水牛、駱駝、美洲駝、羊駝、豬和象。優(yōu)選所述轉基因有蹄類動物表達得自另一屬的免疫球蛋白鏈或抗體，例如得自任何其它哺乳動物的抗體。本文所用的“排列前(pre-arranged)或未經重排形式的核酸”是指尚未經歷V(D)J重組的核酸。在優(yōu)選實施方案中，編碼抗體輕鏈V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。編碼抗體重鏈V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段最好與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸，和/或編碼抗體重鏈D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。未經重排形式的核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它優(yōu)選實施方案中，所述核酸與得自人類的天然存在的核酸的對應區(qū)有至少70％、80％、90％、95％或99％相同。附圖簡述圖1A包括用來產生含有Ig敲除和人類人工染色體的母牛的方法的概述。圖1A中的時間列基于以下的估計制備所述Ig敲除載體和產生敲除細胞需18個月，從所述敲除細胞產生胎兒需2個月，進行后續(xù)的敲除需9個月，妊娠產出幼仔需9個月，在可以從幼仔產生胚胎之前需12個月，而進行HAC轉移需6個月。圖1B包括用來產生在內源Ig基因中有突變并且含有ΔHAC或ΔΔHAC的母牛的方法的概述。對于圖1B中的時間列，估計每周篩選250個集落，在3個月內總共篩選3,000個集落，以便分離雄性和雌性敲除細胞。假設每1,500個集落產生一個或多個敲除集落。純合敲除有蹄類動物可以通過下述方法產生(1)在核轉移之前，將第二Ig突變引入分離的敲除細胞中，(2)在得自胚胎、胎兒(例如妊娠約60天的胎兒)或者由第一輪核轉移產生的后代的細胞中引入第二Ig突變，并且用所得的純合細胞作為第二輪核轉移中的供體細胞，或者(3)讓半合型有蹄類動物交配。在圖1A和1B中，“同”表示純合的；“半”表示半合子的；“H”表示重鏈；“L”表示輕鏈；“HAC”表示人類人工染色體；“HAC1”表示任一種HAC；而“HAC2”表示第二種HAC。圖2A包括按照本發(fā)明的μ(IgM重鏈)敲除構建體。圖2B為得自Holstein牛(荷蘭牛)的免疫球蛋白基因座的限制性圖譜。圖3A和3B包括構建體“pSTneoB”和“pLoxP-STneoB”的示意圖，所述構建體用來產生圖3C中所示的μ敲除DNA構建體。圖3D為在所述μ敲除構建體中用作第一同源區(qū)的基因組牛μ重鏈基因座的1.5kb區(qū)的多核苷酸序列(SEQIDNO47)。圖3E為在所述μ敲除構建體中用作第二同源區(qū)的基因組牛μ重鏈基因座的3.1kb區(qū)的多核苷酸序列(SEQIDNO48)。在該序列中，每個“n”代表任何核苷酸或者無核苷酸。連續(xù)“n”核苷酸區(qū)代表其多核苷酸序列尚未測定的大約0.9-1.0kb的區(qū)。圖3F為嘌呤霉素抗性牛μ重鏈敲除構建體的示意圖。圖3G為牛κ輕鏈cDNA的多核苷酸序列(SEQIDNO60)。在κ輕鏈敲除構建體中可以使用完整的該序列或該序列的一部分。另外，這種κ輕鏈可以用來分離用于κ輕鏈敲除構建體中的基因組κ輕鏈序列。圖4是構建ΔHAC和ΔΔHAC的示意圖。圖5是瓊脂糖凝膠的照片，表明在ΔHAC胎兒中存在編碼人重鏈和輕鏈的基因組DNA。圖6是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Cμ外顯子3和4在妊娠77天的ΔHAC胎兒(胎兒#5996)中的表達。圖7是瓊脂糖凝膠的照片，表明內源牛重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的重排。圖8是瓊脂糖凝膠的照片，表明重排的人重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的表達。圖9是瓊脂糖凝膠的照片，表明由所述人重鏈基因座剪接的恒定區(qū)在ΔHAC胎兒#5996中的表達。圖10是瓊脂糖凝膠的照片，表明重排的人重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的表達。圖11A是得自ΔHAC胎兒#5996的重排人重鏈轉錄物的多核苷酸序列(SEQIDNO49)。圖11B是該序列(“查詢序列”)與人抗肺炎球菌抗體(“待測序列”)(分別為SEQIDNO50和51)的一個區(qū)的序列比對。對于得自ΔHAC胎兒#5996的查詢序列而言，僅顯示了不同于所述人抗肺炎球菌抗體序列的對應核苷酸的那些核苷酸。圖12A和12B是得自ΔHAC胎兒#5996的重排人重鏈轉錄物的另外兩個多核苷酸序列(SEQIDNO52和54)及其導出氨基酸序列(分別為SEQIDNO53和55)。圖13是瓊脂糖凝膠的照片，證明ΔΔHAC胎兒#5580既含有人重鏈免疫球蛋白基因座，又含有人輕鏈免疫球蛋白基因座。圖14是瓊脂糖凝膠的照片，證明ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B既含有人重鏈免疫球蛋白基因座，又含有人輕鏈基因座。圖15是瓊脂糖凝膠的照片，表明從人重鏈基因座剪接的μ恒定區(qū)在ΔΔHAC胎兒#5542A中的表達。圖16是瓊脂糖凝膠的照片，表明所述人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達。圖17是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B中的重排和表達。圖18是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A中的重排和表達。圖19是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達。圖20是得自ΔΔHAC胎兒#5442A的重排人輕鏈轉錄物的多核苷酸序列和相應的導出氨基酸序列(分別為SEQIDNO56和57)。圖21是得自ΔΔHAC胎兒#5442A的重排人輕鏈轉錄物的另外一個多核苷酸序列和相應的導出氨基酸序列(分別為SEQIDNO58和59)。圖22A-22H是ΔΔHAC胎兒#5442A(圖22A-22D)和5442B(圖22E-22H)表達人λ輕鏈和牛重鏈蛋白的FACS分析圖。讓得自這些胎兒的脾的淋巴細胞與藻紅蛋白標記的抗人λ抗體(圖22C和22D)、FITC標記的抗牛IgM抗體(圖22D和22H)或無抗體(圖22A、22B、(22E和22F)反應，然后在FASCalibur細胞分類器上分析。用其中一種所述抗體標記的細胞的百分率顯示在每條頻率曲線的下方。圖23為α-(1，3)-半乳糖基轉移酶敲除載體的示意圖，所述載體用來將嘌呤霉素抗性基因和轉錄終止序列插入到牛細胞中的內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶基因中。圖24是含有外顯子2、3和4、用作所述AAV打靶載體骨架的BamHI-XhoI片段的示意圖。新霉素抗性標記用于通過插入到外顯子4中而對所述基因座進行插入誘變。指示了用來隨后證實正確打靶的PCR引物的退火位點的位置。圖25是構建設計用以除去牛內源IgH序列的腺相關病毒構建體的示意圖。圖26是瓊脂糖凝膠的照片，顯示正確打靶事件的各個轉導克隆的PCR分析。在該實驗中使用的載體示于圖24。指示正確打靶的PCR產物以星號標注。圖27是列出攜帶HAC的胚胎妊娠率的表。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及產生轉基因有蹄類動物，優(yōu)選轉基因牛，其中內源Ig的表達任選地被敲除，并且穩(wěn)定地導入了包含產生另一物種(優(yōu)選人類)的功能性抗體所必需的基因的核酸(優(yōu)選人工染色體)。因而，可以獲得不產生其內源抗體、而產生另一物種抗體的轉基因動物?？梢援a生任何非內源抗體，包括但不限于人類、非人類靈長類動物、狗、貓、小鼠、大鼠或豚鼠的抗體。雖然先前已經報道了在山羊中產生人單克隆抗體，但這并未在牛中、在血清中或在不表達其內源抗體的任何有蹄類動物中實現。此外，在轉基因有蹄類動物中尚未進行種系(未經重排的)重鏈或輕鏈基因的插入、這些基因的重排以及多樣化抗體的表達。不可預測這類有蹄類動物是否能夠生存，因為不能確定人Ig是否被功能表達，或者以足以保證適當免疫應答的量表達。此外，人染色體是否穩(wěn)定地保持在轉基因有蹄類動物中是不確定的。再者，該有蹄類動物(例如牛)的B細胞是否能夠表達或者正確地重排人Ig或其它非內源Ig也是不確定的。在本方法的一個優(yōu)選實施方案中，異種免疫球蛋白的生產基本上通過聯合應用核轉移、同源重組技術和攜帶完整異種Ig基因座的人工染色體的導入來實現。更具體地講，所述方法優(yōu)選包括定向破壞所述IgM重鏈基因中的一個或兩個等位基因，并且任選地定向破壞所述Ig輕鏈基因中的一個或兩個等位基因，雖然異種抗體的生產也可以在野生型動物(即無Ig敲除的動物)中實現?；蚯贸梢酝ㄟ^連續(xù)同源重組、然后通過另一個交配步驟來實現。在一個優(yōu)選實施方案中，這通過最初用合適的同源重組載體實現定向破壞組織培養(yǎng)物中雄性或雌性有蹄類動物(例如牛)胎成纖維細胞的IgM重鏈基因的一個等位基因來實現。胎成纖維細胞的應用優(yōu)于某些其它體細胞，因為這些細胞容易在組織培養(yǎng)物中繁殖和遺傳操作。然而，胎成纖維細胞的應用并不是本發(fā)明所必需的，實際上可以用其它細胞系替代，并且獲得等同的結果。當然，這一方法需要構建具有與靶IgM重鏈等位基因具有同源性的區(qū)的DNA構建體，使得所述構建體在整合到所述有蹄類動物基因組的IgM重鏈等位基因中破壞所述等位基因的表達。用于實現IgM等位基因的這種定向破壞的一種示例性載體在以下實施例中有描述。在這一方面，保證在靶位點同源重組的載體的構建方法是本領域技術人員眾所周知的。此外，在這種情況下，合適載體的構建在本領域的技術范圍內，尤其是已知牛IgM重鏈和Igλ輕鏈基因的序列、也已知得自其它有蹄類動物的免疫球蛋白基因的序列(參見下文)的條件下。為了便于同源重組，用以實現同源重組和所述IgM基因失活的載體分別包含表現出與所述有蹄類動物IgM重鏈和Ig輕鏈基因有顯著序列同一性的DNA部分。這些序列優(yōu)選具有至少98％的序列同一性，更優(yōu)選至少99％的序列同一性，再更優(yōu)選這些序列與靶基因座等基因，以有助于同源重組以及定向缺失或失活。通常并且優(yōu)選所述構建體將包含一個標記基因，所述標記基因保證選擇出其中所述IgM重鏈基因和/或Ig輕鏈基因已被有效破壞的所需同源重組子，例如成纖維細胞。示例性標記基因其中包括抗生素抗性標記、抗藥性標記和綠色熒光蛋白。一種優(yōu)選的構建體示于圖2A，用來制備該構建體的起始材料示于圖3A和3B。用標準分子生物學技術可以產生含有與內源免疫球蛋白基因同源的兩個區(qū)的其它構建體，所述同源區(qū)鄰接與啟動子操作上連接的正選擇標記(例如抗生素抗性基因)，并且將所述構建體用于本發(fā)明的方法中。圖2A和3C中所示的μ敲除構建體，設計用以除去編碼牛免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的外顯子(命名為“C-μ外顯子1-4”)和編碼跨膜結構域的兩個外顯子(命名為“TM外顯子”)。為了構建這種載體，將來自基因組μ重鏈牛序列的名為“1”的區(qū)-Xbal-Xhol片段，亞克隆到預先用酶XbaI和XhoI切割的商業(yè)DNA載體pBluescript(Stratagene，LaJolla，California)中。一旦克隆了該片段，則鄰近XbaI位點有一個NotI限制性酶識別序列，用該序列插入一個約3.5Kb的NotI片段。這一片段含有新霉素抗性標記，在下文有進一步的描述。需要時，可以用得自另一有蹄類動物品種、物種或屬的基因組μ重鏈序列(例如得自SwissBull/Holstein雜種、Genbank登錄號U63637的μ重鏈序列)，來構建其它μ敲除構建體。將片段“1”和新霉素抗性標記一起連接到pBluescript中后，SacI位點保持鄰近新霉素抗性標記。用SacI將所述新構建體線性化，通過用DNA聚合酶補平SacI消化留下的粘性末端將其轉變?yōu)槠蕉?。分離作為XhoI-BstI1071片段的名為“2”的片段，通過用DNA聚合酶補平XhoI和BstI1071酶留下的粘性末端將其轉變?yōu)槠蕉似巍Ｒ坏┩瓿伤鰳嫿?，則最終的構建體分別含有區(qū)2、新霉素抗性標記和區(qū)1。關于牛成纖維細胞的轉染，所述構建體用限制性酶KpnI(在該圖中顯示了兩個KpnI位點)消化，用所述DNA片段進行同源重組。新霉素抗性構建體如下裝配。名為“pSTneoB”的構建體(Katoh等，CellStruct.Funct.12575，1987；日本研究生物制品保藏中心(JapaneseCollectionofResearchBiologicals)(JCRB)保藏號VE039)設計含有處于編碼區(qū)上游的SV40啟動子和TK增強子控制之下的新霉素抗性基因。所述編碼區(qū)下游是SV40終止序列。將neo盒作為XhoI片段從“pSTneoB”切下。在使用標準分子生物學技術將該片段的末端轉變?yōu)槠蕉撕?，將平端片段克隆到載體pBS246(Gibco/LifeTechnologies)的EcoRV位點中。該位點鄰接loxP位點。用命名為“pLoxP-STNeoR”的新構建體來產生所述μ敲除DNA構建體。該構建體的所需片段鄰接pBS246克隆載體中原有的loxP位點和NotI位點。用含有l(wèi)oxP-neo-loxP的所需NotI片段來取代所述免疫球蛋白μ恒定區(qū)外顯子。與新霉素抗性基因操作上連接的SV40啟動子激活新霉素抗性基因的轉錄，使得其中所需NotI片段已經取代了所述μ恒定區(qū)外顯子的細胞根據其所產生的抗生素抗性而被選擇出來。在獲得其中IgM重鏈等位基因已被有效破壞的細胞系后，將其用作核轉移供體，來產生克隆有蹄類動物胎兒(例如克隆牛胎兒)，并且最終產生其中一個IgM重鏈等位基因被破壞的胎兒或動物。此后，可以用從中得到的體細胞，例如成纖維細胞，實現第二輪的基因定向破壞，以便使用相似但含有一種不同選擇標記的載體，產生其中第二IgM重鏈等位基因被失活的細胞。最好在所述第一定向基因破壞的同時，也對第二有蹄類動物(例如牛)體細胞系進行遺傳修飾，所述細胞系同樣可以來源于雄性或雌性。如果操作的第一細胞系是雄性的，則最好修飾雌性細胞系；反之，如果操作的第一細胞系是雌性的，則最好選擇雄性細胞系。再者，所操作的細胞最好包含有蹄類動物(例如牛)胎成纖維細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，對所述雌性胎成纖維細胞進行遺傳修飾，以便引入Igλ輕鏈基因中一個等位基因的定向破壞。這一方法同樣采用具有與所述有蹄類動物(例如牛)Igλ輕鏈同源的區(qū)以及選擇標記的載體來進行，設計所述DNA構建體，使得在整合和與所述內源Ig輕鏈同源重組時，導致靶Igλ輕鏈基因的破壞(失活)。一旦選擇出具有所需定向破壞的雌性成纖維細胞系，則同樣將其用作核轉移的供體細胞，或者將得自這類細胞系的DNA用作核轉移的供體。另一方面，這種細胞可以經過第二輪同源重組，從而用與破壞第一等位基因相似但含有不同選擇標記的DNA構建體來失活所述第二Igλ輕鏈。正如在發(fā)明背景中所論述的，用于實現核轉移、特別是用于產生克隆牛和克隆轉基因牛的方法已有報道，描述于授予Stice等并且轉讓給UniversityofMassachusetts的美國專利5995577。再者，另一方面，可以使用在WO95/16670；WO96/07732；WO97/0669；或WO97/0668中公開的核轉移技術(統稱Roslin法)。Roslin法不同于UniversityofMassachusetts的技術，因為它們使用靜息供體細胞，而不是增殖中的供體細胞。所有這些專利通過引用全部結合到本文中。這些核轉移方法將產生轉基因克隆胎兒，所述胎兒可以用來產生克隆轉基因牛后代，例如包含Ig輕鏈基因和/或IgM基因的至少一個等位基因定向破壞的后代。在創(chuàng)建了這樣的細胞系后，可以用它們來產生雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)胎兒和后代。此外，這些技術并不限于用來產生轉基因牛；上述技術也可以用于其它有蹄類動物的核轉移。在核轉移之后，或者通過讓所述有蹄類動物交配，或者通過使用先前描述的同源打靶載體進行第二次基因打靶，可以實現所需動物的產生。如前所述，本發(fā)明的再一目的涉及創(chuàng)建雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者，其中這類半合敲除者使用已經描述的細胞系來產生。通過讓按照上述方法產生的后代交配，其中讓包含所述IgM重鏈基因的已破壞等位基因的后代與包含所述Ig輕鏈的已破壞等位基因的另一后代交配，可以實現這一點?；蛘?，通過操作從按照上述方法產生的后代獲得的細胞進行第二次基因打靶，可以實現這一點。這將包括通過同源重組定向破壞IgM重鏈基因的等位基因或所述Ig輕鏈的等位基因的實現。在產生包含雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)的細胞系后，用所述細胞系產生包含這樣一種敲除的胎兒或幼仔。如上所述，這或者通過交配或者通過第二次基因打靶來實現。一旦獲得雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者，則可以用得自這些動物的細胞來創(chuàng)建純合敲除(HomoH/L)胎兒。這又或者通過順序基因打靶或者通過交配來實現。從本質上講，如果通過交配來實現，則這將包括讓雄性重鏈和輕鏈半合敲除者與雌性重鏈和輕鏈半合敲除者交配，并且選擇包含純合敲除的后代。另一方面，可以在組織培養(yǎng)物中對得自上述半合敲除者的細胞進行操作，以便敲除所述IgM或Ig輕鏈(λ鏈)基因的另一等位基因。優(yōu)選進行第二次基因打靶，而不是交配，因為這可以獲得更為快速的結果，尤其是在有蹄類動物例如牛的妊娠期相對長的條件下。一旦獲得了純合敲除者(HomoH/L)，則利用它們來導入含有用來產生特定物種(例如人類)抗體的基因(優(yōu)選整個基因座)的所需核酸。優(yōu)選使用人類人工染色體，例如在WO97/07671(EP0843961)和WO00/10383(EP1106061)中公開的那些人類人工染色體。這些人類人工染色體在相應的已授予的日本專利JP30300092中也有描述。這兩個申請都通過引用全部結合到本文中。此外，含有并表達人免疫球蛋白基因的人工人類染色體的構建公開于Shen等，Hum.Mol.Genet.6(8)1375-1382(1997)；Kuroiwa等，NatureBiotechnol.18(10)1086-1090(2000)；和Loupert等，Chromosome107(4)255-259(1998)，所有這些文獻通過引用全部結合到本文中。人類人工染色體也可以用來將異種抗體基因導入野生型動物細胞中；這采用上述方法來完成。將人工染色體導入到動物細胞中，尤其是胎成纖維細胞中，可以通過本文所述的微細胞融合來進行。在應用人類人工染色體的一個替代方法中，使用YAC載體、BAC載體或粘粒載體，可以將編碼免疫球蛋白基因的核酸整合到染色體中?？梢杂靡阎椒?，例如電穿孔、脂轉染、與包含YAC載體的酵母原生質球融合等，將包含異種Ig基因的載體(WO98/24893，WO96/33735，WO97/13852，WO98/24884)導入胎成纖維細胞中。