專利名稱：氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶核酸和多肽和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸和多肽，更具體地涉及編碼氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶的核酸和多 肽，以及使用這些氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶的方法。背景氨基轉(zhuǎn)移酶催化氨基酸和α-酮酸之間的反應(yīng)。α-氨基轉(zhuǎn)移酶催化從氨基酸上 除去氨基基團(tuán)的反應(yīng)，形成α-酮酸，將所述氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)物α-酮酸，將所述酮酸 轉(zhuǎn)化成氨基酸。因而，氨基轉(zhuǎn)移酶在氨基酸的生產(chǎn)中是有用的。氧化還原酶例如脫氫酶催化通過轉(zhuǎn)移一個(gè)或多個(gè)質(zhì)子和一對(duì)電子到接受體來氧 化底物(例如從還原劑轉(zhuǎn)移電子到氧化劑)的反應(yīng)。因此，氧化還原酶在催化氨基酸到酮 酸的氧化脫氨基或酮酸到氨基酸的還原性氨基化是有用的。本公開提供了許多不同的氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶多肽，以及編碼這些氨基轉(zhuǎn)移 酶和氧化還原酶多肽的核酸。本公開還提供了使用這些氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶核酸和多 肽的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸(或，作為選擇，吲 哚-3-丙酮酸到色氨酸)的方法。這種方法包括組合色氨酸(或吲哚-3-丙酮酸)和a) 選自由 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、 45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、 95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、 135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、 173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、 211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、 249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、 287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、 325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、 363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、 401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、 439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、
10477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、 515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、 553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587589、 591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、 629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、 667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、 705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、 743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、 781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、 819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、 857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、 895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、 933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、 971,973和975組成的組中的一種或多種核酸分子，其中所述一種或多種核酸分子編碼具 有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)或氧化還原酶活性的多肽；b) a)的變體，其中所述變體編碼具有AT或 氧化還原酶活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有AT或氧化還原酶活 性的多肽；d)選自由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、 36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、 128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、 166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示 的一個(gè)或多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、 244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、 282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、 320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、 358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、 396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、 434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、 472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、 510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、 548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、 586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、 624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、 662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、 700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、 738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、 776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、 814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、870 T242N、872、874、876、878、880、882、 884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、 922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、 960、962、964、966、968、970、972、974、976、1069、1070、1071、1072 和 1073 組成的組中的一
種或多種多肽，其中所述一種或多種多肽具有AT或氧化還原酶活性；e)d)的變體，其中所 述變體具有AT或氧化還原酶活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有AT或氧化還原 酶活性。 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將MP轉(zhuǎn)化為monatin (或，做為選擇，轉(zhuǎn)化monatin 為MP)的方法。這種方法一般包括組合MP(或monatin)和a)選自由SEQ ID NO :1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、 59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、 107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、 145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、 183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、 221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、 259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、 297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、 335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、 373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、 411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、 449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、 487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、 525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、 563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587 589、591、593、595、597、599、 601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、 639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、 677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、 715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、 753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、 791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、 829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、 867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、 905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、 943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973 和 975 組成的組 中的一種或多種核酸分子，其中所述一種或多種核酸分子編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)或氧 化還原酶活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽； c) a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、 54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、
142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、
180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、
218,220,220 G240N、220T241N、具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO:
220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、
258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、
296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、
334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、
372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、
410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、
448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、
486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、
524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、
562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、
600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、
638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、
676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、
714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、
752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、
790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、
828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、
866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、
900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、
938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、
976、1069、1070、1071、1072和1073組成的組中的一種或多種多肽，其中所述一種或多種多
肽具有AT或氧化還原酶活性；e)d)的變體，其中所述變體具有AT或氧化還原酶活性；或f)
d)或e)的片段，其中所述片段具有AT或氧化還原酶活性。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種核酸分子選自由SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、 63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、 111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、 149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、 225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、865、867、869、871、873、875、 877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、 915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、 953、955、957、959、969、971、973和975組成的組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種 多肽選自由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、
1392、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、 132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、 170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、 208、210、212、214、216、218、220、220G240N、220T241N、具有表 43 或表 52 中所示的一個(gè)或 多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、 896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、 934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974 和 976 組成 的組中。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子具有選自由SEQ ID NO :945、891、893、219、175、 1063、1065和1067組成的組中的序列。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有選自由SEQ ID NO :946、892、894、220、176、1064、1066和1068組成的組中的序列。在某些實(shí)施方案中，所述 多肽具有相應(yīng)于SEQ ID NO :1069或1070中所示的共有序列的序列。在某些實(shí)施方案中， 所述多肽具有相應(yīng)于在SEQ ID NO 1071、1072和1073中所示的共有序列的序列。在某些實(shí)施方案中，所述變體是與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、
