專利名稱：棉花中一種花藥特異性啟動子(cofs)的分離和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及棉花啟動子及其在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，特別涉及棉花花藥特異性啟動子。
2.發(fā)明背景棉花是紡織工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的天然纖維。世界范圍的棉花年產(chǎn)量超過100百萬包，價值450億美元。在過去的十年里盡管依靠傳統(tǒng)培育在棉花品質(zhì)和產(chǎn)量上已經(jīng)明顯改良，但由于品種相容性和可用性狀的需求，通過傳統(tǒng)培育進(jìn)一步改良棉花性質(zhì)受到限制。遺傳工程提供了進(jìn)一步改良棉花的新方法，通過導(dǎo)入基因產(chǎn)生具有高所需性狀例如蟲害抗性的新生殖質(zhì)。
花藥是開花植物中雄性生殖器官?；ㄋ幇l(fā)育可以分為兩個一般階段。在第一階段，大多數(shù)特化細(xì)胞和組織分化，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂及小孢子四分體形成。在第二階段，小孢子從四分體中釋出隨后花粉粒成熟，組織退化，開裂及釋出花粉。在少量植物物種中已經(jīng)研究了在花藥和花粉發(fā)育期間特異性表達(dá)的基因。Allen和Lonsdale，植物雜志3261-271，1993；Bird等，植物分子生物學(xué)11651-662，1988；Brown and Crouch，植物細(xì)胞2263-274，1990；Grierson等，核酸研究148595-8603，1986；Hanson等，植物細(xì)胞1173-179，1989；Ursin等，植物細(xì)胞1727-736，1989；John和Petersen，植物分子生物學(xué)26(6)1989-1993，1994；Atanassov等，植物分子生物學(xué)381169-1178.1998；Liu等，植物分子生物學(xué)33291-300，1997；Treacy等，植物分子生物學(xué)34603-611，1997；Agnes等，植物分子生物學(xué)40857-872，1999。在煙草花藥中表達(dá)的20,000-25,000個基因中，只有10,000個基因是花藥特異性的。Kamalay和Goldberg，美國科學(xué)院院報812801-2805，1984；Koltunow等，植物細(xì)胞21201-1224，1990。
啟動子是一種DNA片段，其決定在植物和動物發(fā)育期間基因表達(dá)的時間及空間特異性。在過去的十年中，從眾多植物和動物中已經(jīng)鑒別和分離了許多組織特異性基因及其啟動子，包括棉花組織特異性基因和啟動子。Loguerico等，分子普通遺傳學(xué)261(4/5)660-671，1999；Kawai等，植物細(xì)胞生理學(xué)39(12)1380-1383，1998；Song和Allen，生物化學(xué)生物生理學(xué)Acta 1351(1)305-312，1997；Ma等，生物化學(xué)生物生理學(xué)Acta 1344(2)111-114，1997；John，植物分子生物學(xué)，30(2)297-306，1996；Rinehart等，植物生理學(xué)112(3)1331-1341，1996；Hasenfratz等，植物生理學(xué)108(4)1395-1404，1995；John和Peterson，Plant Affiol.Biol.26(6)1989-1993，1994；John和Crow，美國科學(xué)院院報89(13)5769-5773，1992。這些植物組織特異性啟動子可以用于在轉(zhuǎn)基因植物中以組織特異性方式控制外源基因表達(dá)，其在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物第二代中是顯性的。一些植物組織在所有所希望的組織或特定需要的組織中不表達(dá)高水平轉(zhuǎn)基因。例如在轉(zhuǎn)基因Bt棉花中，Bt基因表達(dá)水平在花中包括在花藥中非常低，導(dǎo)致在這些組織中蟲害抗性較低。為實現(xiàn)更好地控制棉花蟲害，鑒別在這些組織中可以產(chǎn)生較高水平的基因表達(dá)的花藥特異性啟動子是特別有益的。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了一種棉花花藥特異性啟動子，其包含棉花CoFS基因的啟動子。本發(fā)明還提供了一種棉花花藥特異性啟動子，其包含SEQ ID NO2。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其在棉花CoFS基因的棉花花藥特異性啟動子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