此外，可以將包含異種Ig基因的載體打靶至所述胎成纖維細胞的內源Ig基因座中，導致同時導入所述異種Ig基因和破壞所述內源Ig基因。也可以如Lonberg等(參見上文)的專利中所述，實現編碼異種免疫球蛋白基因的核酸的整合。在用以將異種免疫球蛋白基因插入到宿主有蹄類動物染色體中的“敲入”構建體中，可以將一種或多種免疫球蛋白基因和抗生素抗性基因與在被所述構建體轉染的細胞類型中有活性的啟動子操作上連接。例如可以使用組成型活性、誘導型或組織特異性啟動子來激活所整合抗生素抗性基因的轉錄，使得轉染細胞可以根據其所產生的抗生素抗性而被選擇出來。另一方面，可以使用其中含有所述Ig基因和所述抗生素抗性基因的敲入盒不與啟動子操作上連接的敲入構建體。在這種情況下，根據所產生的在所述內源啟動子控制之下所述抗生素抗性標記的表達，可以選擇出其中敲入盒整合到內源啟動子下游的細胞。這些被選出的細胞可以用于本文所述的核轉移方法中，以產生含有整合到宿主染色體中的異種免疫球蛋白基因的轉基因有蹄類動物。采用相似的方法，有可能產生和插入含有供不同物種(其中例如狗、貓、其它有蹄類動物、非人類靈長類動物)Ig表達用的基因的人工染色體。如上所述并且如本領域已知的，眾所周知不同物種的免疫球蛋白基因在不同物種之間表現出大致的序列同源性。一旦確定了所插入的人工染色體(例如人類人工染色體)已經穩(wěn)定地導入細胞系(例如牛胎成纖維細胞)，則它可以用作核轉移的供體。這可以通過PCR法來確定。同樣，獲得包含純合敲除、并且還包含穩(wěn)定導入的核酸(例如人類人工染色體)的動物。在得到包括穩(wěn)定摻入的核酸(例如人類人工染色體)的幼仔后，檢驗所述動物，以確定它們是否對免疫和親和性成熟應答而表達人Ig基因。也可以進行以上概述方法的改進方法。例如，可以首先導入異種Ig基因，然后可以將內源Ig基因失活。此外，可以讓保留異種Ig基因的動物與其中內源Ig基因被失活的動物交配。雖然上文已經描述了將在本本發(fā)明中使用的方法，但是所使用的技術在下文有更詳細的描述。提供這些實施例是為了說明本發(fā)明，不應解釋為是限制性的。特別是，雖然這些實施例集中于轉基因牛，但是可以使用所述方法來產生和檢驗任何轉基因有蹄類動物。產生表達人Ig的轉基因有蹄類動物的敲除法如上所述，本發(fā)明涉及HomoH/L胎兒或幼仔的產生。該方法概述于圖1。其中概述了三個流程。第一個流程依靠再生的胎兒細胞系中的連續(xù)敲除。該方法在技術上最難，且危險水平最高，但是如上所述，潛在地比育種法更快地得到結果。其它兩個流程依靠將動物配種。在第二個流程中，在雄性和雌性細胞系中僅分別需要重鏈基因和輕鏈基因的一次敲除。這一流程不依靠細胞系的再生，是最簡單的技術，但需要最長的時間來完成。流程3介于流程1和流程2之間。在所有流程中，僅產生HomoH/L胎兒，因為在HomoH/L敲除幼仔的生存和維持方面有潛在的困難。如有必要，可以用被動免疫療法來提高HomoH/L敲除幼仔的存活率。實驗設計本發(fā)明優(yōu)選涉及雄性半合重鏈敲除者(MHemiH)和半合子雌性輕鏈敲除者(FHemiL)的產生、以及由這些定向缺失產生40天的胎兒。收獲得自所述胚胎的細胞，在MHemiH細胞中所述輕鏈基因座中的一個等位基因被打中，而在FHemiL細胞中所述重鏈基因座中的一個等位基因被打中，產生在H和L基因座中都有半合子缺失的細胞(HemiH/L)。用這些細胞來得到40天的胎兒，從所述胎兒分離成纖維細胞。用其它H鏈等位基因對MHemiH/L成纖維細胞打靶，以創(chuàng)建MHomoH/HemiL，而用其它L鏈等位基因對FHemiH/L打靶，以創(chuàng)建FHomoL/HemiH。為了創(chuàng)建純合缺失，使用較高的藥物濃度來驅動純合打靶。然而，有可能這種方法不會成功，并且育種可能是必不可少的。一種依靠選擇盒的cre/lox打靶的示例性策略，使得可以將相同的選擇性系統用于不止一個靶缺失?？寺∵@些成纖維細胞，收獲40天的胎兒，然后分離成纖維細胞。對得自這種克隆的胎兒細胞打靶，產生或者H基因座或者L基因座的純合缺失，產生MHomoH/L和FHomoH/L胎成纖維細胞?？寺∵@些成纖維細胞，得到40天的胎兒，然后分離成纖維細胞。然后用HomoH/L胎成纖維細胞，任選地利用育種法來摻入所述HAC。文庫構建用胎成纖維細胞構建基因組文庫。盡管已報道重要的是打靶構建體與用于克隆的細胞等基因，但它對于本發(fā)明而言并非是必需的。例如，可以用等基因、基本等基因或非等基因構建體來產生內源免疫球蛋白基因中的突變。在一個可能的方法中，使用與其它牛品種相比遺傳上有高水平近交的Holstein牛。我們在不同動物中沒有檢測到免疫球蛋白基因的任何多態(tài)性。這提示，序列同源性應該高，并且用非等基因構建體打靶應該能成功。由一個雄性細胞系和一個雌性細胞系構建文庫，同時進行“克隆性”檢驗。設想了在該方法結束時，將產生一個文庫，并且將檢驗眾多不同的胎兒細胞系，選擇一個細胞系作為供克隆用的最佳細胞系。用從所述胎成纖維細胞分離的高分子量DNA構建基因組文庫。將DNA進行大小分級分離，將20-23Kb的高分子量DNA插入到λ噬菌體載體λZap或λFix中。本發(fā)明人用Stratagene制備的文庫取出了很大成功。因此，分離DNA，將經大小選擇的DNA送至Stratagene用于文庫制備。為了分離含有牛重鏈和輕鏈的克隆，使用放射性標記IgMcDNA和放射性標記輕鏈cDNA。另外，在必需缺失輕鏈基因座時，分離輕鏈基因組克隆。對每個胎細胞文庫篩選含有牛重鏈和輕鏈的克隆?？紤]了篩選大約105-106噬斑應該導致分離出含有或者重鏈或者輕鏈基因座的克隆。一旦分離出，則將兩個基因座亞克隆到pBluescript中，制作限制性圖譜。Holstein牛中這些基因座的限制性圖譜于圖2B中提供(Knight等JImmunol140(10)3654-9，1988)。另外，制作得自所獲克隆的圖譜，用來裝配所述打靶構建體。打靶構建體的產生一旦分離出重鏈和輕鏈基因，則制備構建體。通過缺失IgM恒定區(qū)膜結構域，制備IgM構建體。正如Rajewsky及其同事用小鼠所表明的，IgM膜結構域的缺失導致B細胞發(fā)育的阻斷，因為表面IgM是B細胞繼續(xù)發(fā)育所需的信號(Kitamura等，Nature350423-6)。因此，純合IgM牛缺乏B細胞。這不應該成為問題，因為在本發(fā)明的策略中，缺乏功能性Ig的動物活著出生并非必需。然而，如有必要，可以用被動免疫療法來改進動物的存活率，直至導入人Ig基因座的最后一個步驟。用以實現IgM重鏈等位基因敲除的一種示例性打靶構建體示于以下圖2A中。對于重鏈，所述膜IgM結構域用鄰接loxP位點的新霉素盒取代。將所連接的膜結構域與新霉素盒剪接在一起，使得所述膜結構域具有一個緊接loxP位點5’插入的TAG終止密碼子，從而確保所述膜結構域被失活。將其與大約5-6千堿基3’染色體DNA一起置于所述打靶構建體的5’端。如果提高藥物濃度并未達到或者IgM重鏈或者輕鏈的第二等位基因缺失，則使用cre/lox系統(在Sauer，1998，Methods14381-392中有綜述)來缺失所述選擇標記。如下所述，cre/lox系統允許定向缺失所述選擇標記。使所有選擇標記鄰接loxP序列，以便于必要時缺失這些標記。輕鏈構建體含有牛λ鏈恒定區(qū)(例如在Genbank登錄號AF396698中發(fā)現的λ輕鏈恒定區(qū)或任何其它有蹄類動物λ輕鏈恒定區(qū))和鄰接loxP位點的嘌呤霉素抗性基因盒，并且將用鄰接loxP位點的嘌呤霉素盒取代所述牛基因。λ恒定區(qū)基因3’的約5-6千堿基DNA將被嘌呤霉素抗性基因3’的DNA取代。所述嘌呤霉素抗性基因將在5’端和3’端都帶有l(wèi)oxP位點，以便于必要時進行缺失。由于在有蹄類動物抗體基因之間有高度的同源性，故此預計在Genbank登錄號AF396698中的牛λ輕鏈序列將與得自種類繁多的有蹄類動物的基因組λ輕鏈序列雜交，因而可以用于標準方法中，以分離各種有蹄類動物λ輕鏈基因組序列。這些基因組序列可以用于標準方法例如本文所述的方法中，來產生用以失活任何有蹄類動物中的內源λ輕鏈的敲除構建體。κ輕鏈敲除構建體可以同樣使用圖3G中的牛κ輕鏈序列或任何其它的有蹄類動物κ輕鏈序列來構建。這種牛κ輕鏈可以用作雜交探針，來從各種各樣的有蹄類動物中分離基因組κ輕鏈序列。這些基因組序列可以用于標準方法例如本文所述的方法中，來產生用以失活任何有蹄類動物中內源κ輕鏈的敲除構建體?？梢匀芜x地使另外的有蹄類動物基因突變或失活。例如，可以敲除有蹄類動物內源IgJ鏈基因，從而防止給予人類的本發(fā)明抗體中所述有蹄類動物IgJ鏈的潛在抗原性。為了構建所述打靶載體，可以使用在Genbank登錄號U02301中發(fā)現的牛IgJ鏈區(qū)的cDNA序列。這一cDNA序列可以用作探針，來從BAC文庫例如RPC1-42(BACPACinOakland，CA)分離牛IgJ鏈的基因組序列，或者從任何其它有蹄類動物中分離所述J鏈的基因組序列。另外，可以將人J鏈編碼序列導入本發(fā)明的有蹄類動物中，以進行人IgA和IgM分子的功能性表達。人J鏈的cDNA序列可從Genbank登錄號AH002836、M12759和M12378中獲得。可以用標準方法，例如本文所述的方法，將這種序列插入到有蹄類動物胎成纖維細胞中。例如，可以將HAC、YAC載體、BAC載體、粘粒載體或敲入構建體中的人J鏈核酸整合到有蹄類動物內源染色體中，或者獨立于有蹄類動物內源染色體而保持。所得的轉基因有蹄類動物細胞可以用于本文所述的核轉移法中，以產生具有減少或消除有蹄類動物功能性J鏈表達的突變并且含有表達人J鏈的異種核酸的所需有蹄類動物。另外，可以使有蹄類動物α-(1，3)-半乳糖基轉移酶基因突變，以減少或消除由α-(1，3)-半乳糖基轉移酶產生的半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表達。如果本發(fā)明的有蹄類動物所產生的人抗體被這種糖表位修飾，則這些糖基化抗體在作為治療藥給予人類時，被接受者體內與所述糖表位反應的抗體失活或消除。為了消除這種對所述糖表位的可能的免疫應答，可以用牛α-(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的序列來設計用以失活有蹄類動物中該基因的敲除構建體(Genbank登錄號J04989；Joziasse等，J.Biol.Chem.264(24)14290-7，1989)。在美國專利6,153,428和5,821,117中公開的這種牛序列或者豬α-(1，3)-半乳糖基轉移酶序列，可以用來從各種各樣有蹄類動物中獲得基因組α-(1，3)-半乳糖基轉移酶序列，以產生半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表達減少或消除的其它有蹄類動物。必要時，可以使有蹄類動物朊病毒基因突變或失活，從而降低諸如牛海綿狀腦病(BSE)的感染的潛在危險。為了構建所述打靶載體，可以使用牛朊病毒基因的基因組DNA序列(Genbank登錄號AJ298878)?；蛘撸梢杂眠@種基因組朊病毒序列，從其它有蹄類動物中分離基因組朊病毒序列?？梢允褂脴藴史椒?，例如本文所述的方法或者提示用于敲除綿羊α-(1，3)-半乳糖基轉移酶基因或者朊病毒基因的方法(Denning等，NatureBiothech.，19559-562，2001)，使朊病毒基因失活。為了對每個基因座的第二等位基因打靶，如果第一選擇標記留在所述細胞中，則可能必需裝配含有不同選擇標記的一種新的打靶構建體。如表1所述，可獲得各種各樣的選擇策略，將其進行比較，選擇出合適的選擇系統。最初，通過提高藥物濃度(例如使藥物濃度加倍)，靶向第二等位基因。如果不成功，則可以使用一種新的打靶構建體?？梢圆捎酶鞣N方法，將上述其它的突變或基因失活摻入到本發(fā)明的有蹄類動物中。一旦對于每個所需突變產生了轉基因有蹄類動物細胞系，則可以使用雜交育種，將這些另外的突變摻入到本發(fā)明的有蹄類動物中?；蛘?，具有這些另外的突變的胎成纖維細胞可以用作起始材料，來敲除內源Ig基因和/或導入異種Ig基因。此外，在內源Ig基因中具有一個敲除突變和/或含有異種Ig基因的胎成纖維細胞，可以用作這些另外的突變或失活的起始材料。Ig基因座的定向缺失例如通過電穿孔，將打靶構建體導入胚胎成纖維細胞中。利用合適的抗生素，選擇摻入了所述打靶載體的細胞。將根據生長選擇出抗所選藥物的克隆。然后這些克隆用更昔洛韋進行負選擇，這將選擇出已經適當整合的那些克隆?；蛘撸ㄟ^PCR選擇經得住所述藥物選擇的克隆。估計必需篩選至少500-1000個克隆，以便發(fā)現被適當打中的克隆。本發(fā)明人的估計基于Kitamura(Kitamura等，Nature350423-6，1991)的論文，Kitamura發(fā)現，當對IgM重鏈恒定區(qū)的膜結構域打靶時，大約1/300的neo抗性克隆被正確打中。因此，建議在96孔板中，以10個克隆一組將克隆混合，并且對10個克隆的庫篩選所選擇的被打中的克隆。一旦鑒定出陽性克隆，則對從混合克隆分離出的單個克隆進行篩選。這種策略應該能夠鑒定出被打中的克隆。因為成纖維細胞在培養(yǎng)物中遷移，所以當每個培養(yǎng)皿有超過大約10個克隆時，難以鑒別單個克隆。此外，可以開發(fā)用于以高效轉染克隆繁殖的策略?？梢允褂脦追N合理的策略，例如稀釋克隆法?？顾幮詷擞浀腃re/Lox切除如上所述，示例性打靶構建體含有鄰接loxP位點的選擇標記，以便于用cre/lox系統有效地缺失所述標記。通過電穿孔，用含Cre的質粒轉染帶有所述打靶載體的胎成纖維細胞?？梢允褂米罱枋龅暮蠫FPcre融合基因的Cre質粒[GagnetenS.等，NucleicAcidsRes253326-31(1997)]。這使得可以快速選擇含有Cre蛋白的所有克隆?；蛘咄ㄟ^FACS分選，或者通過經顯微操作人工收獲發(fā)綠色熒光的細胞，選擇這些細胞。預計綠色的細胞攜帶活性轉錄的Cre重組酶，因此缺失抗藥性標記。將根據Cre表達選擇的細胞克隆，并且通過PCR分析，分析克隆的抗藥性標記的缺失情況。讓經測定經歷了切除的那些細胞生長為小克隆，將其分瓶，并且在選擇培養(yǎng)基中檢驗一個等份樣品，從而肯定地確定抗藥性基因已經缺失。用其它等份樣品進行下一輪的定向缺失。表1選擇標記和供選擇用的藥物基因藥物NeorG4181Hph潮霉素B2Puro嘌呤霉素3Ecogpt霉酚酸4Bsr殺稻瘟素S5HisD組氨醇6DT-A白喉毒素71SouthernPJ，BergP.1982.TransformationofmammaliancellstoantibioticresistancewithabacterialgeneundercontroloftheSV40earlyregionpromoter(用SV40早期區(qū)啟動子控制下的細菌基因將哺乳動物細胞轉化為抗生素抗性).JMolAppIGenet1327-41。2SanterreRF，AllenNE，HobbsJNJr，RaoRN，SchmidtRJ.1984.ExpressionofprokaryoticgenesforhygromycinBandG418resistanceasdominant-selectionmarkersinmouseLcells(作為顯性選擇標記的潮霉素B和G418抗性的原核基因在小鼠L細胞中的表達).Gene30147-56。3WirthM，BodeJ，ZettlmeisslG，HauserH.1988.Isolationofoverproducingrecombinantmammaliancelllinesbyafastandsimpleselectionprocedure(通過一種快速而簡單的選擇法分離過量生產的重組哺乳動物細胞系).Gene73419-26。4DrewsRE，KolkerMT，SacharDS，MoranGP，SchnipperLE.1996.Passagetononselectivemediatransientlyaltersgrowthofmycophenolicacid-resistantmammaliancellsexpressingtheescherichiacolixanthine-guaninephosphoribosyltransferasegeneimplicationsforsequentialselectionstrategies(在非選擇培養(yǎng)基上傳代瞬時改變了表達大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因的霉酚酸抗性哺乳動物細胞的生長順序選擇策略的意義).AnalBiochem235215-26。5KarremanC.1998.Newpositive/negativeselectablemarkersformammaliancellsonthebasisofBlasticidindeaminase-thymidinekinasefusions(基于殺稻瘟素脫氨酶-胸苷激酶融合的供哺乳動物細胞用的新型正/負選擇標記).NucleicAcidsRes262508-10。6HartmanSC，MulliganRG.1988.Twodominant-actingselectablemarkersforgenetransferstudiesinmammaliancells(在哺乳動物細胞中基因轉移研究用的兩種顯性開放選擇標記).ProcNatlAcadSciUSA858047-51。7YagiT，NadaS.，WatanabeN，TamemotoH，KohmuraN，IkawaY，AizawaS.1993.AnovelnegativeselectionforhomologousrecombinantsusingdiphtheriatoxinAfragmentgene(一種使用白喉毒素A片段基因的同源重組子的新型負選擇).AnalBiochem21477-86。應用打靶策略改變其它有蹄類動物的免疫球蛋白基因為了改變其它有蹄類動物的免疫球蛋白基因，設計打靶載體，使其含有三個主要區(qū)域。第一區(qū)與靶基因座同源。第二區(qū)為特異性取代靶基因座的一部分的藥物選擇標記。第三區(qū)同第一區(qū)一樣，與靶基因座同源，但是不與野生型基因組中的第一區(qū)相鄰。打靶載體與所需野生型基因座之間的同源重組，導致打靶載體中提供的兩個同源區(qū)之間的基因座序列缺失并且該序列被抗藥性標記所取代。在優(yōu)選實施方案中，這兩個同源區(qū)的總大小大約為6千堿基，取代靶基因座一部分的第二區(qū)的大小約為2千堿基。這種打靶策略可廣泛地用于從原核細胞至人細胞的種類繁多的物種。所用的每種載體的唯一性在基因打靶法所選擇的基因座和該策略中所使用的序列中。這一方法可用于所有有蹄類動物，包括但不限于山羊(Caprahircus)、綿羊(Ovisaries)和豬(Susscrufa)以及牛(Bostaurus)。應用電穿孔對有蹄類動物細胞中的特定基因打靶，也可以廣泛用于有蹄類動物。本文所述的通用方法適用于將靶突變引入其它有蹄類動物的基因組中。電穿孔條件(電壓和電容)的改進條件可以用來對從其它有蹄類動物獲得的轉染子數目進行優(yōu)化。另外，在此用來對牛中重鏈基因座打靶(即使用含與緊接被除去外顯子側翼區(qū)同源的區(qū)的載體除去所有編碼外顯子和間插序列)的策略在其它有蹄類動物也可以同樣好地應用。例如，已經對綿羊(Ovisaries)的免疫球蛋白重鏈基因座進行了廣泛的序列分析，所述綿羊基因座與?；蜃诮Y構和序列方面非常相似(Genbank登錄號Z71572、Z49180-Z49188、M60441、M60440、AF172659-AF172703)。除了已報道的關于重排的Ovisaries免疫球蛋白鏈的大量cDNA序列之外，還報道了關于所述重鏈基因座、包括重鏈5’增強子(Genbank登錄號Z98207)、3’μ轉換區(qū)(Z98680)和5’μ轉換區(qū)(Z98681)的基因組序列信息。