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白紋病的控制的制作方法

文檔序號:450197閱讀:310來源:國知局

專利名稱::白紋病的控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及在植物中,更具體地說在甘蔗中白紋病的控制及植物毒素albicidin的滅活。
背景技術(shù)
:白紋病是甘蔗中的主要疾病,它在超過50個國家中發(fā)生(Chen等,1991,臺灣糖類研究所報(bào)道,0(132),19-27;Comstock和Shine,1992,植物疾病74(4),426;Grisham等,1993年,植物疾病,77(5),537;IrVine等,1993,植物疾病,77(8),846)。病原體被鑒定為甘蔗白紋病黃單胞菌(Xanthomonasalbilineas)。甘蔗白紋病黃單胞菌產(chǎn)生稱為albicidin的一個家族的抗生素和植物毒素。albicidin選擇性地阻斷細(xì)菌和葉綠體中的DNA復(fù)制。Albicidin是美國專利US4525,354的主題。不產(chǎn)生albicidin的甘蔗白紋病黃單胞菌的突變體在接種的甘蔗中不產(chǎn)生萎黃病或任何系統(tǒng)疾病癥狀(Birch和Patil,1987,生理學(xué)及分子植物病理學(xué),30,199-206)。這表明albicidin導(dǎo)致甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗的萎黃病癥狀,并在甘蔗白紋病中充當(dāng)重要角色。在細(xì)菌中已鑒定了兩種不同的albicidin抗性的機(jī)制。一種機(jī)制涉及在一些大腸桿菌突變體中喪失對albicidin的細(xì)胞通透性(Birch等,1990年,普通微生物學(xué)雜志,136,51-58)。另一機(jī)制涉及經(jīng)過形成可逆的蛋白質(zhì)-albicidin結(jié)合復(fù)合物滅活albicidin。已顯示可逆結(jié)合復(fù)合物的形成在Klebsiellaoxytoca中涉及albicidin抗性蛋白AlbB。然而,不幸的是,這些蛋白質(zhì)不能不可逆地滅活albicidin,因而認(rèn)為不能作為控制白紋病的有效的候選物。白紋病是一種在經(jīng)濟(jì)上重要的疾病,如果種植的是敏感性栽培品種,它會在甘蔗工業(yè)上引起較大的商業(yè)損失。因此,有效抵抗該疾病的方法具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。例如,植物中的白紋病抗性是每種商用澳大利亞甘蔗品種的基本需要。選擇該抗性經(jīng)過降低某些所需雜交的價值并導(dǎo)致否決非優(yōu)良的新品種而不可避免地對培育程序具有顯著的影響。培育一個新甘蔗品種大約需花費(fèi)10年時間,在培育程序的最后階段否決一個品種的工業(yè)花費(fèi)大約為1百萬美元。最近開發(fā)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Franks和Birch,1991,8月植物生理學(xué)雜志,18,471-480;Bower和Birch,1992,植物雜志,2,409-416)能使甘蔗品種得到分子改進(jìn)且提供了常規(guī)培育程序的一個補(bǔ)充機(jī)制。本發(fā)明的概述本發(fā)明起因于細(xì)菌所產(chǎn)生的albicidin解毒酶這一預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)albicidin解毒酶分泌到胞外,并且不像AlbA和AlbB,該酶不可逆地失活albicidin。該細(xì)菌被鑒定為草生歐文氏桿菌,也稱為Pantoeadispera。因此,本發(fā)明的一個目的是提供一種albicidin解毒酶,用于治療感染白紋病的植物或減少植物被白紋病感染的可能性。本發(fā)明的另一個目的是提供編碼albicidin解毒酶的DNA序列,用于產(chǎn)生基本上抗albicidin的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞,使其基本上獲得對白紋病的抗性。因此,還有另一個目的是提供基本上抗白紋病的轉(zhuǎn)基因植物。因此,在本發(fā)明的第一個方面,提供了一種能不可逆失活albicidin的albicidin解毒酶。albicidin解毒酶優(yōu)選是一種水解酶。合適的albicidin解毒酶包括但不限于包含圖3A所示的氨基酸序列的AlbD多肽?;蛘?,AlbD多肽是一種“AlbD多肽同源物”。因此,本發(fā)明包含在功能上相似于AlbD多肽的多肽。這類多肽與圖3A的AlbD多肽相比含有保守的氨基酸取代。從諸如包括酵母細(xì)胞的真核細(xì)胞的任意合適的微生物中均可獲得AlbB多肽同源物。優(yōu)選的是,AlbD多肽同源物從諸如,例如,歐文氏菌屬或Pantoea菌株的細(xì)胞中獲得。另外,AlbD多肽或其多肽同源物可經(jīng)過按例如下文所述首先分離編碼AlbD型多肽的DNA序列來獲得。本發(fā)明的albicidin解毒酶可經(jīng)過包括下列步驟的程序來制備(a)將編碼albicidin解毒酶或其生物學(xué)片段的DNA序列連接進(jìn)合適的表達(dá)載體中以形成表達(dá)構(gòu)建體;(b)將該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞;(c)表達(dá)該重組蛋白;并(d)分離重組蛋白。如本說明書中所使用的,表達(dá)構(gòu)建體是一種包含編碼一種多肽的第一核苷酸序列的核苷酸序列,其中所說的第一序列有效連接到誘導(dǎo)所說的第一序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核苷酸序列(如啟動子和終止序列)上。組成型和誘導(dǎo)型啟動子均是表達(dá)本發(fā)明的albicidin解毒酶的有用的附加序列。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以是一種載體,如質(zhì)??寺≥d體。本發(fā)明的載體可以是原核或真核表達(dá)載體,這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。用于表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞可以是原核或真核的。用于表達(dá)本發(fā)明的多肽的優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌。使用的細(xì)菌可以是大腸桿菌。表達(dá)蛋白質(zhì)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)方案,如在Sambrook等(1989,第二版,冷泉港實(shí)際室出版,1989,特別是第16和17部分)中所述按常規(guī)制備。而且,還提供了大幅度降低或抑制植物中白紋病形成的方法,所說的方法包含給植物施用albicidin解毒酶的步驟。在這種情況下,植物優(yōu)選是苷蔗和其它對白紋病敏感的植物。albicidin解毒酶可與其它試劑組合并且可以經(jīng)任何合適的方法用藥。合適的方法包括栽種前浸泡植物的莖或插枝,將albicidin解毒酶滲入或注射入植物。在第二方面,本發(fā)明涉及編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列。該核苷酸序列可包含編碼P.dispersa的albD的核苷酸序列。因此,該核苷酸序列可包含圖3B所示的完整的核苷酸序列。另外,該核苷酸序列可包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。本文使用的術(shù)語“核苷酸序列”指mRNA,RNA,cRNA,cDNA或DNA。本發(fā)明還提供了如上所述的本發(fā)明的albD核苷酸序列的同源物。本說明書中所使用的該“albD同源物”包括編碼提供albicidin抗性的這種多肽的亞序列的核苷酸序列。在這方面,密碼子序列重復(fù)意味著可改變核苷酸序列而不影響相應(yīng)的多肽序列。本發(fā)明的同源物進(jìn)一步包括編碼與本發(fā)明的AlbD多肽具有相同功能特征的多肽的核苷酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到可對本發(fā)明的AlbD多肽進(jìn)行保守的氨基酸取代,且該取代的多肽會保留本發(fā)明的AlbD多肽的功能特征。本發(fā)明的同源物進(jìn)一步包括在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的albD核苷酸序列雜交的核苷酸序列,合適的雜交條件如下所述??筛鶕?jù)下列程序制備本發(fā)明的albD同源物(i)設(shè)計(jì)優(yōu)選為簡并的引物,它至少跨越本發(fā)明的核苷酸序列的一個片段;(ii)經(jīng)PCR技術(shù)使用該引物從合適的宿主獲得的核酸提取物擴(kuò)增所述的至少一個片段。在該方面,合適的宿主優(yōu)選是一種細(xì)菌,諸如,例如歐文氏菌屬或Pantoea菌株。這里使用的“雜交”指互補(bǔ)核苷酸序列的配對以產(chǎn)生DNA-DNA雜交體或DNA-RNA雜交體。互補(bǔ)堿基序列是那些由堿基配對規(guī)則所涉及的序列。在DNA中,A與T配對,C與G配對。在RNA中,U與A配對,C與G配對。典型地是,使用斑點(diǎn)印跡,狹線印跡或Southern印跡對以雜交方式比較的核苷酸序列進(jìn)行分析。Southern印跡用于測定DNA序列的互補(bǔ)性。Northern印跡確定DNA與RNA序列的互補(bǔ)性。斑點(diǎn)和狹線印跡可用于分析DNA/RNA的互補(bǔ)性。這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。在《分子物學(xué)常規(guī)方法》(Ausubel等,編輯)(JohnWiley&Sons,Inc.1995)第2.9.1頁至2.9.20中描述了典型的方法。簡單地說,對于Southern印跡,使用凝膠電泳按大小分離DNA樣品。將按大小分離的DNA樣品轉(zhuǎn)移并固著于膜(典型地是,硝酸纖維素)上,用放射性互補(bǔ)核酸探測DNA樣品。在斑點(diǎn)印跡中,將DNA樣品直接斑點(diǎn)印跡到膜(硝酸纖維素或尼龍)上。在狹線印跡中,加長斑點(diǎn)DNA樣品。然后用放射性互補(bǔ)核苷酸探測膜。探針用放射性同位素進(jìn)行生化標(biāo)記或以易于鑒定的其它方式標(biāo)記。探針用于鑒定基因,基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。因此,核苷酸序列探針可用于鑒定互補(bǔ)核苷酸序列。mRNA探針與其相應(yīng)的DNA基因雜交。典型地是,可使用下列一般程序測定在嚴(yán)格條件下的雜交。使用上述印跡程序之一可將本發(fā)明的核苷酸(如albD或其亞序列)固著于膜上??蓸?biāo)記樣品核苷酸序列并用作探針。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的,用于上述印跡的程序,可分析探針與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到許多因素可影響結(jié)合于固著的DNA上的探針的量和鑒別率。