附圖簡述

圖1示出CoFS cDNA示差展示分析結(jié)果。
圖2提供了示出CoFS基因表達(dá)的Northern印跡。
圖3示出CoFS啟動子載體構(gòu)建體和棉花CoFS基因的示意圖。
圖4提供了在轉(zhuǎn)基因煙草植物中在CoFS基因啟動子控制下的GUS基因的表達(dá)分析結(jié)果。
圖5示出在轉(zhuǎn)基因煙草植物中在CoFS啟動子控制下的GUS基因的表達(dá)分析結(jié)果。
優(yōu)選實施方案詳述花藥特異性基因(CoFS)及其相應(yīng)啟動子通過示差展示分析分離自棉花。所述分離的啟動子的活性及組織特異性使用CoFS啟動子控制GUS報告基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因煙草植物中證實。
得自多種棉花組織cDNA的Northern印跡分析示出包含CoFS基因的cDNA克隆在花藥中高水平表達(dá)，而且在花瓣組織中也表達(dá)，但在其它組織中很少表達(dá)或不表達(dá)。見圖1所示。
花藥特異性基因(稱為CoFS)分離自棉花。所述分離的完整CoFScDNA長度為8.4kb，見表1?；贑oFS cDNA序列，分離到一個CoFS啟動子片段(2.6kb)。見表2。將所述棉花CoFS基因的核苷酸序列和推定的多肽序列與公布的序列對比表明所述基因與得自一些植物如Brassica napus(X94624)和Arabidopsis(AL078468，AL161560)的酰基輔酶A合成酶(很可能是長鏈酸性cCoA連接酶，EC 6.2.1.3)基因在氨基酸水平具有大約54-58％相同性。在核苷酸水平發(fā)現(xiàn)同源性較低，表明CoFS是在棉花中發(fā)現(xiàn)的新基因?；谝阎孽；o酶A合成酶的氨基酸序列，對CoFS序列分析表明在其開放讀框中可能含有9-10個外顯子和8-9個內(nèi)含子。
將CoFS啟動子片段與GUS基因融合構(gòu)建基因表達(dá)載體，以分析所述啟動子的功能。具有CoFS啟動子/GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物通過Southem印跡雜交鑒別。在所研究的轉(zhuǎn)基因植物中，在花藥中檢測到GUS活性，在子房，花柱和柱頭中較弱，但在花瓣或其它組織中未檢測到活性。這個結(jié)果結(jié)合Northern印跡分析結(jié)果表明CoFS啟動子在棉花中是花藥特異性的。所述啟動子在棉花花藥中在轉(zhuǎn)錄水平控制特異基因表達(dá)。所述分離的啟動子可以用于改善所需基因在花藥和植物性器官的相關(guān)組織中表達(dá)，以產(chǎn)生新的植物品種，從而通過基因操縱提高植物的品質(zhì)和產(chǎn)量。
本發(fā)明的啟動子可用于產(chǎn)生在花藥組織中具有改良的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物，尤其包括棉花。保護(hù)性基因如Bt基因在花藥組織中的較好表達(dá)使植物對Bt敏感性有害物的抗性提高?？梢栽谶@個啟動子控制下表達(dá)的基因包括適于此目的任何基因。
表1棉花CoFS基因的序列(SEQ ID NO1).
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GGGAAGCTTATCTACTTGAAGTTTTGGTAGCCCAATGAAATACTCTCGTAAATCTAGAGTTATTAGTGTAAACCCTAAAGGGATCAAATTGTATAAATTTAAATCCCTTATGACTTTCAATTGTAGATAGACTCTAATCTCGATCATGGATGTAACTCAATCTATTTGTTGGGTTTGGGGTGATTACTTCAATTCATTCCATTCATAGTTGTGAATATATTTGAGAGTATTTACGCAAACATTTGGTGTGTGCTATTTTTCCTTTGGTCTTTTGTTCTTCGTTGCCCATTCGTTCGAGTTTGCTTTCGCTATATTTTAATGCCTTAGAAAATTTTTGCGAGAATTCTCATTTTGTGAGAGTTAAGCGAACTTAGAATTATTTTTTTTAAAATCGCTTAAGGCTGTATGGTCTGTGAGACTAAAATTCTAGTCTCGTAACACTAATACAATCACAAGTAATTTACATTGTTCAAGTTCTTATTCACATAAGCGGTTGGATAAAGAAAATTAAAAAAAAACAATCGGATATAATTACAAAAAAATAAATTGAAATGTGCAATAATACAAATAATAATTATTGCTAAAGGTAAATAAAAAATGTAAATAATTATCAATGAAGTTTGAAAC