綿羊分泌形式重鏈的完整mRNA序列已經以登錄號X59994錄入。這一錄入的序列含有四個編碼外顯子的全序列，它們與相應的牛序列高度同源。關于所述綿羊基因座的信息從Genbank獲得，用來確定與牛序列高度同源的區(qū)域，以供設計用于PCR分析的引物。因為使用非等基因DNA對牛細胞打靶，發(fā)現與綿羊序列高度同源的區(qū)用作牛品種之間序列可能相似保守的指標。已知牛和綿羊免疫球蛋白基因座的序列和結構之間有相似性，則可以預期，用以除去牛免疫球蛋白基因座的打靶策略可以成功地應用于所述綿羊系統。另外，關于豬(Susscrofa，登錄號S42881)和山羊(Caprahircus，登錄號AF140603)的現有信息表明，這兩個物種的免疫球蛋白基因座也與所述牛基因座足夠相似，因此可以利用本發(fā)明的打靶策略。插入HAC的方法重要的是，獲得含有人類人工染色體序列(#14fg.、#2fg.和#22fg.)的雄性和雌性牛胎成纖維細胞系并且對其進行選擇，用來從這些細胞系產生克隆幼仔。例如，可以同時或者順序導入得自人類14號染色體的HAC(＂#14fg，包含Ig重鏈基因)、人類2號染色體(＂#2fg，包含Igκ鏈基因)和人類22號染色體(＂#22fg＂，包含Igλ鏈基因)。通過讓雄性#14fg.動物與雌性#2fg.和#22fg.動物交配，并且評估后代，檢驗這些染色體片段的遺傳。如果遺傳成功，則讓這兩個系交配，以產生含有所有三種染色體片段的系。也可以將#14fg.、#2fg.和#22fg.染色體片段插入到HomoH/L胎兒細胞中，用來產生克隆幼仔，或者讓轉基因HAC幼仔與HomoH/L幼仔雜交。另一方面，可以如實施例2所述，導入其它HAC，例如ΔHAC或ΔΔHAC，或者用任何其它染色體轉移法將其導入。原理HAC的種系遺傳應該可用來將所述HAC導入Ig敲除動物以及在生產畜群中繁殖動物。對通過種系繁殖HAC的擔憂是在減數分裂期間染色體物質不完全配對。然而，如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722，2000)所指明的，種系遺傳在小鼠中已經獲得成功。圖1A中概述的策略包括將#14fg.插入到雄性細胞系中，而將#2fg.和#22fg.分別插入到雌性細胞系中。產生保留HAC的幼仔，可以通過雌性和雄性檢驗種系遺傳。一部分所得后代(～25％)應該既含有重鏈HAC，又含有輕鏈HAC。進一步的雜交應該產生含有所有三種染色體片段的幼仔系。用這些動物與如先前所述從胎兒細胞中產生的HomoH/L動物雜交。實驗設計從細胞系的初次篩選獲得細胞。這些細胞可以是Holstein牛細胞或者是與上述所用的不同的系。這允許雜交，同時盡可能地在畜群中保持大量的遺傳變異。然后將HAC導入細胞系中并且選擇陽性細胞系。選出的細胞系用于核轉移，并且產生幼仔。從12月齡開始，收集精子和卵，讓其受精，然后轉移到受體動物中。取細胞樣品進行DNA標記分析和核型分析。在分娩之前，取血樣，分析人Ig蛋白的存在。如上所述，也可以用在上述實驗中開發(fā)的方法，將HAC轉移到HomoH/L細胞系中。人Ig表達的檢驗本實驗的目的是產生雄性HomoH細胞和克隆胎兒，以便將一種或多種同時含有人IgH和人IgL基因座的HAC(例如HAC#14fg.和#22fg.)插入到HomoH細胞中并且產生幼仔，然后檢驗對免疫應答的人Ig表達和親和性成熟。這可如下進行。實驗設計從如前所述產生的HemiH細胞，產生HomoH細胞?；蛘咄ㄟ^抗生素選擇，或者通過第二次插入，產生雙敲除者。如前所述將HAC轉移到這些細胞中。通過核轉移產生幼仔。對保留HAC的幼仔的檢驗在出生后不久開始，并且包括(1)評價人Ig表達，(2)對免疫的應答，(3)親和性成熟，和(4)所述HAC遺傳至后代的情況。通過讓動物配種，并且通過ELISA、RT-PCR或FACS分析人重鏈和輕鏈表達的存在，監(jiān)測人Ig的表達。一旦確定了所述動物產生人Ig，則用加有佐劑的破傷風類毒素免疫動物。在免疫后，每周給動物放血一次，通過ELISA或FACS測定對抗原的應答，并且與在免疫前收集的原放血樣品進行比較。初次免疫后一個月，用含水形式的所述抗原給動物加強免疫。加強免疫后一周，給動物放血，通過ELISA或FACS測量對抗原的應答，并且將其與原放血樣品進行比較。ELISA或FACS分析提供對大多數應答的效價以及所產生的重鏈同種型的測量。這一數據提供對抗體效價的增加以及類別轉換發(fā)生的測量。也測量平均親和力的估計量，以確定在對抗原應答期間是否發(fā)生親和性成熟。在如上所述獲得轉基因牛之后，用它們來生產轉基因Ig，優(yōu)選人Ig，但有可能生產其它物種(例如狗、貓、非人類靈長類動物、其它有蹄類動物諸如綿羊、豬、山羊、鼠類例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等)的Ig。正如所知的，已知Ig基因在物種間是保守的。含有異種抗體的轉基因抗血清和乳所述牛(或其它有蹄類動物)產生針對內源性暴露的任何抗原的轉基因抗血清，或者針對外源給予的抗原的轉基因抗血清。例如，可以將抗原給予所述有蹄類動物，以生產與所述抗原反應的所需抗體，所述抗原包括例如病原體(例如細菌、病毒、原生動物、酵母或真菌)的抗原、腫瘤抗原、受體、酶、細胞因子等。用于抗體生產的示例性病原體包括但不限于肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、免疫缺陷病毒(例如HIV)、皰疹病毒、細小病毒、腸道病毒、埃博拉病毒(ebolavirus)、狂犬病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、鏈球菌屬(Streptococcus)(例如肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae))、嗜血菌屬(Haemaphilus)(例如流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)(例如腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitis))、白喉棒桿菌(Coryunebacteriumdiptheriae)、嗜血菌屬(Haemophilus)(例如百日咳嗜血菌(Haemophiluspertussis))、梭菌屬(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinium))、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))和呼吸道合胞病毒(RSV)?？梢詫⒁环N或多種病原體給予轉基因有蹄類動物，以產生可用于預防、穩(wěn)定或治療特定疾病的超免疫血清。例如，可以將與兒童呼吸道感染相關的病原體給予轉基因有蹄類動物，以產生與這些病原體(例如肺炎鏈球菌、流感嗜血菌和/或腦膜炎奈瑟氏球菌)反應的抗血清。在給予所述有蹄類動物之前，可以任選地處理這些病原體，以降低其毒性(例如通過暴露于熱或化學藥品例如甲醛)。為了產生廣譜Ig，可以將各種各樣的病原體(例如多種細菌和/或病毒病原體)給予轉基因有蹄類動物。這種超免疫血清可以用來預防、穩(wěn)定或治療哺乳動物(例如人類)的感染，尤其可用來治療具有遺傳性或獲得性免疫缺陷的哺乳動物。另外，通過本發(fā)明的方法產生的抗體可以用來抑制免疫系統，例如以治療神經病，以及消除特定的人細胞和調節(jié)特定的分子。例如，抗獨特型抗體(即抑制其它抗體的抗體)和與T細胞、B細胞或細胞因子反應的抗體，可以用來治療自身免疫病或神經病(例如由于炎癥引起的神經病)。這些抗體可以從尚未給予抗原的轉基因有蹄類動物中獲得，或者它們可以從已經給予了抗原例如B細胞、T細胞或者細胞因子(例如TNFα)的轉基因有蹄類動物中獲得。從尚未給予抗原的轉基因有蹄類動物產生的轉基因抗血清，可以用來生產包含人多克隆抗體、優(yōu)選人IgG分子的藥物。這些人抗體可以用來替代從人類中分離的抗體，例如靜脈免疫球蛋白(IVIG)治療藥?？梢匀芜x地對轉基因抗血清進行與一種或多種感興趣抗原反應的抗體的富集。例如，可以用標準技術，例如Ausubel等所述的技術(CurrentProtocolsinMolecularBiology，volume2，p.11.13.1-11.13.3，JohnWiley&Sons，1995)，純化所述抗血清。優(yōu)選的純化方法包括用抗原或抗體包被的微珠沉淀、柱層析例如親和層析、磁珠親和純化和用板結合抗原進行淘選。另外，可以讓所述轉基因抗血清與一種或多種感興趣抗原接觸，根據抗體/抗原復合物的增加的大小，可以從未結合抗體中分離出結合抗原的抗體。也可以用蛋白A和/或蛋白G來純化IgG分子。如果內源抗體的表達未被消除，則可以用蛋白A和/或抗人Ig輕鏈λ的抗體(Pharmingen)，從內源有蹄類動物抗體或有蹄類動物/人類嵌合抗體中分離出所需的人抗體。蛋白A對人Ig重鏈的親和力大于對牛Ig重鏈的親和力，因而可以用來從含有一條或兩條有蹄類動物重鏈的其它抗體中分離含有兩條人重鏈的所需Ig分子?？谷薎g輕鏈λ的抗體可以用來從具有一條或兩條有蹄類動物Ig輕鏈的抗體中分離具有兩條人Igλ鏈的所需Ig分子。另外或者另一方面，可以在一個負選擇步驟中使用一種或多種對有蹄類動物Ig重鏈或輕鏈特異性的抗體，以除去含有一條或兩條有蹄類動物重鏈和/或輕鏈的Ig分子。所得的抗血清本身可以用于針對抗原的被動免疫。或者，所述抗血清具有診斷、預防或純化用途，例如用于達到純化抗原。另一方面，在給予抗血清后，可以從所述轉基因牛中分離出B細胞，將其用于雜交瘤的制備。例如，可以用標準技術，將得自轉基因有蹄類動物的B細胞與骨髓瘤融合，產生分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤(Mocikat，J.Immunol.Methods225185-189，1999；Jonak等，Hum.AntibodiesHybridomas3177-185，1992；Srikumaran等，Science220522，1983)。優(yōu)選的雜交瘤包括通過B細胞與得自與所述轉基因有蹄類動物同一屬或同一物種的哺乳動物的骨髓瘤融合所產生的雜交瘤。其它優(yōu)選的骨髓瘤得自Balb/C小鼠或人類。在這種情況下，提供生產抗特定抗原的異種單克隆抗體的雜交瘤。例如，這一技術可以用來生產對病原體特異性的人類、貓、狗等(取決于特定的人工染色體)的單克隆抗體。用來選擇生產具有所需特性(即增強的結合親和性、親合力)的抗體的雜交瘤的方法是眾所周知的。或者，可以對得自轉基因有蹄類動物的B細胞進行遺傳修飾，以表達癌基因，例如ras、myc、abl、bcl2或neu，或者用轉化DNA或RNA病毒如EB病毒或SV40病毒感染所述B細胞(Kumar等，Immunol.Lett.65153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA853130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.AntibodiesHybridomas598-104，1994；Kataoka等，Differentiation62201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48659-666，1998)。所得的無限增殖化B細胞也可以用來生產理論上無限量的抗體。因為Ig也分泌到有蹄類動物的乳中，所以有蹄類動物的乳也可以用作異種抗體的來源。雖然在上文已經適當地描述了本發(fā)明，但另外提供以下實施例作為本發(fā)明的進一步例證。實施例1牛IgM的敲除以下方法用來產生其中免疫球蛋白重鏈(μ)基因座的一個等位基因已經通過同源重組而被破壞的牛成纖維細胞系。通過除去μ基因座(對應于IgM重鏈基因)的外顯子1-4，并用一個拷貝的新霉素抗性基因取代，產生用于實施IgM敲除的DNA構建體。使用這種構建體，獲得了成功用于核轉移法的新霉素抗性細胞系，并且將得自這些細胞系的胚泡植入到受體母牛中。另外，測試這些胚泡的一些胚泡，以便用PCR法證實在μ基因座中恰當地發(fā)生了定向插入。從所獲得的幾個細胞系通過核轉移法產生的胚泡表明，在妊娠時為雜合IgM-KO胎兒。另外，已經產生了包含IgM重鏈(μ)單敲除的雄性和雌性細胞系。預期從這些細胞系克隆的動物的配種，將產生其中μ的兩個拷貝都被失活的后代。這些方法在下文有更為詳細的論述。DNA構建體在本文件中所述的所有轉染中所使用的DNA如下產生。四個主要的外顯子(除了跨膜結構域外顯子)-CH1-4下游(CH4)端的側翼為一個XhoI限制位點，上游(CH1)端的側翼為一個XbaI位點。供轉染法用的構建體由XhoI位點下游的1.5kb基因組序列和XbaI位點上游的3.1Kb基因組序列組成(圖3D和3E)。這些序列如本文所述從來自Massachusetts乳牛群的Holstein牛中分離。將一個位于3.5Kb片段上的新霉素抗性標記插入到這兩個片段之間，取代原來含有CH1-4、得自原始基因組序列的2.4KbDNA。所述載體的骨架為pBluescriptIISK+(Stratagene)，純化8.1Kb的插入片段，用其轉染牛胎成纖維細胞。該構建體示于圖3A-3C。使用標準方法，也可以構建含有其它同源區(qū)和/或含有另一種抗生素抗性基因的其它μ敲除構建體，用來使內源μ重鏈基因突變。轉染/敲除方法胎牛的轉染用市售試劑SuperfectTransfectionReagent(Qiagen，Valencia，CA，USA)，CatalogNumber301305來進行。牛成纖維細胞產自Hematech′sKansasfacility的經病害檢驗的雄性Charlais牛，并且送至Hematech′sWorcesterMolecularBiologyLabs，用于所述的所有實驗。任何其它有蹄類動物品種、屬或物種都可以用作供體細胞(例如體細胞，如胎成纖維細胞)來源。對所述供體細胞進行遺傳修飾，使其含有減少或消除功能性內源Ig表達的突變。用于培養(yǎng)牛胎成纖維細胞的培養(yǎng)基由下述成分組成500mlαMEM(Bio-Whittaker#12-169F)；50ml胎牛血清(Hy-Clone#A-1111-D)；2ml抗生素/抗真菌劑(Gibco/BRL#15245-012)；1.4ml2-巰基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)；5.0mlL-谷氨酰胺(SigmaChemical#G-3126)；和0.5ml酒石酸酪氨酸(SigmaChemical#T-6134)。在轉染操作前一天，將細胞接種到60mm組織培養(yǎng)皿中，通過顯微鏡檢查測定達到40-80％的目標匯合度。轉染當天，將總體積為150μl無血清無抗生素培養(yǎng)基中的5μgDNA與20μlSupeffect轉染試劑混合，讓其于室溫靜置5-10分鐘，以便形成DNA-Superfect復合物。當發(fā)生所述復合物形成時，從含有待轉染的牛成纖維細胞的60mm組織培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基，細胞用4ml磷酸緩沖鹽溶液沖洗一次。將1ml生長培養(yǎng)基加入到170μlDNA/Superfect混合物中，立即將其轉移到60mm培養(yǎng)皿中的細胞上。將細胞于38.5℃、50％二氧化碳下孵育2.5小時。在細胞與DNA/Superfect復合物一起孵育后，吸出培養(yǎng)基，細胞用4mlPBS洗滌4次。加入5ml完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物于38.5℃、5％CO2下孵育過夜。然后細胞用PBS洗滌一次，然后與1ml含0.3％胰蛋白酶的PBS一起于37℃孵育，直至通過顯微鏡觀察確定細胞與板分離。將得自每個60mm培養(yǎng)皿的細胞分裝到24孔組織培養(yǎng)板的24個孔中(41.7μl/孔)。向各孔加入1ml組織培養(yǎng)基，讓板于38.5℃和5％CO2下孵育24小時。在所有轉染操作期間，用不含DNA的Superfect/PBS混合物進行假轉染，因為可以預期那些細胞中都不含新霉素抗性基因，并且可以預期所有細胞在將G418加入到組織培養(yǎng)基后都死亡。這用作接受DNA的細胞正選擇的陰性對照。孵育24小時后，再將1ml含有400μgG418的組織培養(yǎng)基加入到各孔中，使G418的終濃度為200μg/ml。將細胞放回到培養(yǎng)箱中，進行7天的G418選擇。在此期間，監(jiān)測轉染板和假轉染板的細胞死亡情況，并且在7天內，來自假轉染的大多數孔含有很少或不含活細胞，而含有接受所述DNA的細胞的板則顯示出很好的細胞生長。在7天的選擇期之后，來自90-100％匯合的孔的細胞用0.2ml含0.3％胰蛋白酶的PBS解離，并且將其轉移到35mm組織培養(yǎng)板中以進行擴大培養(yǎng)和孵育，直至它們至少50％匯合，此時，細胞用0.6ml含0.3％胰蛋白酶的PBS進行胰蛋白酶處理。從每個35mm組織培養(yǎng)板，將0.6ml細胞懸浮液中的0.3ml轉移至12.5cm2組織培養(yǎng)瓶中，進行進一步擴大培養(yǎng)。將剩余的0.3ml再接種到35mm培養(yǎng)皿中并孵育，直至它們最低達到大約50％匯合，此時，對來自那些板的細胞進行加工，以供提取用于PCR分析的DNA。來自每個系的燒瓶保留在培養(yǎng)箱中，直至它們經過這些分析，如果它們不含所需的DNA整合，則終止培養(yǎng)，或者保持在培養(yǎng)箱中，以供將來的核轉移和深低溫保藏用。定向整合的篩選如上所述，供篩選含所述DNA構建體的轉染子用的DNA源為一個含有一次傳代的待分析細胞的35mm組織培養(yǎng)皿。按照Laird等(Laird等，＂SimplifiedmammalianDNAisolationprocedure＂，NucleicAcidsResearch，194293)公開的方法并且對其進行改進，制備DNA。簡而言之，如下制備DNA。用以下成分制備細胞裂解緩沖液100mMTris-HCl緩沖液，pH8.5；5mMEDTA，pH8.0；0.2％十二烷基硫酸鈉；200mMNaCl；和100μg/ml蛋白酶K。從每個35mm組織培養(yǎng)皿中吸取培養(yǎng)基，用0.6ml上述緩沖液取代。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱中達3小時，在此期間讓細胞發(fā)生裂解和蛋白消化。在該孵育之后，將裂解液轉移至1.5ml微量離心管中，加入0.6ml異丙醇以沉淀DNA。通過顛倒離心管，將離心管充分振搖，然后讓其于室溫靜置3小時，此后將DNA沉淀在微量離心機中以13,000rpm離心10分鐘。棄去得自每個管的上清液，沉淀用70％乙醇沖洗一次。吸出70％乙醇，讓DNA沉淀風干。干燥后，將每種沉淀重懸于30-50μlTris(10mM)-EDTA(1mM)緩沖液，pH7.4中，讓其過夜水合和溶解。每個聚合酶鏈式反應(PCR)方法使用5-7μl的每種DNA溶液。用兩個獨立的PCR方法來分析轉染子。第一個方法使用兩種引物，所述引物預期退火至都位于供轉染用的DNA內的位點上。第一種引物序列與所述DNA構建體的新霉素抗性盒同源，而第二種引物序列距其大約0.5Kb，產生0.5Kb的短PCR產物。具體地說，使用引物Neol(5′-CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3′，SEQIDNO42)和IN2521(5′-CTGAGACTTCCTTTCACCCTCCAGGCACCG-3′，SEQIDNO43)。