23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、
73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、
117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、
155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、
193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、 231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、865、867、869、871、873、875、877、879、881、 883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、 921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、 959、969、971、973和975具有至少80% (例如，至少85%、至少90%、至少95%或至少 99% )序列相同性的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，所述變體是與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、
24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、
74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、
118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、
156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、
194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、220G240N、220 T241N、 具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、 234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、870、870 T242N、872、874、876、878、 880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、 918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、 956、958、960、970、972、974和976具有至少80% (例如，至少85%、至少90%、至少95%或 至少99%)序列相同性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體是與SEQ ID NO :220具有至少65% (例如，至少 70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 % )序列相同性的多
14肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體是與SEQ ID N0:870具有至少80% (例如，至少85%、 至少90%、至少95%或至少99% )序列相同性的多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體是 與SEQ ID N0:894具有至少65% (例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99% )序列相同性的多肽。在某些實(shí)施方案中，所述變體是突變體。代表性的突變體包括但不限于在與DAT 4978的殘基243對(duì)準(zhǔn)的殘基處具有突變的突變體(例如，SEQ ID NO 870 T242N、SEQ ID NO 220 G240N或SEQ ID NO 220 T241N)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體是密碼子優(yōu)化了的 核酸分子。在某些實(shí)施方案中，所述變體多肽是嵌合多肽。在某些實(shí)施方案中，核酸分子包含在表達(dá)載體內(nèi)，可以被例如過表達(dá)。在某些實(shí)施 方案中，所述氨基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶多肽被固定在固相支持物上。在某些實(shí)施方案中，所 述色氨酸或MP是取代的色氨酸或取代的MP。代表性的色氨酸是6-氯-D-色氨酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將色氨酸轉(zhuǎn)化到吲哚-3-丙酮酸(或，做為選擇，將 吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化為色氨酸)的方法。這種方法典型包括組合色氨酸(或吲哚-3-丙 酮酸)和 a)選自由 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、 129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、 167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、 205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、 243、245、247、249、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、 895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、 933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、969、971、973、和 975 組 成的組中的一種或多種核酸分子，其中所述一種或多種核酸分子編碼具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶 (DAT)活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有DAT活性的多肽；c)a)或b)的片 段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽；d)選自由SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、 68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、 114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、 190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO :220、222、224、226、228、 230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、 878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、 916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、 954、956、958、960、970、972、974、976、1069、1070、1071、1072 和 1073 組成的組中的一種或 多種多肽，其中所述一種或多種多肽具有DAT活性；e)d)的變體，其中所述變體具有DAT活 性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有DAT活性。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將MP轉(zhuǎn)化到monatin (或，做為選擇，將monatin 轉(zhuǎn)化為MP)的方法。這種方法典型包括組合MP(或monatin)和a)選自由SEQ ID N0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、 59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、 107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、 145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、 183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、 221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、865、867、869、871、 873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、 911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、 949、951、953、955、957、959、969、971、973和975組成的組中的一種或多種核酸分子，其中 所述一種或多種核酸分子編碼具有DAT活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有 DAT活性的多肽；c) a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、 52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、 102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、 140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、 178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、 216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、 870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、 904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、 942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974、976、1069、1070、1071、1072 和 1073組成的組中的一種或多種多肽，其中所述一種或多種多肽具有DAT活性；e)d)的變體， 其中所述變體具有DAT活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有DAT活性。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子或多肽具有選自由SEQ ID NO :945、891、893、 219、175、1063、1065和1067組成的組中的序列。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有相應(yīng)于 在SEQ ID NO :1069、1070、1071、1072或1073中所示的共有序列的序列。在某些實(shí)施方案 中，所述色氨酸或MP是取代的色氨酸或取代的MP。代表性的取代的色氨酸是6-氯-D-色 氨酸。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備monatin的方法。一般地，這種方法包括在 產(chǎn)生monatin的條件下使色氨酸與C3碳源和以下接觸a)選自由SEQ ID NO :1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、 61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、 109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、 147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、 223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、865、867、869、871、873、 875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、 913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、 951、953、955、957、959、969、971、973和975組成的組中的一種或多種核酸分子，其中所述一種或多種核酸分子編碼具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變 體編碼具有DAT活性的多肽；c) a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽； d)選自由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、 44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、 94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、 134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、 172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、 210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示的一個(gè)或多個(gè) 突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、 250、866、868、870、870 T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、 896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、 934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974、976、1069、 1070、1071、1072和1073組成的組中的一種或多種多肽，其中所述一種或多種多肽具有DAT 活性；e)d)的變體，其中所述變體具有DAT活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有 DAT活性。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子選自由SEQ ID NO :945、891、893、219、175、 1063、1065和1067組成的組中。在某些實(shí)施方案中，所述C3碳源選自由丙酮酸、草酰乙酸 和絲氨酸組成的組中。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括添加或包括合酶/裂合酶 (EC 4. 1. 2.-或4. 1. 3.-)多肽。代表性的合酶/裂合酶(EC 4. 1. 2.-或4. 1. 3.-)多肽包 括醛縮酶，例如KHG醛縮酶(EC 4. 1. 3. 16)或HMG醛縮酶(EC 4. 1. 3. 16)。上文表明的方法的某些實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)的monatin是R，R monatin.在某 些實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)的monatin是S，R monatin.在某些實(shí)施方案中，所述色氨酸是取 代的色氨酸，例如6-氯-D-色氨酸。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可以 被用于本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試，以下描述了適合的方法和材料。此外，所述材料、方法和實(shí)施 例僅是說明性的，而不意圖是限制性的。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參 考文獻(xiàn)以其全文援引加入本文。在沖突的情況下，當(dāng)前的說明書，包括定義，是支配性的。在以下附隨的附圖
和說明中將闡述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。根據(jù)附 圖和詳細(xì)說明，以及根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征、目的和益處將是明顯的。附圖簡(jiǎn)述圖 1 是 SEQ ID NO :894、1066、1064 和 1068 的比對(duì)。圖2是SEQ ID NO :870、910和幾個(gè)芽孢桿菌(Bacillus)序列的比對(duì)。從這種比 對(duì)中發(fā)展了針對(duì)SEQ ID NO :870的新部分的共有序列A和B (分別是SEQ ID N0:1069和 1070)。圖 3 是 SEQ ID NO :946、894、892、220、176、1064、1066 和 1068 的比對(duì)。從這種比 對(duì)發(fā)展了共有序列C、D和E(分別是SEQ ID NO 1071、1072禾口 1073)。圖4是3DAA-D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的模型，編號(hào)的殘基表明被選擇用于TMCAsm進(jìn) 化的那些位點(diǎn)，如下文詳細(xì)描述的。