探針的比活必須足夠高以允許檢測。典型地是,當(dāng)使用放射性雜交探針時必須至少108dpm/μg的比活以避免較弱的或不可檢測的雜交信號。具有108至109dpm/μg比活的探針可檢測大約0.5pg的DNA。本領(lǐng)域中熟知的是必需有足夠的DNA固著于膜上以允許檢測。需要具有過量的固著DNA,且在大多數(shù)情況下允許最佳檢測的可接受的量一般為涂點(diǎn)10μgDNA。向雜交溶液中加入諸如10%(w/v)硫酸葡聚糖(分子量500,000)或PEG6000的惰性聚合物也可增加雜交的敏感性。已知加入這些聚合物可增強(qiáng)雜交信號,見Ausubel,出處同上,第2,10,10部分。為了從固著于膜上的第一種核苷酸序列和用作雜交探針的第二種核苷酸序列之間的雜交獲得有意義的結(jié)果,(1)必須有足夠的探針結(jié)合于固著的DNA上以產(chǎn)生可檢測的信號(敏感性),(2)洗滌程序后,探針必須僅附著于那些與探針序列有所需互補(bǔ)程度的固著序列上(特異性)。本說明書中使用“嚴(yán)格性”指關(guān)于溫度,離子強(qiáng)度和某些有機(jī)溶劑存在的條件,在該條件下進(jìn)行核酸雜交。使用的嚴(yán)格性越高,探針與固著DNA間的互補(bǔ)程度越高?!皣?yán)格條件”指在該條件下僅具有高頻率的互補(bǔ)堿基序列的核苷酸序列互相雜交的那些條件。舉例性的嚴(yán)格條件是(1)0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1%十二烷基肌氨酸鈉,在大約42℃下至少大約30分鐘,(2)6.0M尿素/0.4%月桂磺酸鈉/0.1%SSC(20倍;3MNaCl,0.3M檸檬酸三鈉-2H2O,pH7.0),在大約42℃下至少大約30分鐘,(3)0.1×SSC/0.1%SDS在大約68℃下至少大約20分鐘,(4)1×SSC/0.1%SDS,在大約55℃下大約1小時,(5)1×SSC/0.1%SDS,在大約62℃下大約1小時,(6)1×SSC/0.1%SDS,在大約68℃下大約1小時,(7)0.2×SSC/0.1%SDS,大約55℃下大約1小時,(8)0.2×SSC/0.1%SDS,在大約62℃下大約1小時,(9)0.2×SSC/0.1%SDS,在大約68℃下,大約1小時。例如,見《分子生物學(xué)常規(guī)方法》(Ausubel等,編輯)(JohnWiley&Sons,Inc.1995),2.10.1-2.10.16頁(本文引用以供參考)和Sambrook等,《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(冷泉港出版社,1989),1.101-1.104部分。嚴(yán)格洗滌典型地進(jìn)行總共大約20分鐘到大約60分鐘。在某些情況下,需要超過一次的嚴(yán)格洗滌以去掉與albD或其亞序列并不高度相似的序列。典型地是,使用等時間的2次洗滌,如2次15或30分鐘的洗滌。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到對于嚴(yán)格洗滌可采用其它更長或更短的時間以保證鑒定相似于albD的序列。盡管嚴(yán)格洗滌典型地在大約42℃到大約68℃的溫度下進(jìn)行,但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到其它溫度可適用于嚴(yán)格條件。最大雜交典型地在低于DNA-DNA雜交體Tm的約20到25℃進(jìn)行。本領(lǐng)域熟知Tm是解鏈溫度,或兩核苷酸序列分離的溫度。估測Tm的方法是本領(lǐng)域中熟知的。例如,見Ausubel,出處同上,2.10.8頁。最大雜交典型地在低于DNA-RNA雜交體Tm約10到15℃處出現(xiàn)。其它典型的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域中熟知的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到可控制各種因素來使雜交的特異性最大化。最終洗滌嚴(yán)格性的優(yōu)化可用于保證albD基因(或其亞序列)與其它相似的核苷酸序列之間的高度雜交。在典型的雜交程序中,DNA首先固著于諸如硝酸纖維素膜或尼龍膜的膜上。將DNA固著于這類膜上的方法是本領(lǐng)域熟知的,例如,見Ausubel,出處同上,2.9.1-2.9.20頁。在0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1%十二烷基肌氨酸鈉中將膜在42℃下預(yù)雜交30-60分鐘。然后在含標(biāo)記探針的ACES雜交溶液(生命技術(shù)公司,Gaithersburg,Md.)中42℃下雜交膜1小時。接著在0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1%十二烷基肌氨酸鈉中42℃下對膜進(jìn)行2次高嚴(yán)格性的10分鐘洗滌。此后,在室溫下用2×SSC洗滌膜以去掉未結(jié)合的探針。在另一典型的雜交程序中,固著于膜上的DNA在預(yù)雜交溶液中42℃下雜交過夜。雜交后,用2次嚴(yán)格洗滌洗滌印跡,如6.0M尿素/0.4%月桂磺酸鈉/0.1%SSC,42℃。此后,在室溫下用2×SSC洗滌膜。用于檢測結(jié)合于膜上的放射性標(biāo)記的探針的放射自顯影技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。還提供了生產(chǎn)基本上抗albicidin和白紋病的轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括將編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列導(dǎo)入植物、植物部分或植物細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá),生長該植物、植物部分或植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。所述的核苷酸序列可以通過各種方法導(dǎo)入,如轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、電穿孔或用根癌土壤桿菌感染。編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列可包括上文所述的任意序列。該核苷酸序列可包括圖3B所示的完整核苷酸序列。優(yōu)選的是,該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。從任意被白紋病感染的合適的植物可獲得植物、植物部分或植物細(xì)胞。優(yōu)選的是,植物、植物部分或植物細(xì)胞從甘蔗80種獲得。另外,本發(fā)明提供了具有穩(wěn)定摻入到植物細(xì)胞中的編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物,該穩(wěn)定摻入到植物細(xì)胞中的核苷酸序列提供了對植物毒素albicidin和白紋病對植物的感染的至少部分抗性。當(dāng)然,可預(yù)料到如果為了實(shí)現(xiàn)對albicidin的抗性需要將albicidin解毒酶運(yùn)輸?shù)教禺愋约?xì)胞區(qū)室,通過構(gòu)建包含與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列框內(nèi)融合的albicidin解毒酶的翻譯融合體可實(shí)現(xiàn)該運(yùn)輸。轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域熟知的且可包括,例如,質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽,如玉米淀粉轉(zhuǎn)運(yùn)肽,如在Klosgen和Weil的論文(1991,分子普通傳學(xué),225-297-304)中所述,本文引用以供參考。該轉(zhuǎn)運(yùn)肽用于將各種蛋白質(zhì)運(yùn)向各種植物種類的質(zhì)體,例如,用于將NPTII蛋白質(zhì)定位于煙草葉綠體中(VandenBroeck等,1985)及將GUS蛋白質(zhì)定位于馬鈴薯植物葉綠體中(Klosgen和Weil,1991,自然,313,358-363)。在本發(fā)明的第三方面,提供了一種可生產(chǎn)用于治療被白紋病感染的植物和/或減小植物被白紋病感染的可能性的albicidin解毒酶的細(xì)菌。當(dāng)以優(yōu)選的實(shí)施方案所列的程序篩選時,該細(xì)菌可以是來自天然存在的能生產(chǎn)albicidin解毒酶的菌株的任何合適的菌株。合適的細(xì)菌可以是諸如草生歐文氏桿菌SB1403(也稱為PantoeadispersaSB1403)的草生歐文氏桿菌菌株。草生歐文氏桿菌SBl403的描述在優(yōu)選的實(shí)施方案中給出。該菌株以保藏號N95/21834于1995年4月11日保藏于澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室?;蛘?,該微生物可以是能在細(xì)胞外表達(dá)編碼本文所述的albicidin解毒酶的核苷酸序列的任意合適的菌株。合適的菌株包括含有編碼albicidin解毒酶的基因拷貝的大腸桿菌和合適的土壤或植物商用細(xì)菌。還提供了大幅度減小或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包含給植物或其莖施用細(xì)胞外生產(chǎn)albicidin解毒酶的細(xì)菌的步驟。該方法可包括將P.dispersa菌株或表達(dá)編碼albicidin解毒酶的克隆序列的合適的宿主作為生物控制劑。該菌株可經(jīng)過包括噴射到葉上的任意合適的方法來施用。其它施用的例子包括將培養(yǎng)物滴到根部切割器或切割種植機(jī)上,或通過噴嘴噴到新切的殘株上。該生物控制劑可與有助于其操作或完成其它功能的一種或多種其它試劑組合。其它試劑可包括殺真菌劑。附圖的簡要描述圖1是草生歐文氏桿菌SB1403的無細(xì)胞提取物的albicidin解毒的時間過程;圖2描繪了QZB103和其衍生物的物理圖譜;圖3A示出albD基因編碼的預(yù)測的多肽序列;圖3B顯示了albD基因的核苷酸序列;圖4示出albD基因產(chǎn)物編碼的氨基酸序列與分別由脫硝產(chǎn)堿桿菌albB基因和K.oxytodaalbA基因編碼的蛋白質(zhì)的最佳匹配的比較;圖5A顯示了albD基因的內(nèi)部HincII-StuI片段;圖5B為質(zhì)粒pJPAldHS的圖譜;圖6為用大腸桿菌DH5α[pQZE533]和大腸桿菌DH5α[pSB6]滅活albicidin的圖示;圖7A顯示了使用PCR和特異性側(cè)翼寡核苷酸引物擴(kuò)增的790個堿基對的albD結(jié)構(gòu)基因片段;圖7B顯示了albD預(yù)計(jì)的起始密碼子上游的凝血酶裂解位點(diǎn)的位置;圖7C表示GST-albD基因融合物構(gòu)建體pGSTALD的圖譜;圖8為顯示溫度對albD酶活性影響的條線圖;圖9代表顯示pH對AlbD酶活性影響的條線圖;圖10A代表命名為pTacAld的質(zhì)??