使用QiagenPCR試劑盒進行這一PCR反應。所述PCR反應混合物含有每種引物各1pmole、5μl10×反應緩沖液、10μlQ溶液、5μlDNA和1μldNTP溶液。用水使反應混合物的總體積為50μl。采用最初于94℃變性保溫2分鐘，進行這一PCR擴增。然后通過于94℃保溫45秒、于60℃保溫45秒和于72℃保溫2分鐘，進行30個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，讓反應混合物于72℃保溫5分鐘，于4℃保溫直至從PCR儀中取出混合物?；蛘?，在適當反應條件下進行的一個標準PCR反應中，可以使用與所述敲除構建體中整合到所述細胞基因組中的區(qū)同源的任何其它引物，以證實經得住G418選擇的細胞由于所述DNA構建體的整合而成為抗性細胞。因為可以預期，僅一小部分的轉染子在所需位置(μ基因座)中含有DNA整合，所以使用另一對引物，來確定不僅所導入的DNA存在于所述轉染子的基因組中，而且整合到所需的位置中。使用位于所述DNA構建體中新霉素抗性盒內的一種引物和可以預期僅當所述DNA整合在IgM基因座的適當位點時才退火在1.8Kb之外(因為同源區(qū)位于轉染用的DNA構建體中所包含的區(qū)之外)的一種引物，進行用來測定恰當整合的PCR方法。設計所述引物退火到緊鄰所述DNA構建體中提供的將整合到所需位置(所述基因座的DNA序列(都在所述DNA中存在的區(qū)內并且與之相鄰)先前已經測定)的那些序列的DNA序列上。具體地說，使用引物Neol和OUT3570(5′-CGATGAATGCCCCATTTCACCCAAGTCTGTC-3′，SEQIDNO44)進行該分析。這一PCR反應用QiagenPCR試劑盒如上用于第一個PCR反應所述的方法進行，以證實所述打靶構建體整合到所述細胞中。或者，可以用任何合適的反應條件以及與所述敲除構建體中整合到所述細胞基因組中的區(qū)同源的任何其它引物、以及與所述細胞基因組中所述整合位點上游或下游的區(qū)同源的任何其它引物，進行這一PCR分析。采用這些方法，在所述DNA構建體定向整合到合適的基因座方面，篩選135個獨立的35mm平板。從中確定了得自8個平板的DNA含有恰當定向的DNA構建體，然后從中選出三種DNA供核轉移方法用。那些細胞系命名為“8-1C”、“5-3C”和“10-1C”。未用于轉移到受體母牛的剩余的胚泡，用來提取DNA，對所述DNA進行另外的PCR分析。該分析用嵌套PCR法，使用也用于轉染系的初次篩選的引物是有效的。如上所述，用設計用以除去μ基因座的外顯子1-4的基因打靶構建體，產生三個細胞系。用基于PCR的試驗，檢驗出這些系在定向插入方面都為陽性，將其用于核轉移。通過PCR測試已恰當打靶的構建體，篩選從那些核轉移產生的剩余的胚泡。獲得以下頻率的陽性胚泡細胞系8-1C6/8細胞系10-1C2/16細胞系5-3C0/16雖然在妊娠第40天，通過超聲波檢測到總共11次妊娠，到第60天，7個胎兒死亡。剩余4個胎兒經處理以再生新胎成纖維細胞，剩余的器官用來產生小組織樣品以進行PCR分析。分析結果如下系8-1C2個胎兒，1個胎兒經PCR檢查為定向插入陽性系10-1C1個胎兒，經PCR檢查為定向插入陽性系5-3C1個胎兒，經PCR檢查為定向插入陰性令人驚訝的是，雖然10-1C胚泡中檢驗為定向插入陽性的頻率僅為2/16，但從該細胞系獲得的一個有活力的60天胎兒經PCR檢測為陽性。也獲得了得自8-1C的一個陽性胎兒。對所有組織樣品的DNA進行DNA印跡分析，以證實所述構建體不僅在一個末端正確地打中(這通過對原始構建體中存在的較短同源區(qū)進行PCR來測定)，而且在另一個末端也正確地打中。根據迄今獲得的結果，認為已經產生了得自兩個獨立整合事件的兩個重鏈敲除胎兒。此外，由于這些胎兒得自兩個不同的系，所以至少一個胎兒可能在兩個末端正確整合了構建體。一旦DNA印跡分析證實了打靶載體在兩個末端恰當打靶，則進行進一步的核轉移，以產生另外的胎兒，讓其發(fā)育至足月。核轉移和胚胎轉移用K/O細胞系(8-1-C(18))進行核轉移，產生8個胚胎。將得自這一批的總共6個胚胎在TransOvaGenetics(TOG＂；Iowa)轉移到3個無病受體中。已經將冷凍胚胎轉移到10個無病受體中，獲得無病雌性成纖維細胞系。在35-40天證實妊娠后，制訂胎兒回收時間表。妊娠診斷和胎兒回收轉移了得自敲除胎兒細胞的克隆胚胎的18個受體的妊娠情況，通過超聲波檢查法檢查。結果概述如下。表2.使用μ重鏈敲除供體細胞的40天時的妊娠妊娠診斷檢查了從敲除細胞(8-1C)轉移了克隆胚胎的3個受體的妊娠情況；一個已打開(open)，而另外兩個需要在1個月后再加以證實。胎兒回收和細胞系的建立獲得了40天時懷有K/O胚胎的11頭妊娠牛。第60天，從這些牛取出4個活胎兒。從所有4個胎兒建立了細胞系，并將細胞系冷藏待用。此外，我們收集得自所述胎兒的組織樣品并將其快速冷凍，送至Hematechmolecularbiologylaboratory進行PCR/DNA印跡分析。所有4個細胞系都是雄性細胞系。為了獲得雌性細胞系，從在TransOvaGenetics用無病受體所建立妊娠的妊娠55天時所收集的胎兒(6個)建立細胞系并且將其冷藏，以供將來建立K/O細胞。最近，證實了存在含一個μ敲除的雌性細胞系。可以用這一雌性細胞系產生克隆動物，可以讓所述克隆動物與從雄性細胞系產生的動物交配，并且在后代中篩選含有雙μ敲除的后代。實施例2HAC的導入進行另外的實驗，以證明牛宿主可以或者單獨產生或者聯合產生免疫球蛋白重鏈(μ)和λ輕鏈。另外，這些實驗證明，所述免疫球蛋白鏈被重排，并且獲得了多克隆血清。在這些方法中，用人類人工染色體將表達免疫球蛋白的基因導入牛成纖維細胞中。然后用成纖維細胞進行核轉移，獲得胎兒，并且分析胎兒抗體產生的情況。這些方法和結果在下文有更詳細的描述。HAC構建體用先前描述的染色體克隆系統(Kuroiwa等，NatureBiotech.181086-1090，2000)，構建人類人工染色體(HAC)。簡而言之，為了構建ΔHAC，用端粒定向染色體截短法(Kuroiwa等，NucleicAcidRes.，263447-3448，1998)，使先前報道的含有在HCF2基因座整合的loxP序列的人類22號染色體片段(hChr22)在AP000344基因座截短。接著，通過將含有在AP000344基因座截短的上述hChr22片段(hCF22)的DT40細胞克隆與含有穩(wěn)定的且種系可遺傳的人類微型染色體SC20載體的DT40細胞克隆(稱為“R克隆”)融合，形成細胞雜種。SC20載體通過在S20片段的RNR2基因座插入一個loxP序列而產生。SC20片段是天然存在的來源于人類14號染色體的片段，該片段包含完整的人Ig重鏈基因區(qū)(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97722，2000)。所得的DT40細胞雜種含有兩種hChr片段。所述DT40雜種用Cre重組酶表達載體轉染，以誘導hCF22和SC20載體之間的Cre/loxP介導的染色體易位。穩(wěn)定轉染子用嵌套PCR分析，以證實由HCF2和AP000344基因座限定的2.5兆堿基hChr22區(qū)克隆到SC20載體的loxP克隆位點中。然后通過FACS分選，根據所編碼的綠色熒光蛋白的熒光，分離預期含有ΔHAC的PCR陽性細胞。經分選細胞的熒光原位雜交(FISH)分析，也用來證實含有所述2.5兆堿基hChr22插入片段的ΔHAC的存在。同樣采用這種染色體克隆系統，也構建了ΔΔHAC。將hChr22片段在AP000344基因座截短，然后通過在DT40細胞中同源重組，將loxP序列整合到AP000553基因座中。然后將所得細胞與含有SC20微型染色體載體的R克隆融合。所述細胞雜種用Cre表達載體轉染，以達到Cre/loxP介導的染色體易位。通過PCR和FISH分析，證實了含有由AP000553和AP000344基因座限定的1.5兆堿基hChr22插入片段的ΔΔHAC的產生。ΔHAC和Δ/ΔHAC的體內功能性通過產生含有這些HAC的嵌合小鼠來評價。采用標準方法，將這些HAC各自導入小鼠胚胎干(ES)細胞，然后用所述胚胎干細胞產生嵌合小鼠(日本專利號2001-142371；2000年5月11日申請)。所得的小鼠具有高度嵌合狀態(tài)(85-100％的毛色)，證明含有這些HAC的ES細胞高水平的多能性和這些HAC在體內的有絲分裂穩(wěn)定性。此外，ΔHAC通過所述ΔHAC嵌合小鼠的種系，遺傳給下一代，證明這種HAC的減數分裂穩(wěn)定性。保留這些HAC的雞DT40細胞已經根據布達佩斯條約，于2001年5月9日提交獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(InternationalPatentOrganismDepository，NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology，TsukubaCentral6，1-1，Higashi1-ChomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566Japan)保藏。保藏號如下ΔHAC(FERMBP-7582)、ΔΔHAC(FERMBP-7581)和SC20片段(FERMBP-7583)。保留這些HAC的雞DT40細胞也已經保藏在臺灣的食品工業(yè)研究和發(fā)育研究所(FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute)(FIRDI)。保藏號和保藏日期如下ΔHAC(CCRC960144；2001年11月9日)，ΔΔHAC(CCRC960145；2001年11月9日)和SC20片段(該細胞系以名稱SC20(D)提交保藏；CCRC960099；1999年8月18日)。ΔHAC中的2.5兆堿基(Mb)hChr22插入片段由以下BAC毗連群構成，所述毗連群由以下Genbank登錄號列出AC002470、AC002472、AP000550、AP000551、AP000552、AP000556、AP000557、AP000558、AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344。ΔΔHAC中的1.5MbhChr22插入片段由以下BAC毗連群構成AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344(Dunham等，Nature402489-499，1999)。牛胎成纖維細胞的產生為了產生牛胎成纖維細胞，從在TransOva(Iowa)家畜舍內飼養(yǎng)的經過疾病檢驗的Holstein?；騄ersey牛中收集45-60天的胎兒，其中記錄父本和母本連續(xù)三代的系譜。所收集的胎兒在濕冰上運送到Hematech′sWorcesterMolecularBiologyDivsion，以產生原代胎成纖維細胞。達到后，將胎兒轉移到組織培養(yǎng)櫥中的非組織培養(yǎng)級的100mm塑料培養(yǎng)皿中。使用無菌鑷子和剪刀，從所述胎兒除去胚外膜和臍帶。在將胎兒轉移到新的塑料培養(yǎng)皿后，除去頭部、肢體和內臟。將已取出內臟的胎兒轉移到含有約10ml胎兒沖洗液的第三個培養(yǎng)皿中，所述胎兒沖洗液由以下物質組成125ml1×Dulbecco′s-PBS(D-PBS)，含有Ca2+和Mg2+(Gibco-BRL，cat#.14040)；0.5ml酒石酸泰樂菌素(TylosineTartrate)(8mg/ml，Sigma，cat#.T-3397)；2ml青霉素-鏈霉素(Sigma，cat#.P-3539)；和1ml兩性霉素(Fungizone)(Gibco-BRL，cat#.15295-017)(混合并通過0.2μm尼龍過濾裝置(Nalgene，cat#.150-0020)過濾)。所述胎兒用胎兒沖洗液再洗滌3次，以除去痕量的血液，將其轉移到50ml錐形組織培養(yǎng)管中，用無菌手術刀將其切碎成小塊。組織小塊用無Ca2+和Mg2+的1×D-PBS(Gibco-BRL，cat#.14190)洗滌1次。在組織小塊沉降至管底部后，除去上清液，更換為約30ml細胞解離緩沖液(Gibco-BRL，cat#.13151-014)。將管倒置數次，以便讓其混合，然后在組織培養(yǎng)箱中于38.5℃/5％CO2孵育20分鐘。在組織沉降至管底部后，除去上清液，更換為等體積的新鮮細胞解離緩沖液。將組織和細胞解離緩沖液的混合物轉移到一個帶有24mm圓端旋轉棒的75ml無菌玻璃胰蛋白酶處理瓶(WheatonScienceProducts，cat#.355393)中。將瓶轉移到38.5℃/5％CO2組織培養(yǎng)箱，置于磁力攪拌板上，以足以允許有效混合的速度攪拌大約20分鐘。將瓶轉移到組織培養(yǎng)櫥中；讓組織小塊沉降，然后除去上清液，通過以1,200rpm離心5分鐘收集解離的細胞。將細胞沉淀重懸于小體積的成纖維細胞完全培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基的組成如下440mlαMEM(BioWhittaker，cat#.12-169F)；50ml經照射的胎牛血清；5mlGLUTAMAX-I增補劑(Gibco-BRL，cat#.25050-061)；5ml青霉素-鏈霉素(Sigma，cat#.P-3539)；1.4ml2-巰基乙醇(Gibco-BRL，cat#.21985-023)(將除胎牛血清之外的所有組分混合，然后通過0.2μm尼龍過濾裝置[Nalgene，cat#.151-4020]過濾)，并且在冰上貯存。所述解離過程再重復3次，在每個步驟期間使用另外30ml細胞解離溶液。將細胞合并，用成纖維細胞完全培養(yǎng)基洗滌；順序通過23號和26號針頭，最后通過70μm細胞濾過器(B-DFalcon，cat#.352350)，產生單細胞懸浮液。通過在血細胞計數器中，在存在錐蟲藍(0.4％溶液，Sigma，cat#.T-8154)的情況下計數，測定細胞密度和活力。原代成纖維細胞在成纖維細胞完全培養(yǎng)基中，以1×106活細胞/T75cm2組織培養(yǎng)瓶的細胞密度于38.5℃/5％CO2擴大培養(yǎng)。在培養(yǎng)3天后，或者在細胞達到匯合之前，通過用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)沖洗培養(yǎng)瓶1次，并且與10ml細胞解離緩沖液一起于室溫孵育5-10分鐘，收獲成纖維細胞。用倒置顯微鏡目測監(jiān)測細胞的解離。在這一步，小心確保通過用吸管反復吹打使細胞塊消散。在洗滌和定量后，解離的成纖維細胞隨時可用于基因打靶實驗。這些細胞也可以冷藏，以供長期貯藏。將HAC導入牛胎成纖維細胞采用微細胞介導的染色體轉移(MMCT)(Kuroiwa等NatureBiotech.181086-1090，2000)，將ΔHAC和ΔΔHAC從所述DT40細胞雜種轉移到中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。在補充10％FBS(Gibco)、1mg/mlG418和0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)培養(yǎng)基中，于37℃和5％CO2培養(yǎng)含有ΔHAC的CHO克隆(“D15克隆”)。將D15克隆在12個T25瓶中擴大培養(yǎng)。當匯合度達到80-90％時，以0.1μg/ml的終濃度加入秋水仙酰胺(Sigma)至培養(yǎng)基中。3天后，將培養(yǎng)基更換為補充10μg/ml細胞松弛素B(Sigma)的DMEM(Gibco)。將培養(yǎng)瓶以8,000rpm離心60分鐘，收集微細胞。微細胞通過8、5和3μm濾器(Costar)純化，然后重懸于DMEM培養(yǎng)基中。用所述微細胞如下所述與牛成纖維細胞融合。牛胎成纖維細胞在補充10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco)培養(yǎng)基中于37℃和5％CO2下培養(yǎng)。將成纖維細胞在T175瓶中擴大培養(yǎng)。當達到70-80％匯合時，用0.05％胰蛋白酶使細胞與培養(yǎng)瓶解離。成纖維細胞用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，然后鋪在所述微細胞懸浮液上。在微細胞-成纖維細胞懸浮液以1,500rpm離心5分鐘后，按照生產商的方案，將PEG1500(Roche)加入到沉淀中，使微細胞能夠與所述牛成纖維細胞融合。融合后，將融合的細胞接種到6個24孔板中，在補充10％FBS的α-MDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后將培養(yǎng)基更換為含有0.7mg/mlG418的培養(yǎng)基。在G418抗生素存在下生長大約2周后，選擇G418抗性融合細胞。用這些G418抗性克隆如下所述進行核轉移。同樣借助MMCT，將ΔΔHAC從CHO克隆ΔΔC13轉移到牛胎成纖維細胞中。經選擇的G418抗性克隆用于核轉移。核轉移、激適和胚胎培養(yǎng)基本上如先前已描述的方法(Cibelli等，Science19982801256-1258)，進行所述核轉移法。在成熟后約18-20小時(hpm)，將體外成熟的卵母細胞去核，通過bisBenzimide(Hoechst33342，Sigma)標記，在紫外線下證實染色體的除去。通過應用2.4kV/cm達20μsec的單個電脈沖(Electrocellmanipulator200，Genetronics，SanDiego，CA)，使這些胞質供體細胞雙聯體融合。3-4小時后，取出總轉移雙鏈體的25％的一個隨機亞組，通過bisBenzimide標記轉移的細胞核，證實融合。30hpm時，重新構建的卵母細胞和對照如先前已描述的方法(Lin等，Mol.Reprod.Dev.199849298-307；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.199438380-385)，用鈣離子載體(5μM)活化4分鐘(CalBiochem，SanDiego，CA)以及用含10μg放線菌酮和2.5μg細胞松弛素D(Sigma)的ACM培養(yǎng)基活化6小時。在活化后，卵在HEPES緩沖的倉鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM-Hepes)中洗滌5次，然后置于4孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)板含有經照射小鼠胎成纖維細胞和0.5ml胚胎培養(yǎng)基并覆蓋0.2ml經過胚胎試驗的(embryotested)礦物油(Sigma)。每個孔放置25-50個胚胎，在空氣環(huán)境下于38.5℃、5％CO2下培養(yǎng)。第4天，向培養(yǎng)基中加入10％FCS。胚胎轉移第7天和第8天，將核轉移胚泡分別轉移到第6天和第7天同步化的受體小母牛中。受體動物采用一次注射Lutalyse(Pharmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)、然后檢查發(fā)情進行同步化。在胚胎轉移后第30天和第60天，通過超聲波檢查法，檢查受體孕體的存在，此后，每30天通過直腸觸診進行檢查，直至270天。HAC在這些牛胎兒中的保留情況概述于表3，并且在以下的小節(jié)中更詳細地描述。