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同樣的參考符號(hào)在各個(gè)附圖中表示同樣的元素。詳細(xì)說明在此公開的是編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)活性(例如轉(zhuǎn)氨酶活性)的多肽的許多 不同的核酸分子。特別地公開的是許多D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)。DAT催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)(例如 D-丙氨酸+2-酮戊二酸 < = > 丙酮酸+D-谷氨酸)。還提供的是編碼具有氧化還原酶活性 (例如脫氫酶活性)的多肽的許多不同的核酸分子。氧化還原酶如脫氫酶催化氧化還原反 應(yīng)(例如D-氨基酸+H2O+接受體< =>2-含氧酸(2-0X0 acid) +NH3+還原的接受體)。在 此公開的核酸或多肽可以用于轉(zhuǎn)化色氨酸為吲哚-3-丙酮酸和/或?qū)?-羥基2-(吲哚-3 基甲基)-4-酮戊二酸(“monatin前體”或“MP”)轉(zhuǎn)化為monatin。分離的核酸分子和純化的多肽本發(fā)明部分地基于編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)活性的多肽的核酸分子的鑒定，在 此在合適的時(shí)候稱為“AT”核酸分子或多肽。本發(fā)明還部分地基于編碼具有氧化還原酶活 性的多肽的核酸分子的鑒定，在此在合適的時(shí)候稱為“氧化還原酶”核酸分子或多肽。此處描述的具體的核酸分子包括在SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、 73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、 117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、 155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、 193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、 231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、 269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、 307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、 345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、 383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、 421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、 459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、 497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、 535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、 573、575、577、579、581、583、585、587 589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、 611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、 649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、 687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、 725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、 763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、 801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、 839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、 877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、 915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、 953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973 和 975 中顯示的序列。如在此使用的，術(shù)
18語“核酸分子”可以包括DNA分子和RNA分子，利用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似 物。本發(fā)明的核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，取決于它預(yù)期的用途。本發(fā)明的核酸分子 包括與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、 45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、 95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、 135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、 173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、 211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、 249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、 287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、 325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、 363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、 401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、 439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、 477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、 515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、 553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587589、 591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、 629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、 667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、 705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、 743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、 781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、 819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、 857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、 895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、 933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、 971、973和975的任一個(gè)具有至少75%序列相同性(例如至少80 %、85 %、90 %、95 %或 99%序列相同性)并且具有功能性AT或氧化還原酶活性的分子。在計(jì)算序列相同性百分比時(shí)，兩個(gè)序列被比對(duì)，確定兩個(gè)序列之間核苷酸或氨基 酸殘基的相同的匹配的數(shù)目。相同的匹配的數(shù)目除以比對(duì)的區(qū)域的長(zhǎng)度(即比對(duì)的核苷酸 或氨基酸殘基的數(shù)目)，乘以100，得到序列相同性百分比值。要理解的是，比對(duì)的區(qū)域的長(zhǎng) 度可以是一個(gè)或兩個(gè)序列的一部分，直到最短的序列的全長(zhǎng)大小。要理解的是，單個(gè)序列 可以與其他序列不同地比對(duì)，由此可以在每個(gè)比對(duì)的區(qū)域上具有不同的序列相同性百分比 值。注意的是，相同性百分比值通常舍入到最接近的整數(shù)。例如，78.1%、78.2%、78.3%和 78. 4% 向下舍入 78%，而 78. 5%,78. 6%,78. 7%,78. 8%禾口 78. 9% 向上舍入至Ij 79%。還注 意的是，比對(duì)的區(qū)域的長(zhǎng)度總是整數(shù)。使用Altschul 等(1997，Nucleic Acids Res. ,25 3389-3402)描述的、在互聯(lián)網(wǎng) http://ncbi. nlm. nih. gov可獲得的整合到BLAST (基礎(chǔ)局部比對(duì)檢索工具)程序中的算法進(jìn)行兩種或更多種序列的比對(duì)來確定序列相同性百分比?？梢赃M(jìn)行BLAST檢索來確定此處 描述的AT核酸分子和利用Altschul et al算法比對(duì)的任何其他序列或其部分之間的序列 相同性百分比。BLASTN是用于比對(duì)和比較核酸序列之間相同性的程序，而BLASTP是用于比 對(duì)和比較氨基酸序列之間相同性的程序。當(dāng)利用BLAST程序來計(jì)算本發(fā)明的序列與另一個(gè) 序列之間的相同性百分比時(shí)，使用相應(yīng)的程序的默認(rèn)參數(shù)。本發(fā)明的核酸分子例如長(zhǎng)度在約10和約50個(gè)核苷酸之間的那些可以在標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增 條件下使用來擴(kuò)增AT或氧化還原酶核酸分子。AT或氧化還原酶核酸的擴(kuò)增可以用于檢測(cè) AT或氧化還原酶核酸分子的存在與否的目的或用于獲得(例如克隆)AT或氧化還原酶核 酸分子的目的。如在此使用的，標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件是指擴(kuò)增反應(yīng)混合物的基本成分和循環(huán)條件， 所述循環(huán)條件包括多個(gè)循環(huán)的變性模板核酸、將寡核苷酸引物與模板核酸退火以及通過聚 合酶延伸引物來產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物(參見例如美國(guó)專利NO. 4，683，195 ；4, 683，202 ；4, 800，159 ； 和4，965，188)。擴(kuò)增反應(yīng)混合物的基本成分一般包括例如四種脫氧核苷三磷酸鹽(例如 dATP、dCTP、dTTP和dGTP或其類似物)的每一種、寡核苷酸引物、模板核酸和聚合酶。模板 核酸典型在至少約90°C的溫度下變性，來自引物的延伸典型在至少約72°C的溫度下進(jìn)行。 此外，對(duì)原始PCR方法的改變(例如錨式PCR、RACE PCR或連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR))已經(jīng)被開 發(fā)，并且是本領(lǐng)域已知的。參見例如Landegran et al.，1988，Science, 241 1077-1080 ；禾口 Nakazawa et al,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91 360-364) 退火溫度可以用于控制擴(kuò)增的特異性。引物與目標(biāo)模板核酸退火的溫度必須 低于每種引物的Tm，但是足夠高以避免引物與模板核酸的非特異性退火。Tm是一半的 DNA雙鏈體分離成單鏈的溫度，可以利用Sambrook et al. (1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)的11. 46節(jié)中提供的公式從寡核苷酸引物預(yù)測(cè)。非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在 凝膠上被檢測(cè)為不是正確擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小的條帶。本發(fā)明的核酸分子例如長(zhǎng)度在約10到幾百核苷酸(長(zhǎng)度多達(dá)數(shù)千核苷酸)之 間的那些可以在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下使用來與AT或氧化還原酶核酸分子雜交。與AT或氧化 還原酶核酸分子的雜交可以用于檢測(cè)或獲得AT或氧化還原酶核酸分子的目的。如在此 使用的，核酸分子之間的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件在Sambrook et al. (1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual,2" Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；小節(jié) 7. 37-7. 57，9. 47-9. 57，11. 7-11. 8 和 11. 45-11. 57)中詳細(xì)討論。對(duì)于小 于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針，Sambrook et al在小節(jié)11. 45-11. 46中公開了適合 的Southern印跡條件。長(zhǎng)度低于100核苷酸的序列和第二序列之間的Tm可以利用小節(jié) 11.46中提供的化學(xué)式來計(jì)算。Sambrook et al.另外公開了用于Southern印跡的預(yù)雜交 和雜交條件，其利用大于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針(參見小節(jié)9. 47-9. 52)。與大于 100個(gè)核苷酸的寡核苷酸的雜交一般在低于Tm 15-25°C下進(jìn)行。長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的 序列與第二序列之間的Tm可以利用Sambrook et al的小節(jié)9. 50-9. 51中提供的公式來計(jì) 算。另外，Sambrook et al.建議在小節(jié)9. 54中表明的條件用于洗滌Southern印跡，所述 Southern印跡已用大于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探測(cè)。含有核酸的膜預(yù)雜交和雜交的條件以及洗滌含有核酸的膜來除去過量和非特異 性結(jié)合的探針的條件可能在雜交的嚴(yán)格性方面起重要作用。例如，雜交和洗滌可以在低嚴(yán)
