一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域中以尿液為樣本提取核酸的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種能快速從大容量尿液中提取核酸的專用試劑盒及提取方法，采用抽濾過柱的方式將尿液中的核酸富集到核酸吸附柱上，再經(jīng)過洗滌、洗脫等步驟，提取出尿液中含有的微量核酸。使用本發(fā)明提供的試劑盒提取得到的核酸包含了尿液中的游離核酸和尿液中脫落細(xì)胞內(nèi)的核酸，操作簡單快捷，核酸得率高、純度高，可直接用于分子生物學(xué)檢測。
【專利說明】-種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域中核酸（DNA和RNA)的提取方法，具體涉及一種從人類尿 液中提取核酸的方法及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 尿液是血液流經(jīng)腎臟后，經(jīng)腎小球濾過、腎小管重吸收與分泌作用而形成，通過 膀胱、尿道排出體外。尿液是保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的最終代謝產(chǎn)物，除了含有水、葡萄糖、 無機鹽、蛋白質(zhì)、尿素、尿酸外，還含有血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、器官脫落的表皮細(xì)胞、游離DNA及 RNA (mRNA，miRNA等）。尿液中的游離核酸包括經(jīng)腎臟過濾的來自體循環(huán)的游離核酸以及來 自尿道細(xì)胞裂解后釋放出來的核酸。尿液中蘊藏著豐富的生物學(xué)信息，并具有無創(chuàng)收集、 處理相對簡單等優(yōu)點。尿液成分及含量的改變不僅受泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的影響，而且與血 液循環(huán)、內(nèi)分泌、消化、代謝、呼吸等系統(tǒng)的生理或病理變化有關(guān)。從尿液中分離出核酸，并 對這些核酸片段進(jìn)行測試，可以幫助對癌癥、肺結(jié)核、艾滋病、瘧疾和潛在的一些其它的疾 病的早期、有效的分子檢測。
[0003] 由于尿液中的游離核酸和體細(xì)胞的含量很低，采用常規(guī)的核酸提取方法難以從尿 液細(xì)胞中獲取足量且高質(zhì)量的核酸。尿液pH值、密度、溫度等理化性質(zhì)及樣本自收集到處 理的時間間隔都可能影響尿液中細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響提取核酸時的回收率。為了從尿 液中以高回收率獲取高質(zhì)量的核酸，除了采用降低存儲溫度、縮短樣本收集及處理時間和 減少實驗對樣品的處理（離心或濃縮）等保持細(xì)胞完整性的方法外，核酸提取時采用的方 法尤為重要。
[0004] 在采用離心柱法提取核酸時，通常將樣品離心通過吸附柱，使樣品中的核酸結(jié)合 到吸附柱的硅膠膜上。然而這樣的上樣方法對于核酸含量低、樣品量較大的尿液而言，所需 上樣時間過長，不利于核酸的提取。也有方法先將尿液離心后，取沉淀細(xì)胞作為樣品，可有 效減小樣品的體積，但這類提取方法會損失尿液上清中的游離核酸，而尿液中的游離核酸 包含著很大的生物學(xué)信息。因此，針對尿液中核酸含量低、提取核酸時所需樣本量較大的實 際情況，發(fā)明一種從尿液中快速富集并提取核酸的方法，將對臨床應(yīng)用尿液進(jìn)行分子檢測 具有重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明提供了富集尿液核酸專用的抽濾裝置，可將大量尿液樣本中 的核酸快速富集至核酸吸附柱上，再經(jīng)過洗滌、洗脫步驟，提取出高質(zhì)量的核酸，可用于分 子檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服實驗室現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能快速從大容量尿液 中提取核酸的專用試劑盒及提取方法。
[0006] 本發(fā)明提供的提取尿液核酸試劑盒所含試劑及耗材裝置見表1，提取流程為：在 尿液中加入〇. 5?3倍量的裂解液ULB，37?55°C保溫10?60min后，將樣品全部通過核 酸吸附柱，樣品中的核酸將結(jié)合到吸附柱的硅膠膜上。用洗滌液UWB1和UWB2分別洗滌吸 附柱后，再用洗脫液將核酸從吸附柱上洗脫下來。
[0007] 表1 :尿液核酸快速提取試劑盒所含試劑及裝置
[0008]
【權(quán)利要求】
1. 一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，可快速從大容量尿液中提取微量核 酸，其特征在于：在尿液中加入裂解液ULB，保溫一段時間后，將樣品全部通過核酸吸附柱， 樣品中的核酸將結(jié)合到吸附柱的硅膠膜上，用洗滌液UWB1和UWB2分別洗滌吸附柱后，再用 洗脫液將核酸從吸附柱上洗脫下來。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：提 取出的核酸包含了尿液中的游離核酸和尿液中脫落細(xì)胞內(nèi)的核酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：裂 解液ULB的用量為尿液樣本的0. 5?3倍量。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：在 裂解液ULB中，SDS的濃度為0. lg/uL?lg/uL，最適濃度為0. 2ng/uL?0. 6ng/uL ;EDTA的 濃度為〇. 5mmol/L?2mmol/L，最適濃度為lmmol/L?1. 5mmol/L ;曲拉通X-100的濃度為 0. 5(%?6(%，最適濃度為2(%?3(% ;鹽酸胍的濃度為21]1〇1凡?81]1〇1/]^，最適濃度為51]1〇1/ L ?8mol/L〇
5. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：在 尿液樣本中加入裂解液ULB后，于37?55°C保溫10?60min。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：采 用抽濾的方法將尿液樣本全部通過吸附柱，通過抽氣泵將廢液收集瓶中空氣抽凈，使外界 大氣壓大于廢液收集瓶中的氣壓，利用氣壓差，加快盛樣管中的尿液通過吸附柱，達(dá)到快速 將核酸富集到吸附柱上的目的。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：鹽 酸胍的濃度為2mol/L?8mol/L，最適濃度為3mol/L?6mol/L ;氯化鈉濃度為75mmol/L? 1. 5mol/L，最適濃度為 1 20mmo1 /T,?200mmol/L ;EDTA 的濃度為 0· 5mmol/L ?2mmol/L，最 適濃度為lmm〇l/L?1. 5mmol/L ;乙醇濃度為40 %?80%，最適濃度為55 %?75%。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種從尿液中提取核酸的試劑盒及提取方法，其特征在于：洗 脫液UWB2可以為純水或pH值大于7. 0的低鹽溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK104195134SQ201410479242
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】唐濤, 周細(xì)武, 邱英華 申請人:寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司