CTTAAATGGTGAAGTTTGTGTCAACTAATAGAAGAAAAAATAAATTATTTATATAACTCTACTAATGTATTATTTTATTTTGTAAAATTGATTTATTTATATTATTTCTACTAAATTGATGTGGAATTAGTGATATCTACTTAATTAACTATATATAATTATAATGAATCTCCGGGACTGTGACTGGTCAAAGATCATAAAGTGGTATCCAATAAATTTAAAATGCACTTGTAAAATATTAGACTCATGATGGCACTGAGGCGGAGGTGAAGAGGCGGCAAAGCACATGGAGAAGCTATATAGAAAATTCTTTCACGAAAAAGGCAACTCTTGGCTTGTGTGTTGGGAATTGTGTTAAGAACTGGATTATATAAAAACAATTATATGGGGAAAGGAAATGGTCCACTGTCAATAGTTTACTATAAGCAAGTTGGAGATATAAAATTAAATATATATTCAGTACATATACGAGTTTGAGCAACAAAATTAGAGATCTTTTTTGTCAAGTTGATATCTTCAATTTTATAACGTAAATGTTCTTTTGAAGGCAACAGTAATGATATATATATATGTAGAAGAAATTTAACTAAAAATAGATAATTAGGCTTAATTTAATTAATTCAAGTGCAATTGTTTTATCATAATATATATTACATTACAAGGCTTGAATTATTCATATTTTAAATTTATTTATTAGTTAACAAAGTAATTATTGGTGCAA
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表3.CoFS的-275bp cDNA片段的序列(SEQ ID NO3).
GGTCACTGTGACGTGCCGTGGCTACTGTGAAACGAGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGAGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGAGCCGTGGTCACTGTGATACGTGCCGGGAGTTTTGTCTCTTTACCTAATGAATTGTCAATGCTTGGTACTGTGGGGCCCCATACCAAACATAGATGTACGCCTGGAATCTGTTCCGAAAAAAAAAAAACTGAATTCCGAGT以下非限制性實施例舉例示出了本發(fā)明。
實施例1編碼在棉花花藥中表達(dá)的CoFS序列的花藥特異性cDNA的分離將棉花種子表面用70％乙醇滅菌30-60秒，及用10％H2O2滅菌30-60分鐘，隨后用無菌水沖洗。將種子在1/2MS培養(yǎng)基上，在28℃光照16小時而萌發(fā)。從滅菌秧苗上切下子葉和胚軸，作為轉(zhuǎn)化外植體材料。將棉花植物生長于花盆中以進(jìn)行DNA和RNA提取。使用硫氰酸胍方法或SV總RNA分離系統(tǒng)(Promega)，從棉花的幼纖維，子房，花藥，花瓣，萼片，葉和根提取總RNA。使用得自mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)的寡(dT)-纖維素旋轉(zhuǎn)柱純化聚(A)+RNA。得自棉花不同組織的總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。這些cDNA在示差展示PCR中用作模板。
用示差展示試劑盒(Clontech)進(jìn)行示差展示分析。用2pg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄起始物及寡(dT)作為引物，在42℃反應(yīng)1小時合成第一鏈cDNA。示差展示PCR反應(yīng)如下進(jìn)行初始循環(huán)包括94℃5分鐘，40℃5分鐘，及68℃5分鐘，隨后進(jìn)行兩次94℃2分鐘，40℃5分鐘及68℃5分鐘循環(huán)，然后進(jìn)行25次94℃1分鐘，60℃1分鐘及68℃2分鐘循環(huán)，最后在68℃延伸7分鐘。切下目的示差展示條帶并再擴(kuò)增以進(jìn)一步分析。將PCR片段，DNA和cDNA片段亞克隆入載體中，并將用Qiagen質(zhì)粒試劑盒制備的質(zhì)粒DNA和噬菌粒DNA在PCR中用作模板。PCR產(chǎn)物通過自動測序儀測序。
棉花cDNA使用cDNA合成試劑盒(Stratagene)合成。棉花cDNA文庫通過將所述cDNA片段插入ZAP表達(dá)載體(Stratagene)中構(gòu)建。對重復(fù)性的花藥及花瓣特異性示差展示產(chǎn)物(見圖1)進(jìn)一步分析。收獲每個目的條帶中的cDNA并通過PCR擴(kuò)增而再生。隨后將分離的cDNA亞克隆入載體中并測序。