20格、中嚴(yán)格或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行。例如在Sambrook et al.小節(jié)11. 45-11. 46中描述了這 樣的條件。用于實(shí)現(xiàn)特定水平的嚴(yán)格性的條件將根據(jù)要雜交的核酸的性質(zhì)而變化。例如， 核酸的雜交區(qū)域的長(zhǎng)度、互補(bǔ)性程度、核苷酸序列組成(例如G/C對(duì)比A/T核苷酸含量)和 核酸類型(例如RNA、DNA)可以在選擇雜交條件時(shí)考慮。例如，洗滌條件可以通過降低洗滌 溶液中的鹽濃度和/或通過提高進(jìn)行洗滌的溫度來變得更為嚴(yán)格。雜交的量可以在膜上直接或根據(jù)利用例如感光成像儀或光密度計(jì)(Molecular Dynamics, Sunnyvale，CA)的放射自顯影來量化。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，雜交的量的解 釋可以通過例如標(biāo)記的寡核苷酸探針的比活性、靶核酸上探針結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量以及放射自 顯影或其他檢測(cè)介質(zhì)的暴光量來進(jìn)行。容易理解的是，雖然任意雜交、洗滌和檢測(cè)條件可以 用于檢查探針核酸分子與固定的靶核酸的雜交，更重要的是在相同的雜交、洗滌和檢測(cè)條 件下檢查探針與靶核酸的雜交。優(yōu)選靶核酸處在相同的膜上。技術(shù)人員可以理解的是，合 適的陽性和陰性對(duì)照應(yīng)與每組擴(kuò)增或雜交反應(yīng)一起進(jìn)行以避免與污染和/或寡核苷酸引 物或探針的非特異性退火相關(guān)的不確定性。寡核苷酸引物或探針特異性與一或多種AT或氧化還原酶核酸退火或雜交。對(duì)于 擴(kuò)增，一對(duì)寡核苷酸引物一般與模板核酸的相反鏈退火，并且應(yīng)當(dāng)相互間隔合適的距離，從 而聚合酶可以有效地跨區(qū)域聚合，這樣擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用例如電泳容易地檢測(cè)。寡核苷 酸引物或探針可以利用例如幫助設(shè)計(jì)寡核苷酸的如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade, CO)的計(jì)算機(jī)程序來設(shè)計(jì)。典型地，寡核苷酸引物長(zhǎng)度是10到30或40到 50 個(gè)核苷酸(例如長(zhǎng)度 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)核苷酸)， 但是如果使用合適的擴(kuò)增條件可以更長(zhǎng)或更短。用于擴(kuò)增D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)核酸分子的非限制性代表性的寡核苷酸引物對(duì)在 表 2-8 (SEQ ID N0:978-1062和 1074-1083)、表46(SEQ ID NO 1084-1103)和表 54 (SEQ ID NO 1104-1125)中示出。SEQ ID NO :978_1062和1074-1083中顯示的序列是可以用于擴(kuò)增 AT核酸分子的寡核苷酸引物的非限制性實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以通過AT或氧化 還原酶核酸分子的限制性酶消化獲得或可以通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成和其他已知技術(shù)來制備。如在此使用的，“分離的”核酸分子是與通常與所述分離的核酸分子相關(guān)的其他核 酸分子分開的核酸分子。因而，“分離的”核酸分子包括但不限于不含有在衍生所述分離 的核酸的生物體的基因組中天然地位于所述核酸的一或兩個(gè)末端側(cè)翼的序列的核酸分子 (例如通過PCR或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。這樣的分離的核酸 分子通常被導(dǎo)入載體(例如克隆載體或表達(dá)載體)以方便操作或產(chǎn)生融合核酸分子。此外， 分離的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重組或合成的核酸分子。在例如含有限 制性消化的基因組DNA的核酸文庫(例如cDNA或基因組文庫)或一部分凝膠(例如瓊脂 糖或聚丙烯酰胺)之內(nèi)數(shù)百到數(shù)百萬其他核酸分子之中存在的核酸分子不被認(rèn)為是分離 的核酸。此處描述的具有AT或氧化還原酶活性的分離的核酸分子可以利用本領(lǐng)域常規(guī)技 術(shù)獲得，所述技術(shù)的許多在本文實(shí)施例中描述。例如，本發(fā)明范圍內(nèi)的分離的核酸可以利用 任何方法獲得，包括但不限于重組核酸技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(例如PCR，例如直接擴(kuò)增或定 點(diǎn)誘變)和/或核酸雜交技術(shù)(例如Southern印跡)。例如，在PCR Primer =A LaboratoryManual,Dieffenbach & Dveksler,Eds. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995 中 描述了一般PCR技術(shù)。重組核酸技術(shù)包括例如限制性酶消化和連接，其可以用于分離此處 描述的AT或氧化還原酶核酸分子。本發(fā)明的分離的核酸還可以作為單個(gè)核酸分子或作為 一系列寡核苷酸來化學(xué)合成。用于操縱核酸的技術(shù)例如亞克隆、標(biāo)記探針(例如利用Klenow聚合酶的隨機(jī)-引 物標(biāo)記、切口平移、擴(kuò)增)、測(cè)序、雜交、擴(kuò)增等在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中充分描述，參見例如 Sambrook et al.，Eds.，1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2nd Ed.)， Vols 1—3，Cold Spring Harbor Laboratory ；Current Protocols in Molecular Biology, 1997，Ausubel, Ed. John Wiley & Sons，Inc.，New York ；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology :Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, Ed. Elsevier, N. Y. (1993)。純化的AT或氧化還原酶多肽以及具有AT或氧化還原酶活性的多肽片段均在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。AT多肽是指催化氨基基團(tuán)和酮酸之間反應(yīng)的多肽。具體地，DAT的轉(zhuǎn)氨基 反應(yīng)涉及從氨基酸上除去氨基基團(tuán)留下α-酮酸，將所述氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)物α-酮酸 上，從而將所述α-酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸。AT多肽的預(yù)測(cè)的氨基酸序列在SEQ ID NO :2、4、6、 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、 234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、 886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、 924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、 970、972、974和976中示出。氧化還原酶多肽是指催化氧化還原反應(yīng)的多肽，氧化還原酶多 肽的預(yù)測(cè)的氨基酸序列在 SEQ ID NO :252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、 274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、 312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、 350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、 388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、 426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、 464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、 502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、 540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、 578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、 616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、 654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、 692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、 730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、
22768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、 806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、 844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、962、964、966 和 968 中示出。在此使用的術(shù)語“純化的”多肽是指已經(jīng)與其天然相伴的細(xì)胞成分分開的多肽。典 型地，當(dāng)多肽至少部分地沒有與之天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然發(fā)生的分子時(shí)就被認(rèn)為所述多 肽是“純化的”。AT或氧化還原酶多肽的富集程度或純度可以利用任何合適的方法例如柱 層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析來測(cè)量。本發(fā)明還提供了 AT和氧化還原酶多肽，其在序列上不同于SEQ ID NO :2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 具有表43或表52中所示的一個(gè)或多個(gè)突變的SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、 232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、 270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、 308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、 346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、 384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、 422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、 460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、 498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、 536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、 574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、 612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、 650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、 688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、 726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、 764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、 802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、 840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、 878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、 916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、 954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974 和 976。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解變 化可以被導(dǎo)入AT或氧化還原酶多肽(例如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66 :68、70、72、 74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、 118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、 156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、
23194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、具有表 43 或表 52 中所示 的一個(gè)或多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、 244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、 282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、 320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、 358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、 396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、 434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、 472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、 510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、 548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、 586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、 624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、 662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、 700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、 738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、 776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、 814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、 852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、 890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、 928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、 966、968、970、972、974和976)或AT或氧化還原酶核酸分子(例如SEQ ID NO :1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、 61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、 109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、 147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、 223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、 261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、 299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、 337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、 375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、 413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、 451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、 489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、 527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、 565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587589、591、593、595、597、599、601、 603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、 641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、
716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、
755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、
793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、
831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、
869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、
907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、
945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973 和 975)，從而在編碼
的多肽中產(chǎn)生氨基酸序列的改變。在序列上不同于SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、
70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、
116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、
154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、
192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、具有表 43 或表 52 中
所示的一個(gè)或多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、
242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、