表3牛胎兒中的HCA保留概述含人14號染色體的片段的HAC的導入將SC20片段-人14號染色體片段(“hchr.14fg”，含有Ig重鏈基因)以與上述方法基本相同的方法，導入到胎成纖維細胞中。也可以使用任何其它的標準染色體轉移法，將該HAC或含有人Ig基因的另一種HAC插入到供體細胞中。所得的供體細胞可以用于標準核轉移技術，例如上述的那些技術，以產生具有所述HAC的轉基因有蹄類動物。通過超聲波檢查法，檢查從含hchr.14fg的細胞轉移了克隆胚胎的28個受體的妊娠情況。結果概述于表4。表4使用含hchr.14fg的供體細胞于40天的妊娠妊娠率低于預期。認為這可歸因于胚胎轉移期間極其異常的炎熱氣候。如圖27中所示，攜帶HAC的胚胎的妊娠率看來與非轉基因克隆妊娠率相當。一個攜帶ΔΔHAC幼仔的受體最近產出一個活的健康幼仔。其它受體將在接下來的數月內生產。人重鏈基因座在ΔHAC牛胎兒中重排和表達的證明在各種妊娠天數時取出克隆ΔHAC轉基因牛胎兒，分析其人免疫球蛋白基因座的存在、重排和表達。對通過RT-PCR從這些胎兒之一的脾和非淋巴組織(肝和腦)獲得的基因組DNA和cDNA的分析，顯示出所述ΔHAC的存在、重排和表達。在ΔHAC胎兒中存在人重鏈和/或輕鏈為了確定人重鏈和輕鏈是否保留在ΔHAC胎兒中，從ΔHAC胎兒中分離肝DNA，通過PCR分析編碼人重鏈和輕鏈的基因組DNA的存在情況。為了檢測基因組重鏈DNA，使用以下引物VH3-F5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQIDNO1)和VH3-R5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQIDNO2)。用于檢測λ輕鏈DNA的引物是IgL-F5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQIDNO3)和IgL-R5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′(SEQIDNO4)。PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlExTaq。通過將反應混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒，進行38個循環(huán)的PCR。如圖5所示，胎兒#5968、6032和6045都含有人重鏈(μ)和輕鏈(λ)兩個基因座。胎兒#5996僅含有人重鏈基因座。胎兒#5983不含人重鏈，也可能不含人輕鏈。胎兒#5846不含任一種人序列。因此，胎兒#5983和5846可能沒有保留所述HAC。這些結果提示，ΔHAC可以在牛中穩(wěn)定地保留直至妊娠第58天。在ΔHAC胎兒#5996中存在人Cμ外顯子用對包括Cμ3和Cμ4的部分的mRNA轉錄物特異性的引物，來測定在胎兒#5996中ΔHAC是否存在以及是否表達編碼人μ基因座恒定區(qū)的轉錄物。關于人μ重鏈的基因組恒定區(qū)的這種RT-PCR分析，使用引物“CH3-F1”(5′-accacctatgacagcgtgac-3′，SEQIDNO5)和“CH4-R2”(5′-gtggcagcaagtagacatcg-3′，SEQIDNO6)，產生一種350堿基對的RT-PCR產物。這種PCR擴增通過最初于95℃變性保溫5分鐘來進行。然后，通過于95℃保溫1分鐘、于59℃保溫1分鐘和于72℃保溫2分鐘，進行35個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，將反應混合物于72℃保溫10分鐘。如下所述用引物I7L和P9，檢測重排的牛重鏈(圖7)。作為內部對照，用引物“GAPDH正向”(5′-gtcatcatctctgccccttctg3′，SEQIDNO7)和“GAPDH反向”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQIDNO8)，檢測GAPDHRNA的水平。對于這一GAPDHRNA的擴增，將樣品于95℃保溫5分鐘，然后于95℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，進行35個循環(huán)的保溫。然后將混合物于72℃保溫7分鐘。該分析表明，胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產生與使用對照人脾cDNA(第4泳道)和得自ΔHAC嵌合小鼠的cDNA(第5泳道)產生的擴增產物匹配的一個條帶(第3泳道)(圖6)。在非淋巴組織中沒有檢測到這樣的條帶牛肝(第1泳道)或牛腦(第2泳道)。在肝(圖6的第10泳道)和腦(圖7的第6泳道)中成功地擴增管家基因GADPH，表明這些組織支持RT-PCR的能力。到妊娠77天時牛重鏈基因座的重排測試ΔHAC胎兒#5996，以確定它是否經歷了免疫球蛋白重鏈基因座重排所需的重組系統表達和激活所必需的發(fā)育過程。關于該分析，進行標準RT-PCR分析，來檢測編碼μ-VH重排的mRNA轉錄物的存在。使用引物“17L”(5′-ccctcctctttgtgctgtca-3′，SEQIDNO9)和“P9”(5′-caccgtgctctcatcggatg-3′，SEQIDNO10)，通過RT-PCR分析從胎兒#5996脾、肝和腦分離的RNA。PCR反應混合物于95℃保溫3分鐘，然后采用以下條件95℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃2分鐘，進行35個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，將反應混合物于72℃保溫10分鐘。圖7的第5泳道表明，獲得了預期大小的重排牛重鏈(450堿基對)擴增產物。該產物遷移到與對照牛Cμ重鏈cDNA擴增產物的相同位置(第7泳道)，已知所述對照含有對應于重排牛重鏈轉錄物的序列。正如所預期的，所述重排重鏈在脾(第5泳道)中表達，但在發(fā)育的這一時間點在腦(第2泳道)和肝(第3泳道)中沒有表達。人重鏈基因座在ΔHAC胎兒#5996中的重排和表達通過擴增包括Cμ和VH區(qū)的部分的DNA區(qū)段，證明人重鏈基因座的重排和表達。用對包括Cμ(Cμl)和VH(VH3-30)的部分的RNA轉錄物特異性的引物，來測定含有重排人Cμ-VDJ序列的RNA轉錄物是否存在(圖8)。對于這種RT-PCR分析，使用引物“Cμl”(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQIDNO11)和“VH3-30”(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQIDNO12)，產生450堿基對的RT-PCR產物。這種RT-PCR如下進行將反應混合物于95℃保溫3分鐘，然后進行以下40個保溫循環(huán)95℃30分鐘、69℃30分鐘和72℃45分鐘，再進行72℃10分鐘的一個保溫循環(huán)。這種RT-PCR產物用相同的引物如下進行再擴增95℃3分鐘的一個保溫循環(huán)；95℃1分鐘、59℃1分鐘、72℃1分鐘，40個保溫循環(huán)；和72℃10分鐘，一個保溫循環(huán)。作為內部對照，如上所述進行GAPDH的RT-PCR擴增。圖8中的凝膠表明，對胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產生與使用人脾cDNA(第4泳道)或ΔHAC嵌合小鼠脾cDNA(第1泳道)產生的擴增產物匹配的一個條帶(第5泳道)。在牛肝(第2泳道)或牛腦(第3泳道)中沒有檢測到這樣的條帶。作為陽性對照，GADPHRNA的擴增(第8泳道和第9泳道)表明這些組織支持RT-PCR的能力。也使用引物CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO13)和CH4-R2(5′-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3′，SEQIDNO14)，通過RT-PCR分析，證實了人重鏈區(qū)在胎兒#5996中的重排和表達。這些PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。通過將反應混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，進行40個循環(huán)的PCR。如圖9的第6泳道和第7泳道所示，得自胎兒#5996脾的擴增序列的大小與得自兩個陽性對照的剪接恒定區(qū)片段的大小相同，所述陽性對照為得自人脾(第8泳道)和ΔHAC嵌合小鼠脾(第9泳道)的樣品。正如所預期的，得自正常小鼠脾和牛脾的陰性對照不含擴增序列(第1泳道和第2泳道)。得自胎兒#5996肝和腦的樣品不含與經剪接的人μ重鏈恒定區(qū)片段一樣大小的擴增剪接序列，但含有來源于污染所述RNA樣品的基因組DNA的未剪接基因組片段的擴增序列(第3、4和5泳道)。人重鏈基因座在ΔHAC胎兒中的VDJ重排也進行了RT-PCR分析，以進一步證實所述重鏈基因座在ΔHAC胎兒#5996中的VDJ重排。進行嵌套RT-PCR，第一個反應使用引物Cμ-1(5′-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3′，SEQIDNO15)，第二個反應使用引物Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQIDNO16)，兩個反應都使用引物VH3-30.3(5′-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′，SEQIDNO17)。所述RT-PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。所述RT-PCR如下進行，第一個反應使用以下條件進行38個循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。對于第二個反應，使用引物VH3-30.3和Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQIDNO16)，在以下條件下進行38個循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。如圖10的第6泳道和第7泳道所示，對胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產生其大小與第8泳道和第9泳道中的陽性對照一樣的一條重鏈條帶。得自胎兒#5996肝和腦的樣品含有某些污染性重排DNA(第3泳道和第5泳道)。第1泳道和第2泳道中的陰性對照產生大小不正確的條帶。通過測序證實ΔHAC重排通過從ΔHAC胎兒#5996脾的RNA反轉錄所得到的cDNA，用對重排人μ特異性的引物擴增，并且在瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠切取通過用Cμl-VH3-30引物對擴增所產生的條帶。從該條帶回收所擴增的cDNA并將其克隆。純化得自經PCR檢測為重排人μ陽性的所得克隆的DNA，并對其測序(圖11A)。得自該ΔHAC胎兒的序列與20種以上的已知人重鏈序列的同源性超過95％。例如，人抗肺炎球菌抗體的μ鏈與該序列的一個區(qū)有97％同源(圖11B)。通過用引物Cμ-1和VH3-30.3對胎兒#5996的脾進行RT-PCR分析，然后用引物Cμ-2和VH3-303進行再擴增，也獲得了得自重排人重鏈的另外的序列。用CHROMASPIN柱(CLONETECH)純化所述RT-PCR產物，并且按照生產商的方案，將其克隆到pCR2.1TA克隆載體(Invitrogen)中。在由BigDyeTerminator反應混合物(3μl)、模板質粒(200ng)和Cμ-2引物(1.6pmol)組成的10μl體積的反應混合物中，進行染料終止序列反應(ABIAppliedSystem)。測序反應用ABI3700測序儀進行。對于該分析，在以下條件下進行25個循環(huán)96℃1分鐘、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分鐘。鑒定出至少兩種重排人重鏈轉錄物，它們是VH3-11/D7-27/JH3/Cμ和VH3-33/D6-19/JH2/Cμ(圖12A和12B)。這些結果證明，在胎兒#5996脾中的所述ΔHAC中發(fā)生人μ重鏈基因座的VDJ重排。從同一個胎兒鑒定出不止一種重排重鏈序列，也證明了ΔHAC胎兒產生多樣化人免疫球蛋白序列的能力。人重鏈和輕鏈基因座在ΔΔHAC胎兒中的重排和表達從不同妊娠日期的受體母牛，取出得自牛胎成纖維細胞ΔΔHAC染色體轉移的克隆胎兒。分析所述胎兒的帶有HAC的人免疫球蛋白重鏈和λ輕鏈基因座的存在和重排。對得自這些組織的基因組DNA的研究表明，在其中某些胎兒中存在人免疫球蛋白重鏈和輕鏈。對得自這些胎兒脾的cDNA的檢查表明，所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座在其中某些胎兒中重排和表達。FACS分析也證明了人λ輕鏈蛋白在其中兩個胎兒的脾淋巴細胞表面表達。在ΔΔHAC胎兒中存在人重鏈和輕鏈基因座為了確定ΔΔHAC胎兒是否保留有人重鏈和輕鏈基因座，對得自58天胎兒#5580、57天胎兒#5848以及91天胎兒#5442A和5442B的肝的基因組DNA進行PCR分析。用于檢測所述重鏈基因座的PCR引物是VH3-F(5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′，SEQIDNO18)和VH3-R(5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′，SEQIDNO19)，而用于檢測所述輕鏈的引物是IgL-F(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO20)和IgL-R(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′，SEQIDNO21)。所述PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlExTaq。如下進行38個PCR循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒(圖13和14)。如圖13和14所示，陽性對照58天胎兒#5580含有人重鏈和輕鏈免疫球蛋白兩個基因座。另外，91天的胎兒#5442A和5442B也含有重鏈和輕鏈兩個基因座(圖14)。相反，胎兒#5848不含任一種人基因座，因此可能不含有ΔΔHAC。這些結果提示，ΔΔHAC可以在牛中穩(wěn)定保留直至妊娠第91天。人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A中的重排和表達用RT-PCR來檢測重排人重鏈RNA轉錄物在ΔHAC胎兒#5542A中的表達。所用的RT-PCR引物是CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO22)和CH4-R2(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′，SEQIDNO23)。所述RT-PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。如下進行40個循環(huán)的RT-PCR循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒。圖15的第4泳道和第5泳道含有來自胎兒#5442A脾的擴增的剪接μ重鏈恒定區(qū)序列，其大小與所述陽性對照樣品的大小相似。這些結果表明，胎兒#5442A在其脾中表達一種重排的μ重鏈轉錄物。在未經剪接的基因組序列的區(qū)中也觀察到模糊條帶，它們是從所述RNA樣品中污染的基因組DNA擴增的。得自胎兒#5442A肝和腦的對照樣品不產生擴增重排重鏈序列所預期大小的條帶。人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達用RT-PCR來檢測重排人重鏈RNA轉錄物在一個妊娠119天的ΔΔHAC胎兒(胎兒#5868A)的脾中的表達。用于該分析的引物是VH30-3(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQIDNO24)和CM-1(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQIDNO25)。另外，使用引物“GAPDHup”(5′-gtcatcatctctgccccttctg-3′，SEQIDNO26)和“GAPDHdown”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQIDNO27)來擴增GAPDH對照轉錄物。對于該PCR分析，將反應混合物于95℃保溫5分鐘，然后通過于95℃保溫1分鐘、58℃保溫1分鐘和72℃保溫2分鐘，進行多個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，將混合物于72℃保溫10分鐘。圖16的第3泳道含有通過對ΔΔHAC胎兒#5868A進行該分析而產生的RT-PCR產物。這種RT-PCR產物為擴增重排人重鏈所預期的大小(470堿基對)，并且在凝膠中遷移到與已知含有對應于重排人重鏈轉錄物的序列的對照cDNA相同的位置。作為對照，ΔΔHAC胎兒#5868A的胎脾cDNA和正常牛cDNA樣品當用GAPDH引物擴增時，都產生一種產物，證明所述cDNA支持擴增的能力(第7泳道和第8泳道)。人λ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B中的重排和表達使用對擴增包括人λ的部分的轉錄物特異性的引物，來檢測得自重排人λ輕鏈基因座的RNA轉錄物。對于圖17中所示的RT-PCR分析，使用引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQIDNO28)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQIDNO29)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQIDNO30)的等摩爾混合物和引物Vλ1LEA1(5′-CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3′，SEQIDNO31)。所述RT-PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。所述RT-PCR的條件如下85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，進行40個循環(huán)。如圖18所示，該RT-PCR分析也使用下述引物進行引物Vλ3LEA1(5′-CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3′；SEQIDNO32)、Vλ3JLEAD(5′ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3′，SEQIDNO33)，VλBACK4(5′-CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3′，SEQIDNO34)的等摩爾混合物以及引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQIDNO35)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQIDNO36)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQIDNO37)的等摩爾混合物。