為確定哪種cDNA轉(zhuǎn)錄物在棉花花藥中特異積聚，使用得自所述cDNA克隆的探針通過與分離自棉花纖維，子房，花藥，花瓣，萼片，干，葉和根的總RNA進(jìn)行Northern印跡雜交分析cDNA表達(dá)模式。為進(jìn)行Northern印跡分析，得自不同棉花組織的RNA樣品在瓊脂糖-甲醛凝膠上分離，并通過毛細(xì)管印跡移至Hybond-N尼龍膜上。將RNA Northern印跡在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃與通過隨機(jī)標(biāo)記制備的32P-cDNA探針(Prime-a-GeneLabelling System，Promega)雜交。雜交后，將印跡在68℃，在0.1×SSC，0.5％SDS中洗30-60分鐘。
一個克隆經(jīng)鑒別為275bp CoFS cDNA片段(見表3)。發(fā)現(xiàn)此cDNA片段與Brassica napus的酰基輔酶A合成酶基因(X94624)在開放讀框的33個氨基酸區(qū)域內(nèi)呈現(xiàn)73％同源性。Northern印跡雜交證實此CoFS cDNA轉(zhuǎn)錄物在棉花花藥中大量積聚，而且在花瓣中也或多或少積聚，但這些轉(zhuǎn)錄物在來自纖維，子房，干，葉和根的RNA中未檢測到(見圖2)。這個結(jié)果示出CoFS cDNA表達(dá)在棉花中是花藥特異性的。
實施例2CoFS基因的分離及結(jié)構(gòu)分析如實施例1所述制備來自棉花的植物材料。將煙草種子表面用70％乙醇滅菌30-60秒，及用0.1％HgCl2滅菌15分鐘，隨后用無菌水沖洗。將所述種子在1/2MS培養(yǎng)基上在28℃光照萌發(fā)，并將從無菌秧苗上切下的葉用作實驗材料。
根據(jù)以下方法從棉花和煙草植物葉中提取并純化總DNA。將葉組織(2-4g)在液氮中徹底勻漿。將勻漿組織置于具有20ml冰凍的提取緩沖液的50ml試管中，并以2500rpm沉淀15分鐘。在除去上清后，將沉淀再懸浮于10ml裂解緩沖液中，在65℃溫育30分鐘。向每個試管加入10ml氯仿并與樣品混合。然后將樣品在3500rpm沉淀10分鐘。將上清移至一個清潔試管中，再一次用氯仿提取。將上清移至一個清潔試管中，并向每個試管中加入0.6體積的異丙醇以沉淀DNA。在3500rpm離心30分鐘后，將DNA用70％乙醇沖洗。然后將分離的基因組DNA溶解于無菌水中以應(yīng)用。
從棉花植物葉中構(gòu)建棉花基因組DNA文庫。將DNA用BamHI部分消化，將所述DNA片段克隆在ZAP表達(dá)載體(Stratagene)的BamHI位點(diǎn)。使用通過基因組步查PCR分離的CoFS基因片段作為探針，篩選所述棉花基因組DNA文庫。
使用通用基因組步查試劑盒(Clontech)構(gòu)建基因組步查文庫。將來自棉花植物葉的基因組DNA分別用5種限制酶消化，通過苯酚/氯仿提取純化，并在乙醇中沉淀。將消化的DNA與基因組步查銜接物連接。
相繼進(jìn)行兩個基因組步查聚合酶鏈反應(yīng)將1μl每種基因組步查DNA文庫在第一個PCR中用作模板，并將第一個PCR產(chǎn)物在第二個PCR中用作模板。所述PCR在95℃1分鐘開始，隨后進(jìn)行35次95℃15秒及68℃4分鐘的循環(huán)，最后在68℃延伸6分鐘。使用Geneclean試劑盒(Bio 101)純化靶DNA條帶。
篩選揭示了兩個CoFS基因陽性克隆。一個克隆含有一個4.801kb棉花CoFS基因區(qū)域，另一個克隆含有一個3.913kb棉花DNA片段，其攜帶部分CoFS啟動子區(qū)域。從棉花基因組步查文庫中分離3個CoFS啟動子片段(分別為0.7，1.4和2.6kb)。分離自棉花的完整CoFS基因長度為8.4kb，包括一個2.6kb啟動子區(qū)域。序列示于表1表2。
實施例3CoFS啟動子的功能分析為定性CoFS啟動子在CoFS基因的花藥特異性表達(dá)中的功能，在基因表達(dá)載體pBI121中將CoFS啟動子的0.7kb片段，1.4kb片段和2.5kb片段(代替CaMV35S啟動子)與GUS編碼序列分別融合，見圖3。
載體如下構(gòu)建。通過PCR分別在0.7，1.4和2.4kb CoFS啟動子片段的5’和3’末端產(chǎn)生一個Hind III位點(diǎn)和一個BamHI位點(diǎn)。將Hind III/BamHI片段最初亞克隆入pGEM-T載體(Promega)中。將含有CoFS啟動子片段的DNA用Hind III和BamHI消化，并將消化的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離。三個嵌合的CoFS啟動子/GUS構(gòu)建體通過分別將0.7，1.4或2.4kb片段代替CaMV35S啟動子插入pBI121載體的Hind III/BamH I位點(diǎn)中而產(chǎn)生。