280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、
318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、
356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、
394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、
432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、
470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、
508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、
546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、
584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、
622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、
660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、
698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、
736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、
774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、
812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、
850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、
888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、
926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、
964、966、968、970、972、974和976并分別保持了氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶活性的AT和氧化
還原酶多肽可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)地使用的篩選方法容易地鑒定。 例如，改變可以導(dǎo)入AT或氧化還原酶核酸編碼序列，弓I起在所述編碼的AT或氧化
還原酶多肽中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的保守性和/或非保守性氨基酸取代。核酸序列中
的改變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生，例如編碼這種多肽的核酸的定點(diǎn)誘變、PCR介導(dǎo)的誘變，或
25定向進(jìn)化。此外，多肽序列中的變化可以通過沿著AT或氧化還原酶多肽的全部或部分隨機(jī) 導(dǎo)入，例如通過相應(yīng)核酸的飽和誘變。或者，變化可以通過化學(xué)合成具有這種變化的核酸分 子或多肽來導(dǎo)入核酸或多肽序列?！氨Ｊ匦园被崛〈笔窃谄渲幸粋€(gè)氨基酸殘基被置換為具有相似側(cè)鏈的不同 氨基酸殘基的一種取代。本領(lǐng)域評(píng)估了氨基酸殘基之間的相似性。例如，Dayhoff et al. (1978, in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 (Suppl. 3) :345_352)提供了 氨基酸取代頻率表，可以用作氨基酸相似性的度量。保守性取代的實(shí)例包括例如脂肪族氨 基酸用另一個(gè)脂肪族氨基酸的置換；絲氨酸用蘇氨酸的置換，反之亦然；酸性殘基用另一 個(gè)酸性殘基的置換；帶有酰胺基團(tuán)的殘基用另一個(gè)帶有酰胺基團(tuán)的殘基的置換；堿性殘基 與另一個(gè)堿性殘基的交換；或芳香族殘基用另一個(gè)芳香族殘基的置換。非保守性取代是其 中氨基酸殘基被置換為不具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的一種取代。核酸中的改變可以利用一或多種誘變劑引入。誘變劑包括但不限于紫外光、Y輻 射或化學(xué)誘變劑(例如絲裂霉素、亞硝酸、光活化補(bǔ)骨脂素、亞硫酸氫鈉、亞硝酸、羥胺、胼 或甲酸)。其他誘變劑是核苷酸前體的類似物，例如亞硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或 吖啶。也可以使用嵌入劑例如原黃素、吖啶黃素、奎納克林等等。還可以通過方法例如易錯(cuò)PCR、改組、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、組裝PCR、有性PCR誘 變、體內(nèi)誘變、盒誘變、循環(huán)全體誘變(recursive ensemble mutagenesis)、指數(shù)全體誘變、 基因再裝配(例如GeneReassembly，參見例如美國(guó)專利No. 6，537，776)、基因位點(diǎn)飽和誘變 (GSSM)、合成連接重裝配(SLR)或其組合將改變導(dǎo)入AT或氧化還原酶核酸和/或多肽中。 還可以通過方法例如重組、循環(huán)序列重組、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、含有尿嘧啶的模板 誘變、有缺口的雙鏈體誘變、點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)誘變、修復(fù)缺陷的宿主菌株誘變、化學(xué)誘變、產(chǎn)放射 性誘變、缺失誘變、限制選擇誘變、限制純化誘變、人工基因合成、全體誘變、嵌合核酸多聚 體創(chuàng)造或任何其組合來將變化導(dǎo)入多肽中。如果希望，AT或氧化還原酶核酸可以是密碼子優(yōu)化的。例如，可以鑒定非優(yōu)選的 或較低優(yōu)選的密碼子，并與編碼相同氨基酸、作為置換密碼子的優(yōu)選的或中性使用的密碼 子置換。優(yōu)選的密碼子是在宿主細(xì)胞基因的編碼序列中過量呈現(xiàn)的密碼子，非優(yōu)選的或較 低優(yōu)選的密碼子是在宿主細(xì)胞基因的編碼序列中不足呈現(xiàn)的密碼子，從而修飾所述核酸來 提高它在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。AT或氧化還原酶核酸可以根據(jù)任何宿主細(xì)胞的特定密碼子利 用率來優(yōu)化(例如，在此描述的任何宿主細(xì)胞)。關(guān)于密碼子優(yōu)化的代表性的描述參見例如 美國(guó)專利No. 5，795，737。除了密碼子優(yōu)化之外，核酸可以經(jīng)歷定向進(jìn)化。參見例如美國(guó)專 利 No. 6，361，974。其他改變也在本公開的范圍之內(nèi)。例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)氨基酸可 以從氨基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶多肽的羧基和/或氨基末端除去而不顯著改變生物學(xué)活性。 此外，可以改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸來提高或降低多肽的Pi。在某些實(shí)施方案中，殘基可以改 變?yōu)槔绻劝彼?。還提供了嵌合氨基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶多肽。例如，嵌合AT或氧化還原 酶多肽可以包括不同的結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域的部分。重新組合來自不同多肽的不同結(jié)構(gòu)域和 篩選產(chǎn)生的嵌合體來找到對(duì)于特定應(yīng)用或底物的最佳組合的方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。在此例示的序列中的一個(gè)特定改變涉及相應(yīng)于來自ATCC登記號(hào)No. 4978 (DAT 4978)的DAT中殘基243的殘基。在一種情況下，SEQ ID NO 870 DAT的多肽序列與DAT4978比對(duì)，鑒定與DAT 4978中位置243對(duì)準(zhǔn)的SEQ ID NO 870中的殘基(殘基242)，并從 Thr改變?yōu)锳sn(SEQ ID NO 870 T242N)。在另一種情況中，SEQ ID NO 220 DAT的多肽序列 與DAT4978比對(duì)，鑒定與DAT 4978中位置243對(duì)準(zhǔn)的SEQ ID NO 220中的殘基(殘基240 或 241)分別從 Gly 改變?yōu)?Asn 或從 Thr 改變?yōu)?Asn (SEQ ID NO 220 G240N 和 SEQ ID NO: 220 T241N)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定在此處公開的任何DAT中相應(yīng)于DAT 4978 的殘基243的殘基，并向多肽序列中在該特定殘基處引入改變。構(gòu)建了許多其他的DAT突 變體，在表43和52中列出。注意的是，SEQ ID NO 894是新的DAT，在公眾數(shù)據(jù)庫中它的最接近序列展現(xiàn)了與 SEQ ID NO :894多肽僅60%的序列相同性。因而，本發(fā)明的多肽包括與SEQ ID NO 894具 有至少例如65%序列相同性(例如至少70%,75%,80%,85%,90%,95%^； 99%序列相 同性)并且具有功能性DAT活性的序列。此外，SEQ ID NO :870也是新的DAT，與芽孢桿菌 DAT多肽具有76%的序列相同性，與球形芽孢桿菌(B. sphaericus)DAT多肽具有69%的序 列相同性。因而，本發(fā)明的多肽包括與SEQ ID NO :870具有至少80%序列相同性(例如至 少85%、90%、95%或99%序列相同性)并具有DAT活性的序列。而且，SEQ ID NO 220是 新的DAT，其與來自拜氏梭狀芽孢桿菌(C.beijerinckii)的DAT多肽具有62%的序列相同 性。因而，本發(fā)明的多肽包括與SEQ ID NO :220具有至少65%序列相同性(例如至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%或99%序列相同性)的序列。在一種情況下，SEQ ID NO 870和910與公開的DAT比對(duì)，確定共有序列。使得多 肽與芽孢桿菌樣DAT多肽的組的其余部分與眾不同的、SEQID NO :870樣DAT多肽的共有序 列示于SEQ ID NO: 1069中(共有序列A)。在另一種情況下，SEQ ID NO 176、220、892、894 和946被比對(duì)，確定了共有序列。這組DAT的共有序列在SEQ ID NO :1071中示出(共有序 列C)。SEQ ID NO 1070 (共有序列B)代表了相對(duì)于SEQ ID NO 1069 (共有序列A)稍微更 保守的共有序列，而SEQ ID NO 1072 (共有序列D)和SEQ ID NO 1073 (共有序列E)相應(yīng) 于相對(duì)SEQ ID NO :1071(共有序列C)稍微更保守的共有序列。預(yù)期具有相應(yīng)于在此公開 的共有序列A、B、C、D或E的共有序列的多肽將展現(xiàn)DAT活性。氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶核酸或多肽的片段是指全長(zhǎng)氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶 核酸或多肽的一部分。如在此使用的，“功能性片段”是保持了相應(yīng)酶活性的、氨基轉(zhuǎn)移酶或 氧化還原酶多肽的那些片段。“功能性片段”還指編碼保持了相應(yīng)酶活性的多肽的、氨基轉(zhuǎn) 移酶或氧化還原酶核酸的片段。例如，功能性片段可以用于體外或體內(nèi)反應(yīng)來分別催化轉(zhuǎn) 氨酶或氧化還原反應(yīng)。AT或氧化還原酶多肽可以通過已知方法例如DEAE離子交換、凝膠過濾和羥磷灰 石層析獲得(例如純化的)自天然來源(例如生物學(xué)樣品)。天然來源包括但不限于微生 物例如細(xì)菌和酵母。純化的AT或氧化還原酶多肽還可以通過例如克隆和表達(dá)AT或氧化 還原酶核酸(例如 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、 129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、 167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、 205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、
27243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、
281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、
319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、
357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、
395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、
433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、
471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、
509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、
547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、
585,587 589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、
623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、
661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、
699、701、703、705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、
737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、
775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、
813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、
851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、
889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、
927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、
965、967、969、971、973和975)以及純化產(chǎn)生的多肽來獲得，利用例如任何已知的表達(dá)系
統(tǒng)，包括但不限于谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、pGEX(Pharmacia Biotech Inc)、pMAL(New
England Biolabs, Beverly, MA)或 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway，NJ))。此夕卜，純化的 AT
或氧化還原酶多肽可以利用例如固相合成技術(shù)(參見例如Roberge，1995，Science, 269
202 ；Merrifield, 1997, Methods Enzymoi, 289 :3_13)通過化學(xué)合成來獲得。 純化的AT或氧化還原酶多肽或其片段可以用作免疫原來產(chǎn)生多克隆或單克隆抗
體，所述抗體具有對(duì)一或多種AT或氧化還原酶多肽的特異性結(jié)合親和力。這種抗體可以
利用本領(lǐng)域中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。全長(zhǎng)AT或氧化還原酶多肽或做為選擇AT或氧
化還原酶多肽的抗原性片段可以用作免疫原。AT或氧化還原酶多肽的抗原性片段通常包
括 AT 或氧化還原酶多肽(例如具有 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、
78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、
122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、
160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、
198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、具有表 43 或表 52 中所示的一個(gè)或
多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、
248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、
286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、
324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、
362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、