寺D譜,顯示了在tac啟動子影響下的albD結(jié)構(gòu)基因部分的取向;圖10B是與圖7A相同的圖;圖11A顯示了甘蔗表達(dá)載體pU3Z的圖譜;圖11B是與圖7A相同的圖;圖11C顯示了構(gòu)建體pU3ZALD的圖譜;圖12為顯示在從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系中疾病嚴(yán)重性的頻率分布的條線圖,其中該植物品系用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3接種;圖13描繪了顯示在從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系中疾病嚴(yán)重性的頻率分布的線條圖,其中該植物品系用甘蔗白紋病黃單胞菌XA15接種。優(yōu)選的實(shí)施方案實(shí)施例1來自Pantoeadispersa的albicidin解毒酶在轉(zhuǎn)基因甘蔗中的表達(dá)材料和方法細(xì)菌及培養(yǎng)用于本研究的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒在表1中列出。大腸桿菌菌株DH5α用作albicidin活性指示劑菌株且也用作DNA克隆和亞克隆的宿主菌株;從澳大利亞昆士蘭州染病的甘蔗中分離的甘蔗白紋病黃單胞菌菌株XA3用作albicidin生產(chǎn)菌株;從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗中分離的不同的albicidin抗性(Albr)分離物在表2中列出。大腸桿菌菌株在LM培養(yǎng)基中生長和維持(Miller,1972,分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。冷泉港,紐約,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社),其它菌株在SP培養(yǎng)基中生長和維持(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075)。除了通常在37℃生長的大腸桿菌菌株外,所有其它菌株和分離物在28℃生長。經(jīng)過在有軌搖床上以200rpm搖動對肉湯培養(yǎng)物通氣。細(xì)菌的分離從澳大利亞昆士蘭EightMilePlains收集甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗樣品,這些樣品以70%乙醇進(jìn)行表面滅菌,然后切成小片。將片狀樣品懸浮于無菌水中并在涂布到SP瓊脂板之前在往復(fù)移動搖床上搖動1小時(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075)。以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)收集出現(xiàn)的菌落用于進(jìn)一步分析。albicidin的制備由甘蔗白紋病黃單胞菌在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的albicidin按以前所述純化(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075;Birch等,1990,普通微生物學(xué)雜志,136,51-58)。除非另有說明,HW-40(s)色譜后獲得的albicidin混合物用于本文報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。abicidin的生物測定按以前所述定量albicidin(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075)。以完整的細(xì)菌細(xì)胞來滅活albicidin向等體積的含有終濃度為1000單位/ml的albicidin的SP或LM液體培養(yǎng)基中加入OD600等于約1.5的生長活躍的細(xì)菌培養(yǎng)物。以一定的間隔取樣品并放于冰上或煮沸5分鐘。反應(yīng)后,離心樣品并收集上清。對于未煮沸的處理,將上清在生物測定前接觸UV光10分鐘。無細(xì)胞提取物的制備將細(xì)菌分離物接種于100ml的SP液體培養(yǎng)基中并在28℃搖動生長24小時。以11020×g離心10分鐘收獲細(xì)胞并在TEMM緩沖液(10mMTrispH7.45,10mMEDTA,10mMMgCl2和2mMβ-巰基乙醇)中洗滌。細(xì)胞重懸于2mlTEMM緩沖液中并用微探針(250型,BransonUltrasonicCorporation,Danbury,CT)以50%能率循環(huán)和輸出檔3在冰上經(jīng)超聲處理破碎。超聲處理以8秒破碎期及隨后8秒休息期進(jìn)行3分鐘。經(jīng)過使用相差顯微鏡檢術(shù)證實(shí)細(xì)胞破碎。以11020×g離心20分鐘去掉細(xì)胞碎片。然后使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對照以染料試劑方法測定細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)濃度(Bradford,1976,分析生物化學(xué),72,248-254)。分類學(xué)鑒定方法使用KOH方法試驗(yàn)革蘭氏反應(yīng)(Suslow等,1982,植物病理學(xué),72917-918),使用BIOLOGGNMicroplateTM(BiologInc.)試驗(yàn)不同碳源的利用,使用Hugh和Leifson(HL)試驗(yàn)(Collins和Lyne,1984,微生物學(xué)方法,第5版,倫敦,Gutterworths)進(jìn)行氧化發(fā)酵試驗(yàn)。植物材料和細(xì)菌接種甘蔗品種Q44用于所有的生物控制實(shí)驗(yàn),來自無甘蔗白紋病黃單胞菌的健康甘蔗植物的單結(jié)插條在接種前盆栽入PH1污染的溫室大約2個月。以前描述的去頂法(Birch和Patil,1983,植物病理學(xué),73-1368-1374)用于接種甘蔗白紋病黃單胞菌和草生歐文氏桿菌菌株?;钴S生長的細(xì)菌(2天的甘蔗白紋病黃單胞菌培養(yǎng)物及24小時的草生歐文氏桿菌菌株培養(yǎng)物)以14000rpm離心1分鐘,用無菌水重懸并稀釋至恰當(dāng)濃度,保存于冰上直至接種。albD基因的克隆和測序用BamHI限制性核酸內(nèi)切酶部分消化SB1403DNA并連接進(jìn)粘??寺≥d體pLAFR3的BamHI位點(diǎn)在大腸桿菌DH5α中構(gòu)建草生歐文氏桿菌SB1403的粘?;蚪M文庫。經(jīng)過將重組粘??寺∞D(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含10μg/mlTC和20U/mlalbicidin的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇albicidin抗性重組克隆。經(jīng)交叉劃線培養(yǎng)證實(shí)T6噬菌體的敏感性。根據(jù)常規(guī)技術(shù)(Sambrook等,1989,紐約,分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊,第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室)實(shí)現(xiàn)亞克隆進(jìn)pBluescriptIISK(+)。Albr克隆pQZE533和4個ExoIII缺失亞克隆(pQZE456,pQZE457,pQZE540和pQZE560)用于從克隆的albD基因雙鏈中獲得完整的DNA序列。DNA測序以(Sanger等,1977,PNASUSA,74,5463-5467)雙脫氧核苷酸鏈終止法為基礎(chǔ)。PRISMTMReadyReactionDyeDeoxyTM終止子循環(huán)測序試劑盒來自應(yīng)用生物系統(tǒng)。草生歐文氏桿菌SB1403中的albD基因的定點(diǎn)誘變組成草生歐文氏桿菌SB1403的albD基因內(nèi)部片段的326bpHincII-StuI片段連接進(jìn)自殺載體pJP5603中。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(λpir)。以限制性酶消化瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組克隆pJPAldHS。將它轉(zhuǎn)移進(jìn)遷移菌株S17-1(λpir)中,并遷移進(jìn)草生歐文氏桿菌SB1403rif中。在含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的SP瓊脂培養(yǎng)基上選擇接合后體菌落并測試albicidin解毒酶的產(chǎn)生。albD基因的PCR擴(kuò)增和修飾含albD基因的質(zhì)??寺QZE533用作PCR擴(kuò)增的模板。合成相應(yīng)于albD結(jié)構(gòu)基因5’和3’側(cè)翼區(qū)的2個寡核苷酸引物,5’和3’引物分別是(5’-TTAAGCGGGATCCGTTTTGATGGAC-3’)和(5’-GATTGAATCGTATCAGCTGGAAGAG-3’)。在200μl反應(yīng)體積中使用2ngpQZE533DNA,0.4ng/μl引物濃度,脫氧核苷三磷酸各400μM,2mMMgCl2,0.5單位Vent(exo-)DNA聚合酶和1×PCR反應(yīng)緩沖液(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行PCR反應(yīng),Perkin-ElmerCetusDNA熱循環(huán)儀用于該反應(yīng),起始熱變性溫度為95℃5分鐘,然后在95℃變性溫度下1分鐘,55℃的退火溫度下1分鐘及72℃的聚合溫度下1分鐘循環(huán)30次。完成30個循環(huán)后使用72℃的聚合溫度最后進(jìn)行7分鐘。對每次完成的PCR反應(yīng)的等份試樣(10μl)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并在溴化乙錠染色及紫外透射后觀察產(chǎn)物。以酚-氯仿提取和乙醇沉淀純化790bp的PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物溶于LTE緩沖液(10mMTrizma堿,1mMNa2EDTA,pH8.0)中并在-20℃保藏備用。AlbD酶的純化以BamHI和PvuII消化PCR擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)基因片段并連接到BamHI和SmaI消化的GST基因融合載體pGEX-2T上。所得的構(gòu)建體pGTAld含在IPTG誘導(dǎo)型tac啟動子控制下的在閱讀框內(nèi)融合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因上的嵌合albD基因(圖10)。培養(yǎng)大腸桿菌DH5α(pGSTAld)并以IPTG誘導(dǎo)。