所述CoFS啟動子/GUS融合基因構(gòu)建體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移用于轉(zhuǎn)化煙草，使用含有CaMV35S啟動子/GUS融合蛋白的pBI121載體作為陽性對照。所述CaMV35S啟動子是組成型啟動子，在所有植物組織中均有活性。Odell等，自然313810-812，1985；Ow等，美國科學(xué)院院報844870-4874，1987；McCabe和Martinell，生物技術(shù)11596-598，1993。
將含有CoFS啟動子/GUS融合基因的二元載體移至根癌農(nóng)桿菌菌株LBA 4404中。使用葉-盤方法(Horsch等，1985)進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化。將煙草葉切成大約2×2cm，并浸入農(nóng)桿菌懸浮液中5分鐘。將感染的煙草移植物在MS培養(yǎng)基上用1mg/L 6-BA在28℃培養(yǎng)48小時，并移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L 6-BA的選擇MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30天。選擇卡那霉素抗性(轉(zhuǎn)化的)芽。將轉(zhuǎn)化的芽從愈傷組織切下，并在具有50-100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上生根。將轉(zhuǎn)化的植物移至土壤中生長成熟。
通過DNA Southern印跡雜交及通過GUS組織化學(xué)測定分析具有嵌合CoFS啟動子/GUS基因(或35S/GUS基因)的轉(zhuǎn)基因煙草植物及陰性對照未轉(zhuǎn)化的植物。為進(jìn)行Southern印跡分析，將來自轉(zhuǎn)基因煙草植物葉的總基因組DNA用限制酶消化，在瓊脂糖凝膠上分離，并通過毛細(xì)管印跡移至Hybond-N尼龍膜上。將DNA Southern印跡在ExpressHyb溶液(Clontech)中在68℃與通過隨機(jī)標(biāo)記制備的32P-DNA探針(Promega Prime-a-Gene Labelling System)雜交。雜交后，將印跡在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中洗30-60分鐘。將32P-標(biāo)記的尼龍膜在-70℃曝光于X-光片以放射自顯影。見圖4結(jié)果。
根據(jù)先前Jefferson，植物分子生物學(xué)報道5387-405，1987所述加以一些修改，在轉(zhuǎn)基因煙草植物中進(jìn)行GUS活性組織活性分析。將得自所述植物的新鮮組織在X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中溫育過夜，所述溶液由0.1M磷酸鈉(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％X-gluc(Clontech化學(xué)制品)組成。然后將染色的植物材料清亮并通過用100％和70％乙醇徹底漂洗而固定，直接或在顯微鏡下觀測樣品并拍照。見圖5。
印跡分析結(jié)果表明CoFS啟動子/GUS基因整合入煙草基因組中。獲得50多種煙草轉(zhuǎn)基因植物并移植土壤中生長成熟。與棉花Northern印跡分析結(jié)果一致，由CoFS啟動子驅(qū)動的GUS基因在煙草花藥中特異性并強(qiáng)有力表達(dá)。在子房，花柱和柱頭中也檢測到在CoFS啟動子驅(qū)動下GUS基因的微弱活性，但在花瓣及研究的所有轉(zhuǎn)基因煙草植物的其它組織中未檢測到GUS活性。這個結(jié)果結(jié)合上述Northern印跡分析提示CoFS啟動子在植物花藥中能在轉(zhuǎn)錄水平控制特異性基因表達(dá)。
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1.一種花藥特異性啟動子，其包含棉花CoFS基因的啟動子。
2.權(quán)利要求1的啟動子，其包含SEQ ID NO2。
3.一種轉(zhuǎn)基因植物，其在權(quán)利要求1的啟動子控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種花藥特異性棉花基因(CoFS)及其活性啟動子片段。這些啟動子示出強(qiáng)花藥特異活性。
文檔編號C12N15/82GK1486369SQ01822084
公開日2004年3月31日 申請日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月17日
發(fā)明者劉建偉, 李學(xué)寶, 蔡林, 程寧輝 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院