28400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、 438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、 476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、 514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、 552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、 590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、 628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、 666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、 704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、 742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、 780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、 818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、 856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、 894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、 932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、 970、972、974和976中所示的序列)的至少8個(gè)(例如10、15、20或30個(gè)氨基酸殘基并包 含AT或氧化還原酶多肽的表位，從而針對(duì)所述抗原性片段產(chǎn)生的抗體(例如多克隆或單克 隆的；嵌合的或人源化的)具有對(duì)一或多種AT或氧化還原酶多肽的特異性結(jié)合親和力。多肽可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)和定量，包括但不限于核磁共振(NMR)、 分光光度測(cè)定法、射線照相(蛋白質(zhì)放射性標(biāo)記)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相層析法 (HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散層析、各種免疫學(xué)方法，例如免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫 電泳、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、免疫熒光分析、凝膠電泳(例如 SDS-PAGE)、用抗體染色、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)、熱解質(zhì)譜測(cè)量、傅里葉變換紅外光譜 法、Raman光譜、GC-MS和LC-電噴射和cap-LC-串聯(lián)-電噴射質(zhì)譜法等等。新的生物活性 也可以利用美國(guó)專利No. 6，057，103中描述的方法或其變體來篩選。此外，細(xì)胞的一或多種 或所有多肽可使用蛋白陣列測(cè)量。使用DAT或氧化還原酶核酸和多肽的方法AT或氧化還原酶多肽或編碼這樣的AT和氧化還原酶多肽的AT或氧化還原酶核 酸分別可以用于促使色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和/或促使MP轉(zhuǎn)化為monatin (或逆反 應(yīng))。注意的是此處描述的反應(yīng)不限于任何特定的方法，除非另有說明。例如，在此公開的 反應(yīng)可以在體內(nèi)、體外或其組合地發(fā)生。提供了含有AT或氧化還原酶核酸分子的構(gòu)建體。適合于表達(dá)AT或氧化還原酶 多肽的構(gòu)建體包括表達(dá)載體是商業(yè)上可獲得的和/或通過本領(lǐng)域常規(guī)的重組DNA技術(shù)方 法容易地產(chǎn)生。代表性的構(gòu)建體或載體包括但不限于復(fù)制子(例如RNA復(fù)制子、噬菌體)， 自主自我復(fù)制性環(huán)形或線性DNA或RNA，病毒載體(例如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺 相關(guān)病毒載體)，質(zhì)粒，噬菌體，噬菌粒，粘粒，fosmid，細(xì)菌噬菌體或人工染色體。克隆載 體可以包括人工染色體，包括細(xì)菌人工染色體(BAC)，噬菌體Pl衍生的載體(PAC)、酵母人 工染色體(YAC)，或哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC)。示范性的載體包括但不限于pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3、pSVK3、pBPV、pMSG 禾口 pSVL(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
29Sweden)、GEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA)pQE70> pQE60> pQE-9 (Qiagen)、pDIO、 psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, pSV2CAT, pOG44, pXTU pSG (Stratagene)、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、DR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232_8 禾口 pCM7。對(duì)于代表性的質(zhì)粒、病毒等等的描述還參見美國(guó)專利No. 5，217，879。含有AT或氧化還原酶核酸分子的載體或構(gòu)建體可以具有與AT或氧化還原酶核酸 可操縱連接的、表達(dá)所必需的元件。表達(dá)必需的元件包括指導(dǎo)和調(diào)節(jié)核酸編碼序列表達(dá)的 核酸序列。表達(dá)所必需的元件的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子序列是能夠驅(qū)動(dòng)編碼序列 轉(zhuǎn)錄的序列。啟動(dòng)子序列可以是例如AT或氧化還原酶啟動(dòng)子序列，或非AT或非氧化還原 酶啟動(dòng)子序列。非AT和非氧化還原酶啟動(dòng)子包括例如細(xì)菌啟動(dòng)子如lacl、lacZ、T3、Τ7、 gpt、lambda PR、IambdaPL和trp以及真核啟動(dòng)子如CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和 晚期SV40、來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。啟動(dòng)子還可以是例如組成型、可誘 導(dǎo)和/或組織特異性的。代表性的組成型啟動(dòng)子是CaMV 35S ；代表性的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括 例如阿拉伯糖、四環(huán)素可誘導(dǎo)的和水楊酸應(yīng)答性啟動(dòng)子。表達(dá)所必需的其他元件可以包括調(diào)節(jié)核酸的表達(dá)的內(nèi)含子、增強(qiáng)子序列(例如 SV40增強(qiáng)子)、應(yīng)答元件或可誘導(dǎo)元件。表達(dá)所必需的元件可以包括前導(dǎo)區(qū)或信號(hào)序列。參 見例如SEQ ID NO :156，其是具有前導(dǎo)序列的DAT多肽。表達(dá)所必需的元件還可以包括例如 用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)所必需的元件 可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物或病毒來源，載體或構(gòu)建體可以含有來自不同來源的元 件的組合°例如在Goeddel, 1990,Gene Expression Technology :Methods in Enzymology, 185，Academic Press, San Diego, CA中描述了表達(dá)所必需的元件。此處描述的載體或構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括序列例如編碼可選擇標(biāo)記的那些 (例如編碼二氫葉酸還原酶的基因或?yàn)檎婧思?xì)胞賦予新霉素抗性的基因；為大腸桿菌 (E. coli)賦予四環(huán)素或氨芐青霉素抗性的基因；以及編碼啤酒糖酵母(S. cerevisiae)的 TRPl的基因)，可以用于AT或氧化還原酶多肽的純化的序列(例如6XHis標(biāo)簽)和涉及 載體或構(gòu)建體的復(fù)制的一或多種序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。此外，載體或構(gòu)建體可以含有例如 用于整合載體或構(gòu)建體的具有序列同源性的一或兩個(gè)區(qū)域。用于基因組整合的載體和構(gòu)建 體是本領(lǐng)域公知的。如在此使用的，可操縱連接的是指啟動(dòng)子和/或其他調(diào)節(jié)元件在載體或構(gòu)建體中 相對(duì)于AT或氧化還原酶核酸以一種指導(dǎo)或調(diào)節(jié)所述AT或氧化還原酶核酸表達(dá)的方式放 置。通常，與轉(zhuǎn)錄的序列可操縱連接的、表達(dá)所必需的啟動(dòng)子和其他元件與所述轉(zhuǎn)錄的序列 是物理上連續(xù)的，即它們是順式作用的。然而，某些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列例如增強(qiáng)子不必是物理連 續(xù)的或緊密接近表達(dá)被它們?cè)鰪?qiáng)的編碼序列。還提供的是宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞一般含有本發(fā)明的核酸序列例如編碼AT或氧 化還原酶的序列，或此處描述的載體或構(gòu)建體。宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的 任何宿主細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。示范性的細(xì)菌細(xì)胞包括埃希桿菌屬(Escherichia)、芽孢 桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、沙門氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的任何物種，包括例如大腸桿菌、乳酸 乳芽孢桿菌(L. lactis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)、鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)。示范性的真菌細(xì)胞包 括曲霉屬(Aspergillus)的任何物種，示范性的酵母細(xì)胞包括畢赤氏酵母屬(Pichia)、 糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)或許旺氏酵母屬 (Schwanniomyces)的任何物種，包括巴斯德畢赤氏酵母(P. pastoris)、啤酒糖酵母或粟酒 裂殖糖酵母(S.pombe)。示范性的昆蟲細(xì)胞包括Spodoptera或果蠅(Drosophila)的任何 物種，包括果蠅S2和Spodoptera Sf9。示范性的動(dòng)物細(xì)胞包括CHO、COS、Bowes黑素瘤、 C127、3T3、HeLa和BHK細(xì)胞系。參見例如Gluzman，1981，Cell，23:175。合適的宿主的選 擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。向各種細(xì)胞中導(dǎo)入核酸的技術(shù)是公知的，在技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中描述。載體或構(gòu)建 體可以利用多種技術(shù)的任一種導(dǎo)入宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒感染、基因槍或Ti 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。特定的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染或電穿孔 (Davis et al. , 1986, Basic Methods in Molecular Biology) 示范性的方法包括 CaPO4 沉淀、脂質(zhì)體融合、脂染(例如LIPOFECTIN )、電穿孔、病毒感染等等。AT或氧化還原酶核 酸可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組中(例如用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入)或可以在細(xì)胞質(zhì)中瞬時(shí) 或穩(wěn)定存在(即通過使用傳統(tǒng)的質(zhì)粒，利用標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)序列、選擇標(biāo)記等等)。宿主細(xì)胞的內(nèi)含物通過離心收獲，通過物理或化學(xué)手段破壞，產(chǎn)生的粗提取物保 持用于進(jìn)一步純化。為蛋白質(zhì)的表達(dá)所采用的微生物細(xì)胞可以通過任何方便的方法來破 壞，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的。表達(dá)的多肽或其片段可以通過一些方法從細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括 但不限于沉淀(例如硫酸銨或乙醇)、酸提取、層析(例如陰離子或陽離子交換、磷酸纖維 素、疏水性相互作用、親和力、羥磷灰石和凝集素)。如果希望，可以采用高效液相層析法 (HPLC)用于最后的純化步驟。也可以采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可以使用從DNA 構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的mRNA，所述DNA構(gòu)建體包含與編碼多肽或其片段的核酸可操縱連接的啟動(dòng) 子。在某些方面，DNA構(gòu)建體可以在進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前線性化。轉(zhuǎn)錄的mRNA然后與合 適的無細(xì)胞翻譯提取物例如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物保溫來產(chǎn)生期望的多肽或其片段。AT或氧化還原酶多肽、其片段或變體可以通過許多方法分析活性。檢測(cè)或測(cè)量酶 多肽的活性的方法一般包括組合多肽、其片段或變體與合適的底物，測(cè)定底物的量是否降 低和/或產(chǎn)物或副產(chǎn)物的數(shù)量是否提高。用于評(píng)估在此公開的DAT的活性的底物典型是色 氨酸和/或R-MP，產(chǎn)物是吲哚-3-丙酮酸和/或R，R-monatin。除了色氨酸或MP底物之 外，預(yù)期在此公開多肽還將利用取代的色氨酸和/或MP底物例如但不限于氯化的色氨酸或 5-羥色氨酸。此外，可以監(jiān)測(cè)或測(cè)量MP向monatin轉(zhuǎn)化的副產(chǎn)物(例如4-羥基-4-甲基 谷氨酸(HMG))。例如 Sugio et al.，1995，Biochemistry, 34 :9661_9669 ；Ro et al.，1996，F(xiàn)EBS Lett.，398 141-145 ；or Gutierrez et al. ,2000, Eur. J. Biochem.，267，7218-7223 描述了 評(píng)估 AT 活性的方法。此外，例如 Lee et al. , 2006, AEM, 72 (2) 1588-1594 ；和 Mayer，2002， J. Biomolecular Screening, 7 (2) :135_140描述了評(píng)估脫氫酶活性的方法。此外，在本文 實(shí)施例章節(jié)的A部分和B部分中描述了評(píng)估候選多肽的DAT活性的方法。為了確定多肽是 否屬于本發(fā)明的范圍，采用實(shí)施例章節(jié)中B部分描述的方法。
典型地，AT或氧化還原酶多肽展現(xiàn)了在約0. 05到20單位(例如約0. 05,0. 10、 0. 20,0. 30,0. 40,0. 50,0. 60,0. 70,0. 80,0. 90、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、 5. 5,6. 0,6. 5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 19. 5 或更多個(gè)單位)的范圍內(nèi)