AlbD酶的純化基本上按廠家說明書(Pharmacia)進(jìn)行。簡單地說,離心沉淀細(xì)菌培養(yǎng)物,經(jīng)超聲處理制備無細(xì)胞提取物并過谷胱甘肽瓊脂糖4B親和柱。GST-AlbD融合蛋白結(jié)合到親和柱基質(zhì)上,用蛋白酶凝血酶室溫下消化16小時從GST蛋白質(zhì)分離AlbD酶蛋白質(zhì)。消化后,收集含純AlbD蛋白質(zhì)的洗脫物并以SDS-PAGE分析。純化酶在-20℃下保存于PBS緩沖液(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)加20%甘油中。單子葉表達(dá)載體的構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體構(gòu)建體的基礎(chǔ)是pGEM-4Z。從GUS基因融合質(zhì)粒pBI101(CLONTECH)分離含土壤桿菌Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合酶基因終止子序列(nos3’)的260bpUSstI-EcoRI片段并插入pGEM-4Z的SacI-EcoRI位點(diǎn)。從含遍在蛋白啟動子/蟲熒光素酶(ubiluc)融合基因的構(gòu)建體pAHC18(Bruce等,1989,美國科學(xué)院學(xué)報(bào),86-9692-9696)分離含遍在蛋白啟動子和內(nèi)含子序列的大約1.9kb的HindIII-BamHI片段。然后將該片段連接到pGEM-4Znos3’的HindIII-BamHI位點(diǎn)上。所得的單子葉植物表達(dá)載體pU3Z在啟動子/內(nèi)含子與終止子區(qū)域之間有一些諸如BamHI,SmaI,KpnI和SacI的單一限制性酶位點(diǎn),用于隨后克隆感興趣的基因(圖16)。pU3Zald和pU3ZGUS構(gòu)建體及甘蔗的轉(zhuǎn)化為了構(gòu)建pU3Zald,將Ubi-albD融合基因,PCR擴(kuò)增的albD結(jié)構(gòu)基因的BamHI-PvuII片段連接到經(jīng)BamHI和SmaI線型化的pU3Z上(圖16)。經(jīng)過將來自pBI101(CLONTECH)的BamHI-SstIGUS片段融合到載體pU3Z(未顯示基因譜)的BamHI和SacI位點(diǎn)構(gòu)建pU3ZGUS。甘蔗的轉(zhuǎn)化簡單地描述如下。按Franks和Birch(1991),澳大利亞植物生理學(xué)雜志,18,471-480所述形成并維持甘蔗栽培品種Q63的胚性愈傷組織。在轟擊前4小時將胚性愈傷組織以2.5cm直徑的環(huán)形放在滲壓劑平板(MSC3加0.2M甘露醇和0.2M山梨醇)上。使用Franks和Birch(1991),澳大利亞植物生理學(xué)雜志18,471-480所述的裝置和技術(shù)用DNA包被的鎢微粒轟擊愈傷組織。轟擊后,愈傷組織在相同的滲壓板上再維持4小時,然后轉(zhuǎn)移到MSC3(Heinz和Mce,1969)選擇培養(yǎng)基上。選擇程序和轉(zhuǎn)基因甘蔗的再生按下文所述的副標(biāo)題“轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和分析”所述用構(gòu)建體轟擊后,在含20μg/mlgeneticin的起始選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)胚性愈傷組織2周。將健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含30μg/mlgeneticin的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2周。然后經(jīng)過將健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移進(jìn)含45μg/mlgeneticin的MSC3培養(yǎng)基中大約4周實(shí)施無逃避選擇。然后,將活躍生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含相同濃度的抗生素的再生MSC培養(yǎng)基中。將這些再生平板放入熒光照射下的28℃的組織培養(yǎng)室中。培養(yǎng)大約2周后,分離小植物并放在相同的再生培養(yǎng)基上再生長直至易于盆栽。在轉(zhuǎn)基因甘蔗中表達(dá)的AlbD酶的檢測將1克甘蔗葉切成小片并在液氮中冷凍,在研缽中磨成粉末,之后加入4ml提取緩沖液(10mMKPO4,10mMDTT,1mMEDTA,3%TritonX-100,pH7.0)用于再研磨1分鐘;轉(zhuǎn)移進(jìn)10ml試管中并使其在冰盒中靜置30分鐘。4℃離心20分鐘(14000rpm)后收集上清。測量上清中的蛋白質(zhì)濃度。將上清加入到albicidin溶液中并在生物測定前在28℃保溫2小時。反應(yīng)混合物中的albicidin消失表明存在AlbD酶。結(jié)果和討論albicidin抗性細(xì)菌的分離從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗的不同部分收集到在非選擇培養(yǎng)基上顯示出菌落大小,顏色和形狀有差異的15個不同的細(xì)菌分離株。其中,13個分離株顯示出不同水平的albicidin抗性,有些具有高度抗性(1000Ualbicidin/mL),而其它僅顯示出中等或低水平的抗性(表2)。在該研究中,albicidin的一個活性單位定義為在平板覆蓋生物測定中能產(chǎn)生3mm抑制圈的毒素的量(Birch和Patil,1985,普通繳生物學(xué)雜志,131,1069-1075)。篩選能產(chǎn)生albicidin解毒酶的細(xì)菌albicidin是熱穩(wěn)定的,且其活性在100℃下30分鐘內(nèi)不受影響(Walder等,1988,分子微生物學(xué),2(4),443-454),而經(jīng)過短時間煮沸細(xì)菌細(xì)胞膜和許多蛋白質(zhì)會變性。因此可設(shè)計(jì)簡單而有效的試驗(yàn)來檢測不同albicidin抗性機(jī)制。試驗(yàn)了抗500U/mlalbicdin的細(xì)菌分離株的可能的抗性機(jī)制。已知albicidin抗性機(jī)制的一些細(xì)菌菌株用作對照。將新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物與albicidin溶液混合,培養(yǎng)后將混合物分成2部分。一部分煮沸,另一部分保持未煮沸。然后測定上清中的albicidin。表3的結(jié)果表明,經(jīng)煮沸作為可逆毒素結(jié)合機(jī)制的典型的脫硝產(chǎn)堿桿菌和大腸桿菌(pBS6)細(xì)胞可恢復(fù)albicidin活性(Basnayake和Brich,1995,微生物學(xué),141Walder等,1988,分子微物學(xué),2(4),443-454)。大腸桿菌菌株RR1Albr阻止albicidin進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。經(jīng)過與這些對照進(jìn)行比較,我們可將這些albicdin抗性分離株分成具有不同的推斷的抗性機(jī)制的3組。分離株SB1401和SB1402很可能具有類似于脫硝產(chǎn)堿桿菌和大腸桿菌(pBS6)的毒素可逆結(jié)合機(jī)制。SB501,SB1301和SB1404的抗性機(jī)制可能是毒素排斥或抗性靶。能不可逆地解毒albicidin的分離株SB101,SBl07和SB1403很可能具有albicidin解毒酶。其中,菌株SB1403顯示出最強(qiáng)的albicidin解毒活性。以無細(xì)胞提取物實(shí)驗(yàn)可證實(shí)菌株SB1403可產(chǎn)生albicidin解毒酶。圖1是SB1403無細(xì)胞提取物的時間過程反應(yīng)。在存在活性無細(xì)胞提取物時,迅速且逐漸從反應(yīng)混合物中除去abicidin。但如果在與albicidin反應(yīng)前經(jīng)煮沸變性無細(xì)胞提取物則幾乎所加的全部毒素保留在反應(yīng)混合物中。菌株SB1403的鑒定菌株SB1403是革蘭氏陰性,ONPG試驗(yàn)陽性,游動的桿形細(xì)菌,具有4-8根向周邊的鞭毛,其細(xì)胞大小為大約0.6-1.0μm寬×1.3-3.0μm長。它在SP培養(yǎng)基上可產(chǎn)生黃色色素。陽性反應(yīng)導(dǎo)致試驗(yàn)Hugh和Leifson’s培養(yǎng)基中的葡萄糖氧化或發(fā)酵。經(jīng)過使用含95碳源利用試驗(yàn)(BIOLOG)的GNMicroPlates進(jìn)一步分類該菌株。在該試驗(yàn)中,碳的利用檢測為孔中細(xì)胞呼吸的增加,導(dǎo)致四唑染料的不可逆減少。由此獲得的“呼吸印跡”與含569革蘭氏陰性種類/組鑒定型的革蘭氏陰性數(shù)據(jù)庫相匹配。這種匹配的結(jié)果表明分離株SB1403是草生歐文氏桿菌(EnterobacteragglomeransA)。以草生歐文氏桿菌SB1403生物控制白紋病表4顯示了草生歐文氏桿菌SB1403在白紋病的生物控制中非常有效。甘蔗白紋病黃單胞菌引起甘蔗Q44的嚴(yán)重?fù)p傷,接種后50%的新生葉死亡,在存活的葉中觀察到139條白色束狀紋。但在與草生歐文氏桿菌SB1403共同接種的植物中,沒有葉片死亡且僅觀察到2或3條白色束狀紋。而且,生物控制劑草生歐文氏桿菌對甘蔗無任何可檢測到的副作用。一些產(chǎn)生抗生素的草生歐文氏桿菌分離株用于生物控制火燒病,它是一種由解淀粉歐文氏桿菌引起的玫瑰植物的疾病(Vanneste等,1992,細(xì)菌學(xué)雜志,174,2785-2796)。但草生歐文氏桿菌SB1403不產(chǎn)生抗大腸桿菌和甘蔗白紋病黃單胞菌的任何可檢測到的抗生素。測定在白紋病的生物控制中由草生歐文氏桿菌SBl403產(chǎn)生的albicidin解毒酶的作用在隨后的部分中描述??寺lbicidin解毒基因大約1600個Tcr粘粒克隆以膜片轉(zhuǎn)移到含500U/mlalbicidin的LB平板上,檢測到5個albicidin抗性菌株。用BamHI消化來自4個菌株的粘粒,發(fā)現(xiàn)均含有一條8kb的共同的帶。將這一共同的片段克隆進(jìn)DNA測序載體pBluescript并命名為pQZB103(圖2)。以HincII部分消化pQZB103的質(zhì)粒DNA并再連接,再連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α且在含albicidin的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化子。分離albicidin抗性菌落的質(zhì)粒且以瓊脂糖凝膠電泳測定其大小。限制性酶消化最小的質(zhì)粒克隆pQZH301表明它僅含有2條HincII片段,一條1.9kb長,另一條為0.6kb。以雙外切核酸酶III單向缺失并再連接到克隆載體上獲得一系列pQZB301的亞克隆。將每個這類質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α且測定各自對albicidin的敏感性(圖2)。