所述RT-PCR的反應條件與以上關于圖7所述的條件相同。圖17的第6泳道和第7泳道以及圖18的第4泳道和第5泳道含有得自胎兒#5442A脾、大小與所述陽性對照條帶相似的RT-PCR產物，表明在該胎兒中存在重排的輕鏈RNA轉錄物。得自胎兒#5442B的脾樣品產生在該照片中肉眼不可見的非常弱的大小合適的條帶。這種RT-PCR產物表明，胎兒#5442B也在其脾中表達重排的輕鏈免疫球蛋白轉錄物。正如所預期的，得自胎兒#5442A和5442B腦的樣品不表達人重排λ輕鏈轉錄物。人λ基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達在ΔΔHAC胎兒#5868A中也檢測到重排人λ輕鏈基因座的RNA轉錄物。關于這一分析，使用對擴增包括人λ的部分的轉錄物特異性的引物，來檢測編碼重排人λ基因座部分的轉錄物的ΔΔHAC編碼的表達。該分析使用引物VL1LEAI(5′-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3′；SEQIDNO38)以及引物CL1(5′-gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3′；；SEQIDNO39)、CL2-3(5′-gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3′；SEQIDNO40)和CL7(5′-gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3′；SEQIDNO41)的等摩爾混合物。對于該RT-PCR反應，將反應混合物于95℃保溫5分鐘，然后通過于95℃保溫1分鐘、60℃保溫1分鐘和72℃保溫2分鐘進行多個變性、退火和擴增循環(huán)。然后將混合物于72℃保溫10分鐘。該分析證明，得自ΔΔHAC#5868A的脾cDNA(圖19的第4泳道)產生一種大小與TC小鼠脾cDNA(第6泳道)陽性對照相同的RT-PCR產物。使用得自ΔΔHAC#5868A腦或肝cDNA(分別為第2泳道和第3泳道)，檢測不到這樣的RT-PCR產物。用引物“GAPDHup”和“GAPDHdown”成功地擴增管家基因GAPDH(第8泳道和第10泳道)，表明這些組織中的每種組織支持RT-PCR的能力。通過測序證實ΔΔHAC重排使用引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩爾混合物和引物Vλ1LEA1，或者使用引物Vλ3LEA1、Vλ3JLEAD和VλBACK4的等摩爾混合物和引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩爾混合物，對胎兒#5442A脾樣品進行RT-PCR分析。所述PCR產物用CHROMASPIN柱(CLONETECH)純化，并且按照生產商的方案，克隆到pCR2.1TA克隆載體(Invitrogen)中。使用Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物的等摩爾混合物進行DyeTerminatorsequence反應(ABIAppliedSystem)。于96℃1分鐘、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分鐘，進行25個循環(huán)。10μl反應混合物含有BigDyeTerminator反應混合物(3μl)、模板質粒(200ng)以及Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物(1.6pmol)。用ABI3700測序儀分析反應混合物。鑒定出至少兩種重排人λ輕鏈轉錄物(V1-17/JL3/Cλ和V2-13/JL2/Cλ)。這些結果證明人λ輕鏈基因在胎兒#5442A脾的ΔΔHAC中發(fā)生VJ重排(圖20和21)。人λ輕鏈和牛重鏈在ΔΔHAC胎兒#S442A和5442B中表達的FACS分析分析得自ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B的脾淋巴細胞中人λ輕鏈和牛重鏈蛋白的表達。讓這些細胞與藻紅蛋白標記的抗人λ抗體(圖22C和22D)、FITC標記的抗牛IgM抗體(圖22D和22H)或無抗體(圖22A、22B、22E和22F)于4℃反應20分鐘。然后細胞用PBS加上2％FCS洗滌2次，然后在FASCalibur細胞分類器上分析。用無抗體對照來電子設定門控(electronicallysethegates)，計算與所述抗體反應的細胞的百分率。這些百分率顯示在每條頻率曲線的下方。胎兒#5442A(圖22A-22D)和胎兒#5442B(圖22E-22H)既表達人λ輕鏈蛋白，又表達牛重鏈蛋白。實施例3產生異種抗體和減少量的內源抗體的轉基因有蹄類動物也可以產生表達異種抗體并且具有內源抗體表達水平降低的轉基因有蹄類動物。通過相對于功能性內源重鏈基因或輕鏈基因的數目而言增加功能性異種免疫球蛋白重鏈基因或輕鏈基因的數目，應該提高表達異種抗體的B細胞的百分率。為了產生這些轉基因有蹄類動物，可以讓ΔHAC或ΔΔHAC轉基因有蹄類動物與在內源免疫球蛋白鏈(例如μ重鏈或者λ或κ輕鏈)的一個或兩個等位基因中含有突變的轉基因有蹄類動物交配。如有必要，可以讓所得的轉基因有蹄類動物(i)與在內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒和/或J鏈核酸的一個或兩個等位基因中有突變的轉基因有蹄類動物交配，或者(ii)與含有外源J鏈核酸(例如人J鏈)的轉基因有蹄類動物交配?；蛘撸梢酝ㄟ^使一種或多種內源免疫球蛋白基因突變，對得自ΔHAC或ΔΔHAC轉基因胎兒的細胞(例如胎成纖維細胞)進行遺傳修飾。在另一種可能的方法中，將ΔHAC或ΔΔHAC導入到其中內源免疫球蛋白(μ重鏈和/或λ輕鏈)被半合失活或純合失活的細胞(例如胎成纖維細胞)中。在任一上述方法中，也可以通過(i)將突變(優(yōu)選敲除突變)導入內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒和/或J鏈核酸的一個或兩個等位基因中，或者(ii)導入內源J鏈核酸，對所述細胞進行遺傳修飾。然后，可以將所得的轉基因細胞用于核轉移方法中，以產生所需的轉基因有蹄類動物。以下描述示例性的方法DNA構建體可以使用以上所述的μ重鏈(圖2A)、λ輕鏈、κ輕鏈、α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒和/或J鏈敲除構建體。另一方面，可以使用以下所述的嘌呤霉素抗性μ重鏈構建體(圖3F)。這種敲除構建體設計用以除去牛μ重鏈基因座的4個主要編碼外顯子，而留下完整的跨膜結構域，導致所述μ重鏈基因座失活。嘌呤霉素抗性構建體如下裝配。將含有緊鄰編碼外顯子1的區(qū)的4.4千堿基XhoI片段插入到pBluescriptIISK+的XhoI位點。含有嘌呤霉素抗性基因的質粒pPGKPuro得自PeterW.Laird博士，WhiteheadInstitute，USA。將含有嘌呤霉素抗性基因的1.7KbXhoI片段鄰近插入到多接頭區(qū)中存在的SalI位點中的所述4.4Kb片段亞克隆，或者在其下游亞克隆。這一1.7Kb嘌呤霉素標記取代了牛免疫球蛋白重鏈基因座的編碼外顯子CH1、CH2、CH3和CH4。將含有位于野生型基因組序列中這四個外顯子下游的μ基因座的4.6Kb區(qū)的XbaI片段，加入到該構建體中，用作第二同源區(qū)。為了產生最終的打靶構建體，通過用NotI和MluI切割這三種裝配好的片段，產生該構建體的亞克隆。MluI限制性消化將所述4.6Kb片段截短至1.4Kb。NotI位點位于多接頭中，并且不可切割成為亞克隆DNA本身。MluI位點用Klenow片段補平，產生平端，然后利用pBluescriptIISK+載體中存在的NotI和SmaI位點，將NotI/補平MluI片段亞克隆到新的所述pBluescript載體中。為了進行基因打靶，最終的載體用NotI線性化。通過電穿孔進行基因打靶和轉染成纖維細胞的藥物選擇對于電穿孔，將經歷了有限次數群體倍增的1×107牛胎成纖維細胞(例如按照實施例2所述從ΔHAC或ΔΔHAC轉基因胎兒獲得的成纖維細胞)的單細胞懸浮液以1200rpm離心5分鐘，然后重懸于0.8ml無血清α-MEM培養(yǎng)基中。將重懸浮的細胞移至0.4cm電穿孔樣品池(Invitrogen，cat#.P460-50)中。接著，加入30μg限制性酶線性化的基因打靶載體DNA，用1ml移液管將樣品池中的內容物混合，然后進行一個室溫下2分鐘的孵育步驟。將樣品池插入GenePulserII電穿孔系統(Biorad)的振蕩(shocking)室中，然后以1000伏特和50μF進行電穿孔。迅速將樣品池轉移到組織培養(yǎng)櫥中，用吸管將電穿孔細胞加入到大約30ml成纖維細胞完全培養(yǎng)基中。將細胞同等地分配到30個100mm組織培養(yǎng)皿(Corning，cat#.431079)中，溫和旋轉，以使細胞均勻分布，然后于38.5℃/5％CO2下孵育16-24小時。吸出培養(yǎng)基，更換為含有所選的選擇藥物的成纖維細胞完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每兩天進行更換，持續(xù)總共7-14天。在所述藥物選擇過程中，目測監(jiān)測代表性板，以檢查細胞死亡和集落形成。設定陰性對照板，陰性對照板含有在無基因打靶載體時電穿孔的成纖維細胞，在所述藥物選擇過程中應該不產生集落。抗藥性成纖維細胞集落的挑出和細胞的擴大培養(yǎng)在完成藥物選擇步驟(通常7-14天)之后，抗藥性集落用肉眼可見，隨時可供轉移到48孔組織培養(yǎng)板中以進行擴大培養(yǎng)。為了有助于轉移過程，在用彩色標記筆(Sharpie)在組織培養(yǎng)板底部圈出單個集落。含有集落的組織培養(yǎng)板用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)洗滌2次，然后每個板加入5ml細胞解離緩沖液的1∶5稀釋液。在室溫3-5分鐘的孵育步驟之后，單集落開始與組織培養(yǎng)皿底部分離。在集落分離之前，用P200自動移液器和氣溶膠阻擋吸頭(aerosolbarrierpipettetip)(200或250μl)，將它們分別轉移到48孔組織培養(yǎng)板的一個孔中。轉移后，用吸管反復吸打，使集落完全解離，然后加入1ml成纖維細胞完全培養(yǎng)基。為了確保所述細胞是抗藥性的，在整個所述48孔期繼續(xù)進行藥物選擇。轉移的集落在38.5℃/5％CO2下培養(yǎng)，并且用倒置顯微鏡目測監(jiān)視。2-7天后，達到匯合的孔用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)洗滌2次，通過加入0.2ml細胞解離緩沖液，后接一個于室溫孵育5分鐘的步驟，使其與孔底部分離。在解離后，通過用P1000自動移液器和氣溶膠吸頭(1000μl)反復吸打使細胞進一步解離。將大約75％的解離成纖維細胞轉移到24孔組織培養(yǎng)板的各孔中進行進一步擴大培養(yǎng)，以供后續(xù)的PCR分析用，將剩余的25％轉移到第二個24孔板的一個孔中進行擴大培養(yǎng)，并且最終用于體細胞核轉移實驗。當在含有75％原始細胞的板中的細胞增殖至接近匯合時，從該克隆分離DNA進行遺傳分析。DHA制備用來分離供遺傳分析用的DNA的方法是Laird等，NucleicAcidsResearch，1991，Volume19，No.15的方法的改進方法。特別是，一旦特定克隆在24孔板的一個孔中已經達到接近匯合，則從該孔中吸出培養(yǎng)基，貼壁細胞用PBS洗滌2次。吸出PBS，更換為0.2ml緩沖液，以裂解所述細胞和從待分離DNA消化過量蛋白。該緩沖液的組成為100mMTris-HCl(pH8.5)、5mMEDTA、0.2％SDS、200mMNaCl和100μg/ml蛋白酶K。將24孔板放回組織培養(yǎng)箱中達最少3小時，從而讓所述DNA釋放和蛋白消化。將該操作的粘性產物轉移到1.5ml微量離心管中，加入0.2ml異丙醇以沉淀DNA。通過離心回收沉淀，DNA沉淀用70％乙醇漂洗，風干后，將沉淀重懸于含有10mMTris，pH8和1mMEDTA的25-50μl緩沖液中。該DNA用于克隆的PCR分析?？寺〉暮Y選用兩種不同的方法篩選克隆，兩種方法都使用聚合酶鏈式反應(PCR)。該小節(jié)中所述的所有方法可適用于任何其它基因的打靶，不同之處僅為遺傳分析所用引物的序列。按照第一種方法，用不同的兩對引物，獨立擴增穩(wěn)定轉染的產物。用一對引物來檢測克隆基因組中打靶載體的存在，而與整合位點無關。所述引物設計用以全都退火至打靶載體中存在的DNA序列上。該PCR反應的PCR產物的強度可能與已經整合到基因組中的打靶載體的拷貝數相關。因此，僅含有一個拷貝打靶載體的細胞通過所述PCR反應往往產生強度較弱的條帶。另一對引物設計用以僅檢測整合到所需基因座中的載體的拷貝。在這種情況下，一種引物設計退火到打靶載體內，而另一種引物設計用以退火至在打靶載體中不存在的、對靶基因座特異性的序列上。在這種情況下，只有當打靶載體緊鄰打靶載體中不存在的所述位點整合時，才可檢測到PCR產物，指示所需的打靶事件。如果檢測到產物，則用所述克隆進行核轉移。對于新霉素抗性重鏈敲除構建體，使用引物Neol(5′-CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3′，SEQIDNO42)和IN2521(5′-CTGAGACTTCCTTTCACCCTCCAGGCACCG-3′，SEQIDNO43)來檢測細胞中打靶載體的存在，而與整合位置無關。使用引物Neol和OUT3570(5′-CGATGAATGCCCCATTTCACCCAAGTCTGTC-3′，SEQIDNO44)來特異性地僅擴增整合到μ重鏈基因座的打靶構建體的那些拷貝。對于用來分析所述新霉素抗性重鏈敲除構建體整合的這些PCR反應，使用QiagenPCR試劑盒。所述PCR反應混合物含有每種引物各1pmole、5μl10×反應緩沖液、10μlQ溶液、5μlDNA和1μlofdNTP溶液。用水使反應混合物的總體積達到50μl。使用最初于94℃變性保溫2分鐘，進行該PCR擴增。然后通過于94℃保溫45秒、60℃保溫45秒和72℃保溫2分鐘，進行30個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，將反應混合物于72℃保溫5分鐘，然后于4℃溫育直至從PCR儀中取出混合物。在替代的方法中，用一個引物組來擴增靶基因座，并且所述PCR產物的大小是正確打靶的鑒別特征。一種引物設計退火到打靶載體中不存在的所述基因座的一個區(qū)上，而另一種引物設計退火至打靶載體中存在、但在野生型基因座中也存在的位點上。在這種情況下，不能檢測到已經在基因組中不想要的位點整合的打靶載體。因為打靶載體所缺失的區(qū)域在大小上與其位置中插入的藥物選擇標記不同，所以所述產物的大小取決于所擴增的基因座是野生型基因型還是靶基因型。含不正確插入的打靶載體或者根本沒有插入打靶載體的克隆的DNA的擴增，產生預期大小的、野生型基因座的一種PCR產物。得自含被正確打中的(“敲除的”)等位基因的克隆的DNA的擴增，產生兩種PCR產物，一種代表野生型等位基因的擴增，一種代表由于抗藥性標記取代野生型等位基因中某些序列所致的、其長度不同于所取代序列的、被改變的大小可預測的等位基因的擴增。對于嘌呤霉素抗性重鏈敲除構建體，使用引物Shortend(5′-CTGAGCCAAGCAGTGGCCCCGAG-3′，SEQIDNO45)和Longend(5′-GGGCTGAGACTGGGTGAACAGAAGGG-3′，SEQIDNO46)。這對引物既擴增野生型重鏈基因座，又擴增已經被所述嘌呤霉素構建體正確打中的基因座。這兩條帶的大小之差為0.7Kb。存在較短的條帶指示正確打靶。對于用以分析嘌呤霉素抗性重鏈敲除構建體整合的這種PCR反應，使用PromegaMasterMix試劑盒。所述PCR反應混合物含有每種引物各1pmole、2.5μlDNA和25μl2×PromegaMasterMix。用水使反應混合物的總體積達到50μl。使用最初于94℃變性保溫2分鐘，進行該PCR擴增。然后通過于94℃保溫45秒、60℃保溫45秒和72℃保溫2分鐘，進行30個循環(huán)的變性、退火和擴增。然后，將反應混合物于72℃保溫5分鐘，然后于4℃溫育直至從PCR儀中取出混合物。第一輪核轉移使用其中一個免疫球蛋白基因已被失活的經過選擇的成纖維細胞，按照實施例2中所述進行核轉移，產生在內源免疫球蛋白基因中有突變并且含有編碼異種免疫球蛋白基因的HAC的轉基因有蹄類動物。另一方面，可以使用標準方法進行核轉移，從而將得自經選擇的轉基因成纖維細胞的細胞核或染色質(即無膜包圍的一個或多個染色體)插入到去核卵母細胞中(U.S.S.N.60,258,151；于2000年12月22日申請)。這些方法也可以用于其中內源α-(1，3)-半乳糖基轉移酶、朊病毒和/或J鏈核酸已被突變的細胞。第二輪誘變和核轉移如有需要，可以由從第一輪核轉移產生的轉基因有蹄類動物獲得細胞(例如胎成纖維細胞)?？梢匀缟纤鲈龠M行一輪基因打靶，以失活在第一輪打靶中被失活基因的第二個等位基因?；蛘撸梢栽谠撦喆虬兄?，使另一免疫球蛋白(例如μ重鏈、λ輕鏈、κ輕鏈或J鏈)、α-(1，3)-半乳糖基轉移酶或朊病毒基因失活。對于這第二輪打靶，或者可以使用更高濃度的抗生素，或者可以使用具有不同抗生素抗性標記的敲除構建體。抗生素抗性細胞可以如上所述進行選擇。經選擇的細胞可以如上所述用于第二輪核轉移，以產生例如在內源免疫球蛋白基因中含有兩個突變并且含有編碼異種免疫球蛋白基因的HAC的轉基因有蹄類動物。另一方面，可以首先處理經選擇的抗生素抗性細胞，以便如下所述分離G1期細胞，將其用于第二輪核轉移。為了分離用于核轉移的G1細胞，在分離之前24小時，將5.0×105細胞接種到含有10mlα-MEM+FCS的100mm組織培養(yǎng)平板上。第二天，平板用PBS洗滌，在分離前更換培養(yǎng)基達1-2小時。將平板在Vortex-Genie2(FisherScientific，Houston，TX，中速)上振搖30-60秒，取出培養(yǎng)基，以1000G離心5分鐘，將沉淀重懸于250μlMEM+FCS中。然后選擇以胞質橋連接的新分裂的細胞雙聯體，因為這些細胞處于G1早期。這種分離方法稱為“搖出(shakeoff)”法。實施例4α-1，3-半乳糖基轉移酶活性降低的轉基因有蹄類動物通過同源重組，產生其中α-1，3-半乳糖基轉移酶基因座中的一個等位基因被突變的牛成纖維細胞系。用于產生α-半乳糖基轉移酶敲除細胞的DNA構建體，用來通過將嘌呤霉素抗性基因(puro，在實施例3中描述的)和轉錄終止盒(STOP)兩者插入到含有催化結構域的外顯子9中，防止功能性全長α-半乳糖基轉移酶mRNA的轉錄。因而，所得的未成熟α-半乳糖轉移酶轉錄物缺乏催化結構域。將所述DNA構建體(即α-半乳糖基轉移酶KO載體)經電穿孔導入三個獨立的牛成纖維細胞系中，然后分離嘌呤霉素抗性集落?；赑CR分析，在某些集落中在外顯子9區(qū)中發(fā)生同源重組。因而產生了其中α1，3-半乳糖基轉移酶基因座中的一個等位基因被突變的牛成纖維細胞系。