的活性。如在此使用的，一個(gè)單位等于每mg酶每分鐘釋放的1 μ mol的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施 方案中，AT多肽的一個(gè)活性單位是每mg酶每分鐘產(chǎn)生的1 μ mol α-酮酸或酮(從相應(yīng)的 α -氨基酸或胺形成)。在可選擇的實(shí)施方案中，氨基轉(zhuǎn)移酶多肽的一個(gè)活性單位是每mg 酶每分鐘產(chǎn)生1 μ mol的α _氨基酸或胺(從相應(yīng)的α -酮酸或酮形成)。利用在此公開一或多種AT或氧化還原酶核酸或多肽，色氨酸向吲哚-3-丙酮酸 的轉(zhuǎn)化或MP向monatin的轉(zhuǎn)化可以在體外或體內(nèi)、在溶液中或在宿主細(xì)胞中連續(xù)或平行 進(jìn)行。當(dāng)一或多種反應(yīng)在體外進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)的期望成分可以通過在水性反應(yīng)介質(zhì)或溶液 中混合來組合，并維持足夠產(chǎn)生期望的產(chǎn)物的時(shí)間。做為選擇，一或多種此處描述的反應(yīng) 中使用的一或多種AT或氧化還原酶多肽可以固定在固相支持物上。固相支持物的實(shí)例 包括含有環(huán)氧、醛、螯合劑或伯胺基團(tuán)的那些。適合的固相支持物的具體實(shí)例包括但不限 于 Eupergit C (Rohm and Haas Company，Philadelphia，PA)樹脂珠和 SEPABEADS EC-EP(Resindion)。為了在體內(nèi)從色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸或從MP產(chǎn)生monatin，AT或氧化還原酶 核酸(例如表達(dá)載體)可以導(dǎo)入此處描述的任何宿主細(xì)胞中。取決于宿主細(xì)胞，發(fā)生轉(zhuǎn)化 反應(yīng)所必需的許多或所有輔因子(例如金屬離子、輔酶、吡哆醛磷酸或磷酸泛酰巰基乙胺) 和/或底物可以在培養(yǎng)基中提供。在容許體外或體內(nèi)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，轉(zhuǎn)化的效力可以通過確 定底物的量是否降低或產(chǎn)物的量是否提高來評(píng)估。在某些實(shí)施方案中，在此公開一或多種AT或氧化還原酶多肽的活性可以利用技 術(shù)人員已知的許多策略來改善或優(yōu)化。例如，進(jìn)行一或多種反應(yīng)的體內(nèi)或體外條件例如PH 值或溫度可以被調(diào)節(jié)來改善或優(yōu)化多肽的活性。此外，多肽的活性可以通過重新克隆AT或 氧化還原酶核酸到不同的載體或構(gòu)建體中和/或使用不同的宿主細(xì)胞來改善或優(yōu)化。例 如，可以使用被遺傳地工程化或選擇來展現(xiàn)提高的攝取或生產(chǎn)色氨酸的宿主細(xì)胞(參見例 如美國(guó)專利No. 5，728，555)。而且，AT或氧化還原酶多肽的活性可以通過確保或幫助多肽 的適當(dāng)折疊(例如通過使用蛋白伴侶多肽)或適當(dāng)?shù)姆g后修飾例如但不限于乙?；Ⅴ?化、ADP-核糖基化、酰胺化、糖基化、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、磷酸化、 異戊二烯化、硒化、硫酸化、二硫鍵形成和脫甲基以及共價(jià)附著分子如黃素、血紅素部分、核 苷酸或核苷酸衍生物、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物和/或磷脂酰肌醇來改善或優(yōu)化。此外，多肽的溶 解度可以利用本領(lǐng)域已知的許多方法來提高，例如但不限于低溫表達(dá)或周質(zhì)表達(dá)。在此利用色氨酸和/或MP作為底物鑒定了展現(xiàn)DAT活性的許多多肽。具體地，SEQ ID NO :950、946、948、892、894、866、870、870T242N、872、874、878、880、882、884、902、910、 918、176、178、154、220、156、216、238、224、230、232、214、CbDAT、CaDAT 和 LsDAT 展現(xiàn)了 DAT 活性。注意到 SEQ ID NO :946、892、894、220、176、1064、1066 和 1068 在實(shí)施例 B 部分中描 述的條件下展現(xiàn)了非常高的活性。注意SEQ ID NO 220和894在MP向monatin的轉(zhuǎn)化期 間產(chǎn)生了低水平的HMG副產(chǎn)物。氨基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶核酸或多肽在生產(chǎn)Monatin中的用途在此公開的一或多種DAT多肽可以用于生產(chǎn)monatin。Monatin是具有以下化學(xué)式的高強(qiáng)度甜味劑
立體異構(gòu)體”或“R，R monatin") ；S, S構(gòu)型(“S，S立體異構(gòu)體”或“S，S monatin") ；R, S構(gòu)型("R, S立體異構(gòu)體”或“R，S monatin")和S，R構(gòu)型(“S，R立體異構(gòu)體”或“S， R monatin”)。如在此使用的，除非另有說明，術(shù)語“monatin”用于指包括monatin的所 有四種立體異構(gòu)體的組合物、包括monatin立體異構(gòu)體的任何組合的組合物(例如僅包含 monatin的R，R和S，S立體異構(gòu)體的組合物)以及單一同分異構(gòu)形式(或其任何鹽)。由 于monatin的各種編號(hào)系統(tǒng)，monatin已知有許多可選的化學(xué)名稱，包括2_羥基_2_(吲 哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羥基-2-(IH-吲哚-3-基甲基)-戊二酸；4-羥 基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和3-(1-氨基-1，3- 二羧基-3-羥基-丁 -4-基)吲哚。產(chǎn)生monatin的各種立體異構(gòu)體(例如R，R monatin)的方法在例如WO 07/133183和WO 07/103389中揭示。在存在色氨酸的情況下，在此公開的一或多種DAT多肽 可以用于技術(shù)人員已知的方法來產(chǎn)生monatin組合物。如在WO 07/133183和WO 07/103389 中公開的，吲哚-3-丙酮酸(或其衍生物，參見例如WO 07/103389)向2-羥基2_(吲哚-3 基甲基))-4_酮戊二酸(“monatin前體”或“MP”)的轉(zhuǎn)化指示了 monatin的第一手性中心， 而MP向monatin的轉(zhuǎn)化指示了第二手性中心。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)monatin所需要的 一或多種轉(zhuǎn)化由超過一種的酶例如酶的混合物催化，從而產(chǎn)生的組合物或制品含有期望的 百分比的(例如最小和/或最大)一或多種所述monatin立體異構(gòu)體(例如R，Rmonatin)。 做為選擇，根據(jù)本發(fā)明的方法由兩個(gè)獨(dú)立的工程化的途徑產(chǎn)生的monatin被組合來產(chǎn)生含 有這種期望百分比的每種monatin立體異構(gòu)體的組合物或制品。利用在此公開的一或多種AT多肽產(chǎn)生的monatin按產(chǎn)生的總monatin的重量計(jì) 算可以是至少約0.5-30%的R，R-monatin。在其他實(shí)施方案中，利用在此公開的一或多 種多肽或生物合成途徑產(chǎn)生的monatin按產(chǎn)生的總monatin的重量計(jì)算是大于30%的R， R-monatin ；例如 R, R-monatin 是產(chǎn)生的總 monatin 的 40%、50%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%或99%。做為選擇，不同量的兩種或更多種monatin制品可以被組合 以產(chǎn)生有期望的R，R_monatin百分比的制品。例如，30% R, R-monatin的monatin制品可 以與90% R, R-monatin的monatin制品組合；如果組合等量的30%和90% R, R-monatin 制品，產(chǎn)生的monatin制品將是60% R，R-monatin。利用在此公開的一或多種DAT多肽產(chǎn)生的monatin可以是例如衍生物。"monatin 衍生物”具有以下結(jié)構(gòu)
3權(quán)利要求
一種將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚 3 丙酮酸(或吲哚 3 丙酮酸轉(zhuǎn)化成色氨酸)的方法，包括組合色氨酸(或吲哚 3 丙酮酸)和a)選自由SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587 589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973和975組成的組中的一或多種核酸分子，其中所述一或多種核酸分子編碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)或氧化還原酶活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表43或表52中所示一或多個(gè)突變的SEQ ID NO220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、1069、1070、1071、1072和1073組成的組中的一或多種多肽，其中所述一或多種多肽具有AT或氧化還原酶活性；e)d)的變體，其中所述變體具有AT或氧化還原酶活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有AT或氧化還原酶活性。
2. 一種將MP轉(zhuǎn)化成monatin或(monatin轉(zhuǎn)化成MP)的方法，包括組合MP (或monatin)禾口a)選自由 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、`73、75、77、79、81、83、85、87、89、 91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、 131、133、135、137、139、`141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、 169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、`203、205、 207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、 245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、`265、267、269、271、273、275、277、279、281、 283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、 321、323、325、`327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、 359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、`389、391、393、395、 397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、 435、437、439、441、443、445、447、449、``451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、 473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、 511、`513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、`549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、 587589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、`611、613、615、617、619、621、623、 625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、 663、665、667、669、671、`673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、 701、703、705、707、709、711、713、715、716、719、721、723、725、727、729、731、733、`735、737、 739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、 777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、`797、799、801、803、805、807、809、811、813、 815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、 853、855、857、`859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、 891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、`921、923、925、927、 929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、 967、969、971、973和975組成的組中的一或多種核酸分子；其中所述一或多種核酸分子編 碼具有氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)或氧化還原酶活性的多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有AT或氧化還原酶活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、`74、76、78、80、82、84、86、88、 90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、 130、132、134、136、138、140、`142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、`204、 206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示一或 多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、`236、238、240、242、244、246、 248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、 286、288、290、292、294、296、`298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、 324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、`360、 362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、 400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、`422、424、426、428、430、432、434、436、 438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、 476、478、480、482、`484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、 514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、`546、548、550、 552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、 590、592、594、596、598、600、602、604、606、`608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、 628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、 666、668、`670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、 704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、`732、734、736、738、740、 742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、 780、782、784、786、788、790、792、`794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、 818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、 `856、858、860、862、864、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、`890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、 928、930、932、934、936、938、`940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、 966、968、970、972、974、976、1069、1070、1071、1072 和 1073 組成的組中的一或多種多肽，其中所述一或多種多肽具有AT或氧化還原酶活性；e)d)的變體，其中所述變體具有AT或氧化還原酶活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有AT或氧化還原酶活性。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述一或多種核酸分子選自由SEQID ΝΟ:1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、`35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、`61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、`109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、`147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、`185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、 223、225、227、229、231、233、`235、237、239、241、243、245、247、249、865、867、869、871、873、`875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、`913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、935、937、939、941、943、945、947、949、`951、953、955、957、959、969、971、973和 975 組成的組中。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述一或多種多肽選自由SEQID NO :2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、`34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、`62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、`110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、`148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、`186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表43 或表52 中所示一或多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、870、870T242N、872、874、`876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、`914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、`952、954、956、958、960、970、972、974和 976 組成的組中。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述核酸分子具有選自由SEQID N0:945、891、893、 219、175、1063、1065和1067組成的組中的序列。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多肽具有選自由SEQID N0:946、892、894、220、 176、1064、1066和1068組成的組中的序列。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多肽具有與SEQID NO 1069或1070所示共有序 列相應(yīng)的序列。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多肽具有與SEQID NO 1071、1072和1073所示 共有序列相應(yīng)的序列。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、`43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、 71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、`105、107、109、111、113、115、 117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、 880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、 918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、 956、958、960、970、972、974和976具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少 99%序列相同性的多肽。