所有的Albr克隆均保持對噬菌體T6感染的敏感性,表明抗性不是由涉及albicidin吸收的Tsx孔的自發(fā)突變引起(Birch等,1990,普通微生物學(xué)雜志,136,51-58)。albicidin解毒基因的核苷酸序列該albD基因的一部分的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列在圖3B中顯示。我們僅發(fā)現(xiàn)一個開放閱讀框,它編碼一個235個氨基酸的親水蛋白質(zhì),具有24511道爾頓的分子量。在AlbD蛋白質(zhì)的235個氨基酸中,有59個帶電殘基;32個為酸性,27個堿性,導(dǎo)致等電點(diǎn)為6.23。在引導(dǎo)唯一的開放閱讀框的ATG起始密碼子(箭頭所示)上游10bp處發(fā)現(xiàn)與16SrRNA3’-UCUUUCCUCCACUA序列最佳互補(bǔ)的序列,但與AGGAGGShine-Dalgarno序列(Shine和Dalgarno,1974,美國科學(xué)院學(xué)報(bào),71,1342-1346)不完全匹配。albD的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)可能屬于因子依賴型一類(Platt,1986,生化年鑒,55,339-372)。在albD基因的終止密碼子下游發(fā)現(xiàn)非常類似于因子依賴型終止位點(diǎn)特征性TCTG共有序列(Brendel和Trifonor,1984,核酸研究,12,4411-4427)的兩個TCTT盒和一個TGTG盒。此外,T-富集區(qū)位于2個TCTT盒的上游,盡管T含量不是高度明顯。但在終止密碼子下游沒有GG富集的二聯(lián)體對稱區(qū)。使用Lipman和Person的FASTA程序通過澳大利亞國家基因組信息服務(wù)比較該基因的DNA和蛋白質(zhì)序列(圖3A)與主要序列數(shù)據(jù)庫(GenBank,EMBL,PIR和Swiss-Prot)中的所有DNA和蛋白質(zhì)序列。然而,沒有檢測到與任何已知的DNA或蛋白質(zhì)序列具有明顯的相似性。在這一方面,在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)出最大同源性的
背景技術(shù)
序列包括小鼠T-細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-IP(在136個氨基酸重疊中有28.7%的相同性,PIR保存號JH0401);根癌土壤桿菌假擬蛋白質(zhì)2(在107個氨基酸重疊中有29.0%的相同性,PIR保存號S07977);枯草芽孢桿菌二氫乳清酸酶(在95個氨基酸重疊中有30.5%的相同性,PIR保存號D39845);苜蓿根瘤菌鞭毛蛋白flaA(在154個氨基酸重疊中有21.4%的相同性,PIR保存號A39436);蔥頭假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶(在210個氨基酸重疊中有22.4%的相同性,PIR保存號48903);和XanthomonascampestriscopD同源物(在152個氨基酸重疊中28.3%的相同性,PIR保存號D36868)。我們也比較了AlbD蛋白質(zhì)序列與兩個已知albicidin結(jié)合蛋白質(zhì)的保守區(qū)(walker等,1988,分子微生物學(xué),2(4),443-454;Basnayake和Birch,1995,微生物學(xué),141)。圖4顯示了AlbD氨基酸序列與分別來自K.oxytoca和脫硝產(chǎn)堿桿菌的Albr結(jié)合蛋白質(zhì)N端的前16個氨基酸的最佳匹配。這一短的寡肽是2個蛋白質(zhì)中僅有的明顯保守區(qū)域并且很可能是albicidin結(jié)合區(qū)(Basnayake和Bich,1995,微生物學(xué),141)。如圖4所示,這3個albicidin抗性蛋白的基序似乎是“SxxxLxxL”或不太嚴(yán)格的“MYxxxFSxxxLxxLL”。草生歐文氏桿菌SB1403的AlbD酶在甘蔗白紋病黃單胞菌生物控制中的作用草生歐文氏桿菌SB1403對甘蔗白紋病黃單胞菌引起的白紋病提供了非常有效的生物控制(表4)。為確定由SB1403產(chǎn)生的albicidin解毒酶在白紋病控制中的作用,我們分離了喪失生產(chǎn)AlbD酶能力的SB1403定點(diǎn)突變體,并比較了它們與其親本菌株在白紋病生物控制中的效力。只有當(dāng)以反式提供R6Kpir基因時才能復(fù)制的“通用”自殺載體pJP5603用于在SB1403中產(chǎn)生albD基因插入突變(Penfold和Pemberton,1992,基因,118,145-146)。將AlbD基因的HincII-StuI內(nèi)部片段克隆進(jìn)pJP5603,所得的重組克隆pJPAldHS(圖5)遷移進(jìn)SB1403。以大約3.5×10-7的頻率獲得轉(zhuǎn)移接合體菌落,且75%的菌落失去其產(chǎn)生AlbD酶的能力,表明albD已成功地突變。這也表明albD基因?qū)?xì)菌生長不是必需的且它是一個單拷貝基因。已試驗(yàn)了SB1403的2個AlbD突變體對白紋病的生物控制。表5顯示用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3和草生歐文氏桿菌SM1或SM18共同接種的甘蔗與用XA3和SB1403fir處理的植物相比白色束狀帶大約多5倍。這些數(shù)據(jù)表明,AlbD酶負(fù)責(zé)白紋病的生物控制。比較克隆的albB和albD基因產(chǎn)物在大腸桿菌中的活性圖6顯示了含從脫硝產(chǎn)堿桿菌克隆的albB的大腸桿菌DH5α[pSB6]和含從草生歐文氏桿菌SB1403克隆的albD基因的大腸桿菌DH5α[pQZE533]的相對albicidin滅活活性。DH5α[pQZE533]逐漸從反應(yīng)混合物中除去albicidin且在120分鐘內(nèi)產(chǎn)生100%的albicidin的不可逆解毒。菌株DH5α[pSB6]在前15分鐘內(nèi)降低了超過50%的抗微生物活性,但不再進(jìn)一步減少。這可能是因?yàn)榻Y(jié)合蛋白以結(jié)合蛋白albicidin的摩爾比為1∶1結(jié)合并因此滅活albicidin(Basnayake和Birch,1995,微生物學(xué),141)。蛋白質(zhì)結(jié)合的albicidin在抗微生物試驗(yàn)中無活性。一旦經(jīng)形成不能再循環(huán)的蛋白質(zhì)albicidin復(fù)合物耗盡了結(jié)合蛋白,則剩余的albicidin可抑制細(xì)菌細(xì)胞中的DNA合成。經(jīng)結(jié)合蛋白降低的albicidin的抗微生物活性是可逆的;當(dāng)經(jīng)煮沸變性蛋白質(zhì)albicidin復(fù)合物時釋放出大部分的毒素活性。該數(shù)據(jù)表明AlbD酶與AlbB結(jié)合蛋白相比導(dǎo)致albicidin的不可逆解毒,與albicidin結(jié)合蛋白的可逆相互作用相比導(dǎo)致產(chǎn)生更有效的albicidin抗性方法。AlbD酶的純化及特征使用GST基因融合系統(tǒng)(Smith和Johnson,1988,基因,67∶31-40)純化albicidin解毒酶,即albD基因產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的albD結(jié)構(gòu)基因部分在相同的開放閱讀框中融合到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的C端(圖7)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌DH5α中表達(dá)的融合蛋白質(zhì)結(jié)合到GST親和柱上。用識別位于GST重組C端的裂解識別序列的位點(diǎn)特異性蛋白酶凝血酶消化融合蛋白從柱中釋放純AlbD酶蛋白質(zhì)。SDS/PAGE分析表明純化的AlbD酶具有大約25.5KDa的分子量,這與AlbD蛋白質(zhì)的預(yù)期的25411Kda分子量一致。純化的AlbD酶可在-20℃穩(wěn)定地保存于20%的甘油緩沖液中。圖8顯示該酶可在45℃解毒albicidin,但優(yōu)選具有最大活性的適宜溫度28℃。圖9顯示了AlbD酶對反應(yīng)溶液中的pH變化不敏感;該酶在pH5.8到pH8.0的范圍內(nèi)幾乎同樣好地解毒albicidin。由于純化酶能在非常簡單的磷酸緩沖液中有效解毒相當(dāng)純的albicidin,因此似乎AlbD的活性不需任何復(fù)雜的輔因子。AlbD酶的這些特征表明它能在植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)體中有效工作。為在植物中表達(dá)而進(jìn)行的DNA修飾在天然albD基因中,在+lbp上游8bp處有一個讀框外的ATG起始密碼子,當(dāng)轉(zhuǎn)移進(jìn)植物時它能干擾albD基因的高水平表達(dá)。經(jīng)過在albD基因的PCR正向引物中插入一個點(diǎn)突變可消除該假起始密碼子。結(jié)果,ATG改變成ATC,該改變還在albD基因PCR產(chǎn)物5’端產(chǎn)生了一個BamHI限制性酶位點(diǎn),用于隨后的克隆(圖10)。將PCR擴(kuò)增的無啟動子的albD結(jié)構(gòu)基因部分融合到細(xì)菌表達(dá)載體pKK223-3(Pharmacia)tac啟動子上。一個這種所得的克隆pTacAld被鑒定為含有取向正確的tac-albD融合基因(圖10)。經(jīng)過證實(shí)以pTacAld轉(zhuǎn)化的大腸桿菌解毒albtcidin證實(shí)該正確的功能。轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和分析為了檢驗(yàn)該新的albicidin解毒基因是否也能在甘蔗中提供對白紋病的抗性,將PCR擴(kuò)增的無啟動子的albD結(jié)構(gòu)基因部分插入單子葉植物表達(dá)載體pU3Z(圖11)的ubi-內(nèi)含子啟動子區(qū)和胭脂氨酸合酶聚腺苷化信號之間。所得的質(zhì)粒pU3ZAld用于經(jīng)微粒轟擊將嵌合albD基因轉(zhuǎn)化進(jìn)甘蔗(Q63)(Bower和Birch,1992,植物雜志,2,409-416)。將在合成Emu單子葉植物啟動子控制下的編碼對geneticin抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt-II)基因(pEmuKN)與pU3Zald共同轉(zhuǎn)移進(jìn)甘蔗以提供可選擇的標(biāo)記。作為對照,ubi-luc和ubi-gus報(bào)道基因構(gòu)建體pAHC18和pU3ZGUS以相同的方式與pEmuKN共同轉(zhuǎn)移進(jìn)甘蔗。在含geneticin的培養(yǎng)基上選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織并再生。檢驗(yàn)從未轉(zhuǎn)化的對照,用gus報(bào)道系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的品系,及用albD共同轟擊后選擇的品系的Q63植物選擇的葉片的蛋白粗提物滅活albicidin的能力。