必要時，可以使用同一種敲除載體和更高濃度的抗生素來選擇純合敲除細胞，或者使用具有一種不同抗生素抗性基因的另一種敲除構建體，使第二個等位基因突變。這種方法也可以應用于得自其它有蹄類動物的細胞，以產生可供在本文所述的核轉移法中用以產生本發(fā)明的轉基因有蹄類動物的轉基因細胞。以下進一步描述這些方法。α-1，3-半乳糖基轉移酶KO載體的構建如下產生α-1，3-半乳糖基轉移酶KO載體(圖23)。為了分離α-1，3-半乳糖基轉移酶基因外顯子9周圍的基因組DNA，使用以下引物對5′-gatgatgtctccaggatgcc-3′(SEQIDNO61)和5′-gacaagcttaatatccgcagg-3′(SEQIDNO62)，通過PCR擴增DNA探針。使用這種探針，篩選牛基因組λ噬菌體文庫，鑒定出7個陽性λ噬菌體克隆。一個克隆含有得自雄性Charolais牛成纖維細胞的DNA，通過制作限制性圖譜對其進一步分析。將含有外顯子9的NotI-XhoI基因組片段亞克隆到pBluescriptIISK(-)中，然后將puro和STOP盒插入到NotI-XhoI基因組片段中位于催化結構域5’的AviI位點。也將白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入到該載體構建體中，以殺死其中打靶盒非同源整合的細胞。轉染/敲除方法用標準電穿孔法，如下進行三個胎成纖維細胞系(兩個得自雄性Jersy牛，一個得自雌性Jersy牛)的轉染。用來培養(yǎng)所述牛胎成纖維細胞的培養(yǎng)基含有500mlαMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-鏈霉素(SIGMA)和1ml2-巰基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在轉染前一天，將細胞接種到T175組織培養(yǎng)瓶中，通過顯微鏡檢查測定達到80-100％的目標匯合度。轉染當天，大約107牛成纖維細胞經過胰酶處理，并用α-MEM培養(yǎng)基洗滌1次。在將細胞重懸于800μlα-MEM中之后，向細胞懸浮液中加入30μgDNA，通過吸打充分混合。將細胞-DNA懸浮液轉移到電穿孔樣品池中，以1,000V和50μF進行電穿孔。此后，將經電穿孔的細胞接種到帶有補充血清的α-MEM培養(yǎng)基的20個24孔板中。培養(yǎng)48小時后，將培養(yǎng)基更換為含有1μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)2-3周，以選擇嘌呤霉素抗性細胞。選擇后，挑出達到接近100％匯合的所有集落，從所述集落中提取基因組DNA，以通過PCR篩選所需的同源重組事件。靶整合的篩選如上所述，用PUREGENEDNA分離試劑盒(GentraSYSTEMS)，按照生產商的方案，從24孔的各孔中獨立地提取基因組DNA。將每種基因組DNA樣品重懸于20μl10mMTris-Cl(pH8.0)和1mMEDTA(EDTA)中。用以下引物對5′-aagaagagaaaggtagaagaccccaaggac-3′(SEQIDNO63)和5′-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3′(SEQIDNO64)，通過PCR進行篩選。一種引物的序列位于α-1，3-半乳糖基轉移酶KO載體內，另一種引物的序列恰好位于靶內源基因座中整合的載體之外(圖23)。因此，預期的PCR產物應該僅在所述KO載體通過同源重組整合到靶基因座中時才可檢測到。所述PCR反應混合物含有18.9μl水、3μl10×LAPCR緩沖液II(含Mg2+)、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlLATaq。通過將反應混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒和68℃15分鐘，進行40個循環(huán)的PCR。在PCR后，通過電泳分析反應混合物。選擇出產生預期大小PCR產物的嘌呤霉素抗性克隆(圖23)。因此，成功地產生了其中α-1，3-半乳糖基轉移酶基因座中的一個等位基因被KO載體突變的牛成纖維細胞系。實施例5使用腺相關病毒使內源基因突變的產生轉基因有蹄類動物的替代方法腺相關病毒(AAV)可以用來特異性地取代細胞基因組中存在的靶序列(Inoue等，Mol.Ther.3(4)526-530，2001)；Hirata等，J.Virol.74(10)16536-42，2000)；Inoue等，J.Virol.73(9)7376-80，1999)；和Russell等，Nat.Genet.18(4)325-30，1998))。其基因打靶率與更傳統的基因打靶法相比非常有效。AAV有廣宿主范圍和組織特異性，包括對牛和人皮膚成纖維細胞的特異性。因此，可以用AAV來產生在內源免疫球蛋白(例如μ重鏈、λ輕鏈、κ輕鏈或J鏈)、α-1，3-半乳糖基轉移酶或朊病毒基因中含有一個或多個突變的轉基因有蹄類動物細胞。然后可以將這些轉基因細胞用于本文所述的核轉移法中，以產生本發(fā)明的轉基因有蹄類動物。應用AAV，導致牛免疫球蛋白重鏈基因座以高于先前用傳統基因打靶策略(即電穿孔和脂轉染法)所達到的頻率進行同源重組。在第一輪基因打靶實驗中，在含有通過AAV載體所導入DNA的73個穩(wěn)定轉導子中，獲得5個正確打中的成纖維細胞克隆。這些實驗如下進行。AAV敲除載體AAV構建體可以通過簡單地插入外源序列或者用AAV載體中存在的新序列取代內源序列而破壞基因。圖24顯示了一種AAV構建體，其中牛免疫球蛋白重鏈μ恒定區(qū)的所有4個編碼外顯子存在于2822堿基對的BamHI-XhoI片段上。將含有市售載體pMClNeo中存在的新霉素抗性標記的1.16Kb片段，插入到得自Holstein牛的μ重鏈基因座外顯子4中存在的SacII位點中。該基因座是在分離用以產生實施例1中所述敲除載體的噬菌體克隆中所含有的基因座。為了產生所述AVV載體，將μ重鏈基因座中的SacII位點補平，構建平端，隨后將其與平端SalI接頭(NewEnglandBiolabs)連接。然后，將含有新霉素抗性基因的pMClNeo的XhoI片段與通過SalI接頭加入到該基因座的SalI位點連接?？梢赃M行這種連接，是因為XhoI和SalI限制位點具有匹配末端。這種敲除載體引起新霉素抗性基因破壞性地插入到內源μ重鏈基因中，從而使所述μ重鏈基因失活。該基因失活的發(fā)生無需使所述內源μ基因座的區(qū)缺失。設計一種替代的載體，以在打靶期間從所述內源基因座除去外顯子3和4，導致這兩個外顯子被一個功能性拷貝的新霉素抗性基因取代(圖25)。這種構建體應用從雌性Jersey牛經PCR擴增基因組DNA來產生。具體地說，使用以下引物擴增3’同源區(qū)5′GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc3′(SEQIDNO65)，該引物加入一個XbaI限制位點；和5′GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag3′(SEQIDNO66)，該引物加入一個HindIII限制位點。用加入一個XhoI限制位點的引物5′GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg3′(SEQIDNO67)和加入一個KpnI限制位點的引物5′GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg3′(SEQIDNO68)，擴增5’同源區(qū)。這些引物序列中大寫的核苷酸是不可退火至所述μ重鏈基因座上、但包括在所述引物中以加入限制位點以便于后續(xù)亞克隆步驟的核苷酸。加入前4個鳥嘌呤，以便將所述限制位點與所述引物的真正末端分開，因為限制性酶不切割位于引物真正末端的位點以及內部位點。5’同源區(qū)長1.5Kb，含有外顯子1和2。5’同源區(qū)也含有外顯子3的前25個核苷酸，以保持外顯子的剪接受體位點。所述剪接受體位點使得外顯子3可以用于剪接，并因此防止外顯子1和2可能被剪接到下游跨膜結構域，形成異常的膜結合產物。3’同源區(qū)長1.24Kb，含有緊接外顯子4下游的區(qū)域。對于圖24所示的構建體，采用標準方法，將所述打靶盒插入到Ryan等(J.ofVirology701542-1553，1996)報道的含有病毒長末端重復(LTR)序列的AAV載體中。用TtetA2包裝細胞系，如先前描述的方法(Inoue和Russell，1998，J.Virol.727024-7031，1998)，將所述AAV載體包裝到衣殼中，并且按照先前所述的方法(Zolotukhin等，GeneTherapy，6973-985，1999)進行純化。對于圖25所示的構建體，可以使用上述方法或者任何其它標準方法，將所述打靶盒插入到Ryan等所述的AAV載體或者任何其它AAV載體(例如得自Stratagene的市售載體)中，產生含有所述載體的病毒。轉導方法將得自雌性Jersey牛的成纖維細胞以40,000細胞/孔接種到48孔組織培養(yǎng)板的一個孔中，在完全培養(yǎng)基中于38.5℃和5％CO2下培養(yǎng)，直至細胞粘附到孔的底部表面。一旦細胞貼壁，則取出培養(yǎng)基，更換為含有具有圖24所示載體的AAV顆粒的0.2ml新鮮培養(yǎng)基，感染復數(MOI)為500-20,000顆粒/細胞。MOI的選擇基于測定在藥物選擇期內所產生的集落數和集落間隔(spacing)的預實驗。將板孵育過夜。在該孵育期后，轉導孔用無鈣和鎂的PBS漂洗，如上所述用或者胰酶或者細胞解離緩沖液使細胞與孔分離。通過輕輕吸打解離的細胞，獲得均一的細胞懸浮液，使得自所述孔的細胞重新分配在10個100mm組織培養(yǎng)皿中。各培養(yǎng)皿用完全培養(yǎng)基孵育過夜。在該100mm培養(yǎng)皿孵育后，將培養(yǎng)基更換為含有350微克/ml濃度的G418的選擇培養(yǎng)基。每2-3天更換選擇培養(yǎng)基，直至在培養(yǎng)皿表面肉眼可見集落。此時，挑出單個集落，將其轉移到其自身的容器中。在組織培養(yǎng)皿的外表面，標注含有集落的區(qū)域。一旦圈出所有集落，則從平板中吸出培養(yǎng)基，平板用無鈣和鎂的PBS洗滌3次。洗滌后，用1×胰酶的1∶25稀釋液漫過平板，讓其于室溫靜置，直至可見所述集落開始與平板表面分離。保持平板固定，以防止分離的集落漂浮到平板的另一位置上。用吸頭挑出50微升體積的細胞塊，將吸頭的內容物轉移到24孔組織培養(yǎng)板中的一個孔。在轉移了所有的集落后，立即加入含有G418的完全培養(yǎng)基，讓分離的克隆擴大培養(yǎng)接近匯合。當一個孔接近匯合時，將其用無鈣和鎂的PBS洗滌2次。用0.2ml細胞解離緩沖液使細胞分離。在這種細胞懸浮液中，將20μl轉移到一個新的24孔板中，讓剩余的細胞在加入2.0ml完全培養(yǎng)基后，再粘附至原始24孔板表面。將原始板孵育至100％匯合。新的板用作正確打中的細胞來源，以供將來的?？寺》ㄓ?。當得自原始24孔板的一個孔變?yōu)?00％匯合時，除去培養(yǎng)基，細胞用PBS洗滌1次。除去PBS，更換為根據Laird等(NucleicAcidsRes.194293，1991)改進的細胞裂解緩沖液。簡而言之，向該孔中加入含有200mMNaCl、100mMTris-HClpH8.5、5mMEDTA、0.2％SDS和100μg/ml蛋白酶K的0.2ml裂解緩沖液。將板再放回培養(yǎng)箱中達3小時至過夜。然后將粘性的細胞裂解液轉移到微量離心管中。加入等體積的異丙醇以沉淀DNA。在微量離心機中離心10分鐘后，棄去上清液，沉淀用0.5ml70％乙醇洗滌1次。除去乙醇后，將DNA沉淀風干，重懸于35微升TE緩沖液(10mMTrispH8和1mMEDTA)中。將3μl的等份樣品用于PCR分析。PCR分析用PCR分析，在所述載體的正確打靶方面對得自用AAV顆粒轉導的抗藥性克隆的DNA樣品進行篩選。這種篩選策略使用一種退火到編碼所述藥物抗性標記的DNA內的引物和另一種退火到靶基因座內但在所述AAV打靶顆粒中存在的序列之外的引物。僅當所述AAV打靶DNA整合到所述內源基因組的所需位置時，才可檢測到PCR產物。得自使用這些AAV顆粒的單打靶實驗的結果示于圖26?；谶@一分析，73個獨立克隆中的5個克隆含有所述正確打靶的載體DNA。該方法也可以與圖25中所示的AAV載體或者與任何其它合適的腺病毒或腺相關病毒載體一起使用。如有需要，可以通過用帶有一種不同抗生素抗性基因(即除新霉素抗性基因之外的基因)的AAV載體轉導，使所分離的集落中對第二μ重鏈等位基因突變。為了選擇所得的純合敲除細胞，在相應的抗生素存在下培養(yǎng)被感染的細胞?；蛘?，可以用含有新霉素抗性基因的AAV載體轉導所分離的集落，然后在存在高濃度抗生素(即殺死雜合敲除細胞但不殺死純合敲除細胞的抗生素濃度)的情況下培養(yǎng)所述集落。其它實施方案從上述描述中，可以明顯看出，可以對本文所述的發(fā)明作出各種變化和改進，以使其適合于各種用途和條件。這類實施方案也在以下權利要求書的范圍內。在本說明書中提及的所有出版物都通過引用結合到本文中，其程度與每個獨立出版物或專利申請具體而單獨指明通過引用結合到本文中一樣。權利要求1一種轉基因有蹄類動物，所述有蹄類動物包含一種或多種編碼整個或部分異種免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述基因經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子。2.權利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸基本上為人類核酸。3.權利要求1的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼異種抗體的核酸。4.權利要求3的有蹄類動物，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。5.權利要求4的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。6.權利要求3的有蹄類動物，其中所述抗體為多克隆抗體。7.權利要求1的有蹄類動物，其中所述Ig鏈或抗體在血清和/或乳中表達。8.權利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸包含在一個染色體片段內。9.權利要求6的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔHAC。10.權利要求6的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔΔHAC。11.權利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。12.權利要求1的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含減少內源Ig基因表達的突變。13.權利要求3的有蹄類動物，其中所述核酸包含未經重排的抗體輕鏈核酸區(qū)段，其中編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。14.權利要求3的有蹄類動物，其中所述核酸包括未經重排的抗體重鏈核酸區(qū)段，其中或者(i)編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸和/或(ii)編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個或多個核苷酸。15.權利要求1的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。16.權利要求15的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛。17.一種轉基因有蹄類動物，所述有蹄類動物包含減少內源抗體表達的突變。18.權利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達。19.權利要求18的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性IgM重鏈的表達。20.權利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達。21.權利要求20的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性Ig輕鏈的表達。22.權利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達。23.權利要求17的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達。24.權利要求17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，所述基因經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子。25.權利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸基本上為人類核酸。26.權利要求17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼異種抗體的核酸。27.權利要求26的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。28.權利要求26的有蹄類動物，其中所述抗體為多克隆抗體。29.權利要求24的有蹄類動物，其中所述Ig鏈或抗體在血清中表達。30.權利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸包含在一個染色體片段內。31.權利要求30的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔHAC。32.權利要求30的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔΔHAC。33.權利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。34.權利要求26的有蹄類動物，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。35.權利要求34的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。36.權利要求17的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。37.權利要求36的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛。38.一種有蹄類動物體細胞，所述體細胞包含一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子。39.權利要求38的細胞，其中所述核酸編碼異種抗體。40.權利要求38的細胞，其中所述核酸包含在染色體片段中。41.權利要求40的細胞，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。42.