11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是與SEQID N0:220具有至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列相同性的多 肽。
12.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是與SEQID NO :870具有至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%或至少99%序列相同性的多肽。
13.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是與SEQID NO :894具有至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列相同性的多肽。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是突變體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述突變體在與DAT4978的殘基243對(duì)準(zhǔn)的殘基處具有突變。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述突變體選自由SEQID NO :870T242N、SEQ ID NO 220 G240N 和 SEQ ID NO 220 T241N 組成的組。
17.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體是被密碼子優(yōu)化的核酸分子。
18.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述核酸分子包含在表達(dá)載體中。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述核酸分子過表達(dá)。
20.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述氨基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶多肽被固定在固相支持 物上。
21.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述變體多肽是嵌合多肽。
22.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述色氨酸或MP是取代的色氨酸或取代的MP。6
23.一種將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸(或吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成色氨酸)的方法， 包括組合色氨酸(或吲哚-3-丙酮酸)和a)選自由SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41、43、45、47、49、51、53、55、·57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、 91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、·117、119、121、123、125、127、129、 131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、·167、 169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、 207、209、211、213、215、·217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、 245、247、249、865、867、869、871、873、875、877、879、·881、883、885、887、889、891、893、895、 897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、·931、933、 935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、969、971、973 和 975 組成的組 中的一或多種核酸分子，其中所述一或多種核酸分子編碼具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)活性的 多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有DAT活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、·4·0、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、·90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、·130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、·168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、·206、208、210、212、214、216、218、220、220G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示一或 多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、·224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、·884、886、888、890、892、894、 896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、 ·934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974、976、1069、 1070、1071、1072和1073組成的組中的一或多種多肽，其中所述一或多種多肽具有DAT活 性；e)d)的變體，其中所述變體具有DAT活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有DAT活性。
24.—種將MP轉(zhuǎn)化成monatin (或monatin轉(zhuǎn)化成MP)的方法，包括組合MP (或 monatin)禾口a)選自由 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、·41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、·91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、·131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、·169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、·207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、 245、247、249、865、867、869、·871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、·897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、 935、937、939、941、943、945、·947、949、951、953、955、957、959、969、971、973 和 975 組成的組中的一或多種核酸分子，其中所述一或多種核酸分子編碼具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)活性的 多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有DAT活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽；d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、·40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、·90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、·130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、·168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、·206、208、210、212、214、216、218、220、220G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示一或 多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、·224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、·884、886、888、890、892、894、·896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、·934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974、976、1069、 1070、1071、1072和1073組成的組中的一或多種多肽，其中所述一或多種多肽具有DAT活 性；e)d)的變體，其中所述變體具有DAT活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有DAT活性。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述核酸分子或多肽具有選自由SEQID NO 945、 891、893、219、175、1063、1065 和 1067 組成的組中的序列。
26.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述多肽具有與SEQID NO 1069、1070、1071、1072 或1073中所示共有序列相應(yīng)的序列。
27.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述色氨酸或MP是取代的色氨酸或取代的MP。
28.一種制備monatin的方法，包括在生產(chǎn)monatin的條件下使色氨酸接觸C3碳源和a)選自由SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、·41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、·91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、·131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、·169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、·207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、 245、247、249、865、867、869、·871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、·897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、933、·935、937、939、941、943、945、947、949、951、953、955、957、959、969、971、973和 975 組成的組 中的一或多種核酸分子，其中所述一或多種核酸分子編碼具有D-氨基轉(zhuǎn)移酶(DAT)活性的 多肽；b)a)的變體，其中所述變體編碼具有DAT活性的多肽；c)a)或b)的片段，其中所述片段編碼具有DAT活性的多肽； d)選自由SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、 90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、 130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、220 G240N、220 T241N、具有表 43 或表 52 中所示一或 多個(gè)突變的 SEQ ID NO :220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、866、868、870、870T242N、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、 896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、 934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、970、972、974、976、1069、 1070、1071、1072和1073組成的組中的一或多種多肽，其中所述一或多種多肽具有DAT活 性；e)d)的變體，其中所述變體具有DAT活性；或f)d)或e)的片段，其中所述片段具有DAT活性。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸分子或多肽選自由SEQID NO :945、891、893、 219、175、1063、1065 和 1067 組成的組。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述C3碳源選自由丙酮酸、草酰乙酸和絲氨酸組成的組。
31.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包含合酶/裂合酶(EC4. 1. 2.-或4. 1. 3.-)多肽。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述合酶/裂合酶(EC4. 1.2.-或4. 1.3.-)多肽是醛縮酶。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述醛縮酶選自由KHG醛縮酶(EC4. 1. 3. 16)或HMG醛 縮酶(EC 4. 1. 3. 16)組成的組。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述生產(chǎn)的monatin是R，Rmonatin。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述生產(chǎn)的monatin是S，Rmonatin。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所述色氨酸是取代的色氨酸。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述取代的色氨酸是6-氯-D-色氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶多肽以及編碼這種多肽的核酸。還提供了使用這種氨基轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶核酸和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101970679SQ200880127576
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日
發(fā)明者A·布埃諾, C·索爾海德, D·P.·魏納, E·馬拉斯科, F·A.·桑切斯-列拉, J·M.·倫多爾夫, J·M.·拉普拉薩, J·昆卡, M·L.·德蘇扎, P·M.·?？怂? P·盧京比爾, S·C.·麥克法倫, S·R.·科爾曼, 牛偉 申請(qǐng)人:嘉吉公司