表6顯示了在陰性對照品系中檢測不到albicidin解毒。然而,在這種轉(zhuǎn)化品系中檢測到活性,表明albD基因在這些轉(zhuǎn)基因品系中穩(wěn)定地整合并表達(dá)。而且,作為albD表達(dá)的結(jié)果,具有albicidin解毒活性的轉(zhuǎn)基因品系對白紋病具有抗性,表現(xiàn)為在接種葉上缺乏特征性白色束狀紋(表6)。不是所有的用albD共同轟擊的品系均顯示出albicidin解毒活性或疾病抗性。這是一種預(yù)期的結(jié)果,因?yàn)閮H選擇了轉(zhuǎn)基因品系對抗生素G418(geneticin)的抗性,即由aphA(nptII)基因編碼的表型。在這些條件下用aphA共同轟擊的其它基因共同表達(dá)的效率典型地范圍為20%到60%。用病原菌攻擊轉(zhuǎn)基因植物在溫室中生長大約3個月后,用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3或XA15攻擊植物。圖12-13顯示了用albD共同轟擊后再生的許多轉(zhuǎn)基因植物顯示出對白紋病抗性增加,表現(xiàn)為在接種葉上少或沒有特征性的白色束狀紋癥狀,而未用albD轟擊的對照品系典型地形成多條白色束狀紋。在轉(zhuǎn)基因品系中缺乏白色束狀紋與解毒albicidin的能力相關(guān)(表6)。結(jié)論分離出了產(chǎn)生強(qiáng)有力的植物毒素(albicidin)解毒酶(AlbD酶)的細(xì)菌菌株SB1403并鑒定為草生歐文氏桿菌(或Pantoeadispersa)。SB1403在對由甘蔗白紋病黃單胞菌引起的甘蔗白紋病的生物控制中非常有效,且AlbD酶是該生物控制的決定因素之一。已克隆并測序了編碼AlbD酶的基因,albD基因是新基因,在DNA或蛋白質(zhì)水平上與任何其它已知的DNA或蛋白質(zhì)序列沒有任何明顯的序列同源性。已將AlbD酶純化成均質(zhì)。該酶在5.8-8.0的pH范圍內(nèi)有效滅活albicidin。該酶活性的最適溫度為28℃。該酶不需復(fù)雜的輔因子。經(jīng)PCR去除干擾在植物細(xì)胞中表達(dá)的閱讀框外ATG(起始)密碼子。將PCR修飾的albD基因的編碼序列克隆進(jìn)含有玉米遍在蛋白啟動子和胭脂氨酸合酶3’終止子的甘蔗表達(dá)載體中。經(jīng)粒子轟擊將它導(dǎo)入甘蔗中。表達(dá)AlbD酶的轉(zhuǎn)基因植物對由甘蔗白紋病黃單胞菌引起的白紋病具有抗性。實(shí)施例2以滅活albicidin的Pantoeadispera菌株對甘蔗白紋病進(jìn)行生物控制材料和方法細(xì)菌,培養(yǎng)基和生長條件按以前所述(Birch和Patil,1987,生理學(xué)及分子植物病理學(xué),30,199-206)從患白紋病的甘蔗分離甘蔗白紋病黃單胞菌XA3。用于該研究的所有其它細(xì)菌在表7中列出。大腸桿菌在37℃的LM培養(yǎng)基中生長(Miller,1972,分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn),冷泉港,紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。所有其它細(xì)菌于28℃在SP培養(yǎng)基(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075)中生長。經(jīng)過在有軌搖床上以180rpm搖動給液體培養(yǎng)基通氣。albicidin的制備和測定按以前所述(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075;Birch等,1990,普通微生物學(xué)雜志,136,51-58)純化在甘蔗白紋病黃單胞菌XA3培養(yǎng)物中產(chǎn)生的albicidin。HW-40(s)色譜后獲得的albicidin混合物用于此處報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。按以前所述(Birch和Patil,1985,普通微生物學(xué)雜志,131,1069-1075)定量albicidin,不同之處是大腸桿菌DH5用作指示菌株,1%瓊脂糖用于覆蓋。albicidin抗性細(xì)菌的分離從澳大利亞Brisbane糖類實(shí)驗(yàn)站辦公署進(jìn)行的疾病抗性試驗(yàn)中收集患白紋病的甘蔗。顯示出甘蔗白紋病黃單胞菌侵染征狀的葉和莖樣品經(jīng)70%乙醇進(jìn)行表面滅菌,然后切碎,在搖動條件下懸浮于無菌水中1小時,然后涂布到SP瓊脂平板上。再劃線培養(yǎng)明顯可見的菌落類型以確保分離株的純度,經(jīng)過劃線到含特定濃度抗生素的平板上試驗(yàn)其albicidin抗性。試驗(yàn)albicidin抗性機(jī)制將活躍生長的細(xì)菌培養(yǎng)物(600nm下的光密度為1.5)加到等體積的含終濃度為500ngml-1的albicidin的SP培養(yǎng)基中,然后在28℃培養(yǎng)6小時。將樣品放于冰上或煮沸5分鐘,然后以11020xg離心10分鐘。在未煮沸的處理中接觸UV(312nm)10分鐘后測定上清的albicidin。以無細(xì)胞過濾物和細(xì)胞提取物滅活A(yù)lbicidin菌株SB1403在培養(yǎng)基中生長40小時,然后在冰上冷凍并以11020xg離心10分鐘。上清過濾滅菌(GelmanAcradisc0.2μm),然后貯存于冰上或用20μgml-1蛋白酶K(sigma)處理1小時。然后如上所述檢驗(yàn)SP培養(yǎng)基中滅活albicidin的能力。為了制備細(xì)胞提取物,經(jīng)過在11020xg下離心10分鐘收獲24小時肉湯培養(yǎng)物中的細(xì)胞,洗滌并重懸于TEMM緩沖液(10mmol.l-1TrispH7.45,1mmol.l-1EDTA,1MMOLl-1MgCl2和2mmoll-1p-硫基乙醇)中,用微探針(Branson250型),以50%能率循環(huán)和25-45W的輸出在冰上聲處理破碎細(xì)胞,處理為8秒聲處理及隨后8秒靜止期共進(jìn)行3分鐘。用相差顯微鏡檢術(shù)證實(shí)細(xì)胞破碎。以11020xg在4℃離心20分鐘去掉細(xì)胞碎片。使用牛血清白蛋白作校準(zhǔn)經(jīng)染料結(jié)合(Bradford,1976,分析生化,72,248-254)測量細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)濃度。分類鑒定和抗生測定使用Hugh和Leifson試驗(yàn)(Collins和Lyne,1984,微生物學(xué)方法,第5版,倫敦Butterworths)檢測菌株SB1403的葡萄糖氧化和酵解,并檢測其中β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生(ONPG檢驗(yàn)),在BIOLOGGN微板系統(tǒng)中碳源的利用,及在3%KOH中的可溶性作為草蘭氏反應(yīng)的斷定(Suslow等,1982,植物病理學(xué),72-917-918)。使用大腸桿菌DH5α和甘蔗白紋病黃單胞菌XA3作指示菌株檢驗(yàn)菌株SB1403中抗生素的生產(chǎn)。使用如對albicidin所述的覆蓋試驗(yàn)檢測在SP肉湯中生長了1,2和3天后的無細(xì)胞培養(yǎng)基濾過物。經(jīng)過與CHCl3蒸汽接觸殺死在SP瓊脂中培養(yǎng)2天后的菌落,然后用指示細(xì)菌覆蓋。植物材料和細(xì)菌接種對自紋病高度敏感的甘蔗品種Q44用于所有生物控制實(shí)驗(yàn)中。來自健康植物的單節(jié)插枝在溫室中生長大約2個月,然后按以前所述(Birch和Patil,1983,植物病理學(xué),73,1368-1374)的去頂方法用甘蔗白紋病黃單胞菌和P.dispersa菌株接種。接種物由來自活躍生長的培養(yǎng)物(甘蔗白紋病黃單胞菌的2天培養(yǎng)物,P.dispersa的24小時培養(yǎng)物)中的細(xì)菌組成,將它們以11020xg離心1分鐘,用無菌水重懸并稀釋至指定濃度,并保存于冰上直至接種。經(jīng)過覆蓋到新切的植物表面進(jìn)行接種。接種2周后檢查植物切過的葉片上的癥狀,監(jiān)測系統(tǒng)癥狀形成共6周。從接種1個月后的葉片及從接種后6個月的幼莖組織嘗試溶解細(xì)菌。含200μgml-1氨芐青霉素或500ngml-1氨芐青霉素或500ngml-1albicidin的SP平板分別用于選擇性地再分離甘蔗白紋病黃單胞菌ZA3和P.dispersaSB1403。結(jié)果和討論albicidin抗性細(xì)菌的分離在從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗中分離的具有明顯的集落特征的15個細(xì)菌分離株中,有13個分離株被證實(shí)為抗50ngml-1(大腸桿菌的最小抑制濃度)的albicidin,3個分離株對1000ngml-1albiidin有抗性(表1)。篩選解毒albicidin的細(xì)菌許多細(xì)菌活躍地從周圍培養(yǎng)基中積累albicidin。對于大腸桿菌,已知該過程涉及經(jīng)Tsx外膜孔活躍地吸收,消除吸收則導(dǎo)致albicidin抗性(Birch等,1990,普通微生物學(xué)雜志,136,51-58)。一些細(xì)菌由于產(chǎn)生結(jié)合該抗生素的細(xì)胞內(nèi)蛋白而對albicidin具有抗性(Wallker等,1988,分子微生物學(xué),2,443-454;Basnayake和Birch,1995,微生物學(xué),141,551-560)。albicidin具有熱穩(wěn)定性,在100℃處理30分鐘損失較少活性,而細(xì)菌細(xì)胞膜和許多蛋白質(zhì)在煮沸時變性,釋放出可逆結(jié)合的albicidin。這使得可以以一個簡單的試驗(yàn)來區(qū)分albicidin抗性的各種機(jī)制。將細(xì)菌樣品與albicidin溶液混合,培養(yǎng)后取出等份試樣并保存于冰上或煮沸,之后在上清中測定albicidin活性。當(dāng)使用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物時,該試驗(yàn)區(qū)分毒素失活與其它已知的抗性機(jī)制。在該試驗(yàn)中使用稠密的細(xì)胞懸液,細(xì)胞提取物或培養(yǎng)上清進(jìn)一步區(qū)分作為抗性機(jī)制的毒素排斥,毒素結(jié)合,可能的抗性靶及胞內(nèi)對輸出的蛋白。與用已知抗性機(jī)制的對照相比,使用來自甘蔗的albicidin抗性細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物的結(jié)果顯示出包括albicidin解毒的第一個實(shí)施例在內(nèi)的不同抗性機(jī)制(表7)。顯示出最強(qiáng)albicidin解毒的菌株SB1403以更詳細(xì)地方式進(jìn)行鑒定。隨培養(yǎng)物的時間從24小時到40小時,該菌株的培養(yǎng)濾過物顯示出細(xì)胞外活性逐漸增加。來自40小時的培養(yǎng)物的培養(yǎng)濾過物在6小時的保溫期間消除300ngml-1albicidin溶液的抗生素活性,煮沸混合物時不能恢復(fù)抗生素活性。