權利要求38的細胞，其中所述核酸整合到所述細胞的染色體中。43.權利要求38的細胞，其中所述核酸基本上為人類核酸。44.權利要求39的細胞，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。45.權利要求44的細胞，其中所述異種抗體為人抗體。46.權利要求38的細胞，其中所述細胞是胎成纖維細胞。47.權利要求38的細胞，其中所述細胞是B細胞。48.權利要求38的細胞，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。49.權利要求47的細胞，其中所述有蹄類動物為牛。50.一種有蹄類動物體細胞，所述細胞在編碼Ig重鏈和/或輕鏈的核酸中包含突變。51.權利要求50的細胞，所述細胞在編碼IgM重鏈的核酸中包含突變。52.權利要求51的細胞，所述細胞在所述IgM重鏈的兩個等位基因中都包含突變。53.權利要求50的細胞，所述細胞在編碼Ig輕鏈的核酸中包含突變。54.權利要求53的細胞，所述細胞在所述Ig輕鏈的兩個等位基因中都包含突變。55.權利要求50的細胞，其中所述突變?yōu)闊o義突變或缺失突變。56.權利要求50的細胞，所述細胞還包含一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子。57.權利要求56的細胞，其中所述核酸基本上為人類核酸。58.權利要求56的細胞，所述細胞還包含編碼異種抗體的核酸。59.權利要求56的細胞，其中所述核酸包含在染色體片段中，從而所述核酸獨立于所述宿主染色體而在所述有蹄類動物細胞中保持。60.權利要求59的細胞，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。61.權利要求56的細胞，其中所述核酸整合到所述細胞的染色體中。62.權利要求58的細胞，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。63.權利要求62的細胞，其中所述異種抗體為人抗體。64.權利要求50的細胞，其中所述細胞是胎成纖維細胞。65.權利要求50的細胞，其中所述細胞是B細胞。66.權利要求50的細胞，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。67.權利要求66的細胞，其中所述有蹄類動物為牛。68.一種雜交瘤，所述雜交瘤是通過權利要求47或65的細胞與骨髓瘤細胞融合而形成的。69.一種生產抗體的方法，所述方法包括下述步驟(a)將一種或多種感興趣的抗原給予包含編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物，其中所述基因座中的所述核酸區(qū)段經歷重排，導致產生對所述抗原特異性的抗體；且(b)從所述有蹄類動物回收所述抗體。70.權利要求69的方法，其中所述有蹄類動物包含減少內源抗體表達的突變。71.權利要求70的方法，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達。72.權利要求70的方法，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達。73.權利要求69的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。74.權利要求73的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。75.權利要求73的方法，其中核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。76.權利要求69的方法，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。77.權利要求69的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。78.權利要求69的方法，其中所述抗體的輕鏈由人類核酸編碼。79.權利要求69的方法，其中所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。80.權利要求69的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。81.權利要求79的方法，其中所述有蹄類動物為牛。82.權利要求69的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。83.權利要求69的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。84.權利要求69的方法，其中所述抗體從所述有蹄類動物的血清或乳中回收。85.一種生產抗體的方法，所述方法包括從包含編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物中回收異種抗體，其中所述基因座中的核酸區(qū)段經歷重排，導致產生異種抗體。86.權利要求85的方法，其中所述有蹄類動物包含減少內源抗體表達的突變。87.權利要求86的方法，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達。88.權利要求86的方法，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達。89.權利要求85的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。90.權利要求89的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。91.權利要求89的方法，其中核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。92.權利要求85的方法，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。93.權利要求85的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。94.權利要求93的方法，其中所述抗體的輕鏈由人類核酸編碼。95.權利要求93的方法，其中所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。96.權利要求85的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。97.權利要求96的方法，其中所述有蹄類動物為牛。98.權利要求85的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。99.權利要求85的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。100.權利要求85的方法，其中所述抗體從所述有蹄類動物的血清或乳中回收。101.一種產生轉基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將細胞、得自細胞的染色質或得自細胞的細胞核插入到卵母細胞中，其中所述細胞在內源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中包含一個第一突變；且(b)將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。102.權利要求101的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。103.權利要求101的方法，其中所述細胞通過包括下述步驟的方法制備將包含一個盒的核酸插入到所述細胞中，所述盒包含與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一個或多個與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的一個內源等位基因中。104.權利要求101的方法，其中所述細胞通過包括下述步驟的方法產生(a)將包含第一盒的核酸插入到所述細胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子；從而將所述第一盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第一內源等位基因中，產生第一轉基因細胞；且(b)將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉基因細胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子；其中所述第二選擇標記不同于所述第一選擇標記；從而將所述第二盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第二內源等位基因中，產生第二轉基因細胞。105.權利要求101的方法，所述方法還包括下述步驟(c)從所述胚胎、所述胎兒或者從所述胎兒產生的后代中分離出細胞；(d)將第二突變引入所述細胞的內源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中；(e)將所述細胞、得自所述細胞的染色質或者得自所述細胞的細胞核插入到卵母細胞中；且(f)將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。106.權利要求101的方法，其中所述細胞包含一種或多種編碼整個或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達一種或多種異種Ig分子，并且其中將所述細胞插入到所述卵母細胞中。107.權利要求106的方法，其中所述核酸編碼異種抗體。108.權利要求106的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。109.權利要求108的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。110.權利要求108的方法，其中所述核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。111.權利要求106的方法，其中所述核酸整合到所述細胞的染色體中。112.權利要求107的方法，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。113.權利要求112的方法，其中所述異種抗體為人抗體。114.權利要求101的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。115.權利要求114的方法，其中所述有蹄類動物為牛。116.一種產生轉基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將具有一種或多種異種核酸的細胞插入到卵母細胞中；其中所述異種核酸編碼整個或部分異種Ig基因；所述基因能夠在B細胞中經歷重排并且表達不止一種異種Ig分子；且(b)將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。117.權利要求116的方法，其中所述核酸編碼異種抗體。118.權利要求117的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。119.權利要求116或117的方法，其中所述免疫球蛋白鏈或抗體在血清和/或乳中表達。120.權利要求116的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。121.權利要求116的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。122.權利要求121的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。123.權利要求121的方法，其中所述核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。124.權利要求116的方法，其中所述核酸整合到所述細胞的染色體中。125.權利要求116的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。126.權利要求116的方法，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。127.權利要求126的方法，其中所述異種抗體為人抗體。128.權利要求116的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。129.權利要求128的方法，其中所述有蹄類動物為牛。130.權利要求8或30的有蹄類動物，其中所述核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。131.權利要求40的細胞，其中所述核酸獨立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細胞中保持。132.包含多克隆人免疫球蛋白(Ig)的有蹄類動物抗血清。133.包含多克隆人Ig的有蹄類動物的乳。134.權利要求132或133的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。135.權利要求134的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述有蹄類動物為牛。136.權利要求132或133的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述Ig針對所需抗原。137.一種產生轉基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將細胞、得自細胞的染色質或者得自細胞的細胞核插入到卵母細胞中，其中所述細胞在內源基因中包括一個第一突變，其中所述細胞在正常情況下不表達所述基因；且(b)將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。138.權利要求137的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。139.權利要求137的方法，其中所述細胞通過包括下述步驟的方法制備將包含一個盒的核酸插入到所述細胞中，所述盒包含與編碼選擇標記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述基因的一個內源等位基因中。140.權利要求137的方法，其中所述細胞通過包括下述步驟的方法產生(a)將包含第一盒的核酸插入到所述細胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與所述基因有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子；從而將所述第一盒整合到所述基因的第一內源等位基因中，產生第一轉基因細胞；且(b)將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉基因細胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標記的核酸操作上連接并且與一個與所述基因有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子；其中所述第二選擇標記不同于所述第一選擇標記；從而將所述第二盒整合到所述基因的第二內源等位基因中，產生第二轉基因細胞。141.權利要求137的方法，所述方法還包括下述步驟(c)從所述胚胎、所述胎兒或者從所述胎兒產生的后代中分離出細胞；(d)將第二突變引入所述細胞的內源基因中；(e)將所述細胞、得自所述細胞的染色質或者得自所述細胞的細胞核插入到卵母細胞中；且(f)將所述卵母細胞或由所述卵母細胞形成的胚胎在允許所述卵母細胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉移到宿主有蹄類動物的子宮中。142.權利要求137的方法，其中所述細胞是成纖維細胞。143.權利要求142的方法，其中所述細胞是胎成纖維細胞。144.權利要求137的方法，其中所述基因編碼一種抗體。145.權利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。146.權利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼朊病毒蛋白的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。147.權利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。148.權利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼外源J鏈的核酸。149.權利要求148的有蹄類動物，其中所述J鏈為人J鏈。150.權利要求38或50的細胞，所述細胞在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。151.權利要求38或50的細胞，所述細胞在編碼朊病毒蛋白的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。152.權利要求38或50的細胞，所述細胞在編碼J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。153.權利要求38或50的細胞，所述細胞包含編碼外源J鏈的核酸。154.權利要求153的細胞，其中所述J鏈為人J鏈。155.權利要求69、85、101或116的方法，其中所述有蹄類動物在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉移酶的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。156.權利要求69、85、101或116的方法，其中所述有蹄類動物在編碼朊病毒蛋白的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。157.權利要求69、85、101、116或137的方法，其中所述有蹄類動物在編碼J鏈的內源核酸中的一個或兩個等位基因中包含突變。158.權利要求69、85、101、116或137的方法，其中所述有蹄類動物包含編碼外源J鏈的核酸。159.權利要求158的方法，其中所述J鏈為人J鏈。全文摘要本發(fā)明涉及轉基因牛的產生，所述轉基因牛包含導致其內源抗體表達失活和損失并且表達異種抗體(優(yōu)選人抗體)的遺傳修飾。這通過使IgM重鏈表達失活和任選地通過使所述Ig輕鏈表達失活，并且進一步導入導致非?？贵w(優(yōu)選人抗體)表達的人工染色體而得以實現。文檔編號C12N9/10GK1486365SQ01822076公開日2004年3月31日申請日期2001年11月16日優(yōu)先權日2000年11月17日發(fā)明者J·M·羅布爾,R·A·戈德斯拜,S·E·費爾古森,黑巖義巳,富塜一磨,石田功,JM羅布爾,巳,戈德斯拜,磨,費爾古森申請人:赫馬技術有限公司,麒麟麥酒株式會社