培養(yǎng)濾過物滅活albicidin的能力經(jīng)過用蛋白酶K處理而消除。菌株SB1403的細(xì)胞提取物也引起albicidin的逐漸的和不可逆的失活(圖13)。這些觀察表明菌株SB1403以酶促解毒albicidin。分類鑒定菌株SB1403是革蘭氏陰性,桿形細(xì)菌(0.6-1.0μm×1.3-3.0μm),具有4-8條外周鞭毛。在SP瓊脂上菌落為黃色。該菌株對于葡萄糖的氧化和酵解,β-半乳糖苷酶的生產(chǎn),L-阿拉伯糖,纖維二糖,甘油,肌醇,麥芽糖,N-乙酰-D-葡糖胺,D-甘露醇,D-甘露糖,L-鼠李糖,蔗糖和海藻糖的代謝為陽性。在對苯丙氨酸脫氨酶,精氨酸二水解酶,鳥氨酸脫羧酶的試驗(yàn)中,及丙二酸,D-阿東糖醇,乳糖,Lactulose,L-赤蘚糖醇,L-巖藻糖,松二糖,木糖醇,D-半乳糖醛酸內(nèi)酯和N-乙酰-D-半乳糖胺的代謝為陰性。這些特征使得鑒定菌株SB1403為Pantoeadispera(Gavtni等,1989,國際分類細(xì)菌學(xué)雜志,39,337-345)。然而,菌株SB1403從棉子糖,山梨糖醇和α-甲基-D-葡萄苷產(chǎn)酸而不同于以前鑒定的P.dispersa菌株。以P.dispersaSB1403對白紋病的生物控制P.dispersa隨病原體同時施用到受傷的甘蔗上時對甘蔗白紋病黃單胞菌的生物控制非常有效(表8)。甘蔗品種Q44對白紋病高度敏感,用甘蔗白紋病黃單胞菌接種后在新生葉中形成嚴(yán)重癥狀。用于本實(shí)驗(yàn)的接種物濃度在2周內(nèi)導(dǎo)致50%的接種的葉片玖死亡,在存活的葉片中平均有14條特征性白色束狀紋占據(jù)植物。在用P.dispersaSB1403共同接種的植物中,沒有葉片死亡,且白色束狀紋的頻率減少98%,即使在接種物中使用超出10倍的甘蔗白紋病黃單胞菌細(xì)胞。生物控制劑P.dispersaSB1403侵入受傷的甘蔗葉片而不引起任何所見的癥狀或?qū)臃N的甘蔗植物的生長產(chǎn)生任何明顯的有害影響。接種6個月后,其存在于明顯健康的甘蔗植物幼莖組織中的群體比以水接種的對照的相似生物高103倍。甘蔗白紋病黃單胞菌易于從顯示白色束狀紋的接種葉中再分離。接種6個月后,超過90%的單獨(dú)用甘蔗白紋病黃單胞菌接種的植物死亡。相反,與生物控制劑共同接種的植物未形成系統(tǒng)白紋病癥狀且即使在允許病原菌生長但不允許生物控制劑生長的含氨芐青霉素的SP培養(yǎng)基中也不能再分離出病原體。由于在甘蔗的機(jī)械收獲期間甘蔗白紋病黃單胞菌非常有效地傳播(Taylor等,1988,甘蔗,1988(4),11-14),經(jīng)過同時應(yīng)用P.dispersaSB1403提供高水平的生物控制劑對于限制野外病原菌的傳播有用。例如,可經(jīng)過滴到根部切割器上或通過噴嘴噴到新切斷的殘株上可施用生物控制劑。相似地方法可用于機(jī)械收割機(jī),它典型地是已裝配了一個噴灑或滴水系統(tǒng)以便在栽種前將殺真菌劑施用到基段的切口末端上。提供抗解淀粉歐文氏桿菌引起的火燒病(Vanneste等,1992,細(xì)菌學(xué)雜志,174,2785-2796)或Leptosphaeriamaculans引起的黑腿病(Chakraborty等,1994,應(yīng)用微生物學(xué)通訊,18,74-76)的生物控制的草生歐文氏桿菌菌株(syn.Pantoeaspp;Gavini等,1989,國際分類細(xì)菌學(xué)雜志,39,337-345)產(chǎn)生對抗這些病原菌的抗微生物物質(zhì)。P.dispersaSB1403不產(chǎn)生任何可檢測的有效抗大腸桿菌或甘蔗白紋病黃單胞菌的抗生素。相反,P.dispersaSB1403產(chǎn)生保護(hù)該生物控制劑抵抗由該病原菌產(chǎn)生的albicidin抗生素的解毒酶。由于已知albicidin在甘蔗白紋病黃單胞菌的致病性中起作用,因此albicidin解毒可不僅有助于P.dispersa在與甘蔗白紋病黃單胞菌的競爭中在作為最初侵入位點(diǎn)的傷口處形成菌落,而且經(jīng)過去除為病原體建立和甘蔗中系統(tǒng)白紋病的形成所必需的albicidin植物毒素而保護(hù)植物。實(shí)施例3進(jìn)一步的研究證實(shí)albicidin解毒酶在甘蔗白紋病黃單胞菌中表達(dá)效率的實(shí)驗(yàn)將含草生歐文氏桿菌SB1403的完整albD基因(包括啟動子,結(jié)構(gòu)基因和終止子區(qū))的806bpSphI-PvuII片段鈍端化并連接進(jìn)自殺載體pJP5603的HindII位點(diǎn)。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Npir)。限制性酶消化和瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組克隆pJPAldSP,將它轉(zhuǎn)移進(jìn)遷移菌株S17-1(Npir),并遷移進(jìn)抗氨芐青霉素的甘蔗白紋病黃單胞菌XA3中。在含50μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨芐青霉素的SP瓊脂培養(yǎng)基上選擇接合后菌落并試驗(yàn)albicidin生產(chǎn)和AlbD酶的合成。遺傳修飾的表達(dá)albD的甘蔗白紋病黃單胞菌不能在敏感甘蔗上誘導(dǎo)疾病,而親本甘蔗白紋病黃單胞菌菌株誘導(dǎo)嚴(yán)重的癥狀。這進(jìn)一步支持了albicidin在致病性中的重要性及albD基因用于提供疾病抗性。進(jìn)一步證實(shí)各種甘蔗品系對白紋病抗性的實(shí)驗(yàn)修飾albD基因以用于在植物中表達(dá),經(jīng)顆粒轟擊將它導(dǎo)入白紋病敏感的甘蔗栽培品種Q63。已再生出用albD和NPT-II基因共同轟擊的超過60個的品系,其中大約半數(shù)表達(dá)毒素抗性基因。用甘蔗白紋病黃單胞菌攻擊來自用albD共同轟擊的34個品系及20個對照品系的植物。在對對照引起嚴(yán)重癥狀(90%的感染率,在接種葉上每株植物平均有13條白色束狀紋,且許多植物迅速死亡)的條件下Teb轉(zhuǎn)基因品系顯示出無疾病癥狀。這證實(shí)了albD在轉(zhuǎn)基因甘蔗中作為白紋病抗性基因的有效性。用albicidin解毒酶進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)AlbD酶似乎是一種水解酶,有2個證據(jù)支持這一預(yù)測。首先,在失活的albicidin中發(fā)現(xiàn)純化的AlbD酶與純化的albicidin在水中結(jié)合。由于不需要輔助因子且在這些條件下其它已知激活機(jī)制不能工作,所以失活的方式指向水解。其次,以HPLC分析的滅活反應(yīng)顯示出albicidin丟失且伴隨著代表反應(yīng)產(chǎn)物的兩個峰的產(chǎn)生。同樣,該結(jié)果也指向水解反應(yīng)。表1細(xì)菌菌株和質(zhì)粒表2從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗植株中分離的細(xì)菌表3來自甘蔗的albicidin抗性細(xì)菌和其可能的抗性機(jī)制表3重量百分比(活性組分)<p>表7來自甘蔗的albicidin抗性細(xì)菌及可能的抗性機(jī)制</tables>表8由P.dispersaSB1403*對甘蔗白紋病的生物控制<<p>圖表說明表1*在albD基因克隆和測序中構(gòu)建的質(zhì)粒在圖2中顯示。表3*反應(yīng)混合物的終濃度為500μ/ml,各處理一式三份。表4*每個處理有10株植物。接種后從4片新生葉中記錄癥狀。X.a=甘蔗白紋病黃單胞菌XA3,E.h=草生歐文氏桿菌SB1403。X.a和E.h之后的數(shù)字代表細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的相對比例,10=4×108C.F.U(菌落形成單位)。每株植物的接種體積為200μL。表5*每次處理有6株植物,接種后從4片新生葉中記錄癥狀。括號中的數(shù)字代表接種中使用的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的相對比例,10=4×108C.F.U。每株植物的接種體積為200μl。表7*在頂部組中的菌株為具有已知抗性機(jī)制的對照(Birch等,1990,Basnayake和Birch,1995)。在本實(shí)驗(yàn)中從染病的甘蔗分離出以SB開始命名的菌株。結(jié)果是三次重復(fù)的平均值。表8*對白紋病高度敏感的甘蔗品種Q44接種14天后記錄癥狀。結(jié)果為在每次處理的10株植物中4片接種葉的總數(shù)。+接種物由含有所示比例的病原菌和生物控制劑的200μl體積組成,其中10等于4×108菌落形成單位。圖1以草生歐文氏桿菌SB1403的無細(xì)胞提取物解毒albicidin的時間過程。將含100μg總蛋白的變性的(煮沸5分鐘)和非變性的無細(xì)胞提取物加入含300ngalbicidin的終體積為100μl的TEMM緩沖液中,并在28℃保溫。經(jīng)煮沸3分鐘終止反應(yīng)。在生物測定前將反應(yīng)混合物離心(14000rpm)5分鐘。圖2pQZBl03和其衍生物的物理圖譜。在線型化質(zhì)粒圖譜兩端以空心盒代表克隆載體pBluescriptIISK+。除pQZB103和pQZH301外,以ExoIII單向缺失產(chǎn)生所有其它質(zhì)粒。顯示了在大腸桿菌DH5α中編碼的各質(zhì)粒的albicidin抗性或敏感性。圖3albD基因的核苷酸序列和其基因產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。還顯示了用于擴(kuò)增編碼區(qū)及消除假(ATG)起始密碼子的PCR引物。圖4albD基因產(chǎn)物(A)的氨基酸序列與脫硝產(chǎn)堿桿菌albB基因(B)和K.oxytocaalbA基因(C)所編碼的albicidin結(jié)合蛋白N端的前16個氨基酸的最佳匹配,符號雙點(diǎn),相同氨基酸;單點(diǎn),在其側(cè)鏈上具有相似特征的氨基酸。圖5用于定點(diǎn)誘變草生歐文氏桿菌SB1403中的albD基因的自殺質(zhì)粒克隆pJPAldHS的構(gòu)建。(A)分離albD基因的內(nèi)部HincII-StuI片段(以陰影顯示的AldHS片段,326bp),顯示了其與ATG起始密碼子和TAG終止密碼子間的相對距離。(B)pJPAldHS的圖譜。將AldHS片段連接到自殺載體pJP5603的HincII位點(diǎn),以HincII和BamHI限制性酶雙重消化測定pJPAldHS中AldHS片段的取向。圖6以大腸桿菌DH5α[pQZE533]和大腸桿菌DH5α[pSB6]滅活albicidin。質(zhì)粒pQZE533和pSB6分別含從草生歐文氏桿菌SB1403克隆的albD基因和來自脫硝產(chǎn)堿桿菌的albB基因。圖7用于純化albD酶蛋白質(zhì)的GST-albD基因融合質(zhì)粒的構(gòu)建。(A)使用一對來自含草生歐文氏桿菌SB1403的完整albD基因的質(zhì)??寺QZE533的寡核苷酸引物經(jīng)PCR擴(kuò)增790bp的albD結(jié)構(gòu)基因片段。5’引物覆蓋了albD基因的ATG起始密碼子(下面劃線)區(qū),且含有一個錯配核苷酸C(以*表示)代替原始核苷酸G。3’引物跨越TAG終止密碼子下游38bp的區(qū)域。示出了寡核苷酸引物上的BamHI和PvuII限制性酶位點(diǎn)。(B)用BamHI和PvuII消化PCR擴(kuò)增的albD結(jié)構(gòu)基因片段并連接到以BamHI和SmaI線型化的GST基因融合載體PGEX-2T上。顯示了融合區(qū)的序列并顯示了位點(diǎn)特異性蛋白酶凝血酶的裂解-識別序列。(C)GST-albD基因融合構(gòu)建體pGSTALD的圖譜。圖8溫度對AlbD酶活性的影響。純化的AlbD酶和albicidin在0.2M磷酸緩沖液,pH7.0中混合,終濃度為2ng/μlAlbD酶和15u/μlalbicidin;反應(yīng)混合物在預(yù)先設(shè)定為不同溫度的水浴中保溫30分鐘。經(jīng)過煮沸3分鐘終止反應(yīng)。測定殘留于反應(yīng)混合物中的albicidin。符號空心柱,albicidin+AlbD;條紋柱,僅有albicidin的空白對照。使用DE52色譜進(jìn)一步純化用于本實(shí)驗(yàn)的albicidin。圖9pH對AlbD酶活性的影響,用于酶測定的條件在圖8的說明中描述,只是albicidin溶液在不同pH的磷酸緩沖液中制備。符號實(shí)心柱,ablicidin+AlbD;空心柱,僅含albicidin的空白對照。圖10(A)顯示正確取向的albD結(jié)構(gòu)基因部分在啟動子Ptac控制下的所得質(zhì)??寺TacAld的圖譜。(B)PCR擴(kuò)增的albD基因的編碼序列融合到tac啟動子上用于在大腸桿菌中表達(dá)AlbD酶。跨越起始密碼子(下面劃線)和終止區(qū)(TAG終止密碼子下游38bp)的一對PCT引物用于使用質(zhì)??寺QZE533作模板擴(kuò)增albD結(jié)構(gòu)基因部分。以BamHI和PvuII消化790bpPCR產(chǎn)物,以KlenowDNA聚合酶鈍端化,然后連接到細(xì)菌表達(dá)載體pKK223-3的SmaI位點(diǎn)。圖11(A)甘蔗表達(dá)載體pU3Z的圖譜。在材料和方法部分已描述了構(gòu)建方法。(B)從質(zhì)??寺QZE533擴(kuò)增albD的編碼序列。用BamHI和PvuII消化PCR產(chǎn)物并連接到BamHI和SmaI線型化載體pU3Z。(C)所得的構(gòu)建體pU3Zald的圖譜。圖12從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系(19個品系,每個品系重復(fù)2-10株植物)和未用albD轟擊的對照品系(9個品系,每個品系重復(fù)2-6株植物)中疾病嚴(yán)重性的頻率分布。實(shí)驗(yàn)A,用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3接種。圖13從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系(34個品系,每個品系重復(fù)2-10株植物)和未用albD轟擊的對照品系(20個品系,每個品系重復(fù)2-6株植物)中疾病嚴(yán)重性的頻率分布。實(shí)驗(yàn)B,用甘蔗白紋病黃單胞菌XA15接種。權(quán)利要求1.一種能不可逆失活albicidin的分離的albicidin解毒酶。2.如權(quán)利要求1所述的分離的albicidin解毒酶,其中所說的酶是一種水解酶。3.如權(quán)利要求1所述的分離的albicidin解毒酶,其中所說的酶由圖3A中所示的氨基酸序列編碼。4.如權(quán)利要求1所述的分離的albicidin解毒酶,其中所說的酶是一種AlbD多肽同源物。5.如權(quán)利要求4所述的分離的albicidin解毒酶,其中所說的同源物從細(xì)菌獲得。6.如權(quán)利要求5所述的分離的albicidin解毒酶,其中所說的同源物從歐文氏桿菌或Pantoea屬菌株獲得。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的albicidin解毒酶,其中所說的酶是重組酶。8.一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包含給植物或其莖施用albicidin解毒酶的步驟。9.如權(quán)利要求8所述的方法,其中albicidin解毒酶包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的酶。10.如權(quán)利要求8所述的方法,其中施用步驟的特征在于栽種前浸泡植物的莖或插枝。11.如權(quán)利要求8所述的方法,其中施用步驟的特征在于浸潤植物或其莖。12.如權(quán)利要求8所述的方法,其中所說的植物或其莖屬于甘蔗品種。13.一種編碼albicidin解毒酶的分離的核苷酸序列。14.如權(quán)利要求13所述的分離的核苷酸序列,其中所說的序列包括圖3B所示的完整核苷酸序列。15.如權(quán)利要求13所述的分離的核苷酸序列,其中所說的序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。16.如權(quán)利要求13所述的分離的核苷酸序列,其中所說的序列是albD同源物。17.如權(quán)利要求16所述的分離的核苷酸序列,其中所說的同源物可從細(xì)菌獲得。18.如權(quán)利要求17所述的分離的核苷酸序列,其中所說的細(xì)菌是歐文氏桿菌屬或Pantoea屬菌株。19.一種生產(chǎn)抗albicidin和白紋病的轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括將編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列引入植物、植物部分或植物細(xì)胞并使其表達(dá),且生長該植物、植物部分或植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。20.如權(quán)利要求19所述的方法,其中導(dǎo)入核苷酸序列的步驟經(jīng)過粒子轟擊實(shí)現(xiàn)。21.如權(quán)利要求19所述的方法,其中該核苷酸序列包含權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的核苷酸序列。22.如權(quán)利要求19所述的方法,其中該核苷酸序列包含圖3B中所示的完整核苷酸序列。23.如權(quán)利要求19所述的方法,其中該DNA序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。24.如權(quán)利要求19所述的方法,其中所說的植物、植物部分或植物細(xì)胞是從甘蔗品種獲得。25.一種轉(zhuǎn)基因植物,其具有穩(wěn)定地?fù)饺胨f的植物的細(xì)胞內(nèi)的編碼lbicidin解毒酶的DNA序列。26.如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因植物,其中所述的穩(wěn)定摻入到植物細(xì)胞中的DNA序列提供了對植物毒素albicidin和白紋病對植物的感染的至少部分抗性。27.如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因植物,其中該核苷酸序列包含權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的核苷酸序列。28.如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因植物,其中該核苷酸序列包含圖3B所示的完整核苷酸序列。29.如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因植物,其中該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。30.如權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因植物,其中所說的植物是甘蔗品種。31.一種能產(chǎn)生albicidin解毒酶、用于治療被白紋病感染的植物和/或降低植物被白紋病感染的可能性的細(xì)菌。32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌,其中所說的細(xì)菌是草生歐文氏桿菌菌株。33.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌,其中所說的細(xì)菌是如在優(yōu)選的實(shí)施方案中給出的草生歐文氏桿菌SB1403。34.一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包含給植物或其莖施用細(xì)胞外產(chǎn)生albicidin解毒酶的細(xì)菌的步驟。35.如權(quán)利要求34所述的方法,其中該細(xì)菌包含P.dispersa的一個菌株。36.如權(quán)利要求34所述的方法,其中該細(xì)菌表達(dá)編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列。37.如權(quán)利要求36所述的方法,其中該核苷酸序列包含權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的核苷酸序列。38.如權(quán)利要求36所述的方法,其中該核苷酸序列包含圖3B所示的完整核苷酸序列。39.如權(quán)利要求36所述的方法,其中該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。40.如權(quán)利要求34所述的方法,其中施用步驟由噴酒或滴加實(shí)現(xiàn)。全文摘要一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包括給植物或其莖施用albicidin解毒酶的步驟。還提供了生產(chǎn)對albicidin和白紋病具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括將編碼albicidin解毒酶的核酸序列導(dǎo)入植物、植物部分或植物細(xì)胞并表達(dá)該核酸序列,生長該植物、植物部分或植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。還進(jìn)一步提供了大幅度減少或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包括給植物或其莖施用胞外生產(chǎn)albicidin解毒酶的細(xì)菌的步驟。還進(jìn)一步提供了能不可逆滅活albicidin的分離的albicidin解毒酶及編碼albicidin解毒酶的分離的核酸序列。文檔編號C12N9/14GK1200144SQ96197666公開日1998年11月25日申請日期1996年9月6日優(yōu)先權(quán)日1995年9月7日發(fā)明者羅伯特·博奇,張煉輝申請人:昆士蘭大學(xué)
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