專利名稱：：一種新的植酸酶的克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型植酸酶基因、該基因編碼的植酸酶蛋白，生產(chǎn)該植酸酶的中間型耶爾森菌，一種在宿主細(xì)胞(如畢赤酵母)表達(dá)植酸酶的方法，以及把該植酸酶作為一種有效成分的飼料添加劑。此外，本發(fā)明還提供了一種從目標(biāo)生物體簡(jiǎn)單而快速的分離植酸酶基因方法。
背景技術(shù)：
：植酸磷的含量占動(dòng)物日糧中總磷50-70%。然而，單胃動(dòng)物如雞和豬，缺乏從植酸分子水解釋放無(wú)機(jī)磷的消化酶，以致磷的利用率非常低。沒有被消化的植酸磷，通過(guò)消化道被排出體外。這導(dǎo)致對(duì)土地和水資源的增加的磷生態(tài)負(fù)擔(dān)。此外，由于植酸螯合幾個(gè)必要礦物質(zhì)，抑制礦物質(zhì)吸收?？傊?，在消化道中植酸降低食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼料的利用率。顯然，磷(P)是一個(gè)必要的生長(zhǎng)元素，所以無(wú)機(jī)磷(如磷酸氫鈣，脫氟磷酸三鈣)或動(dòng)物產(chǎn)品(如肉骨粉，魚粉)被添加到動(dòng)物飼料中，以滿足動(dòng)物對(duì)磷的營(yíng)養(yǎng)需要。但是這些添加的成分都很昂貴。植酸(肌醇六磷酸)是谷類食品或飼料中磷的主要儲(chǔ)存形式。植酸酶，是一類水解磷酸單脂鍵的磷酸酶，它能夠從植酸中水解釋放無(wú)機(jī)磷，植酸是P在谷物和飼料中的主要儲(chǔ)存形式(EGmfetaU987)。植酸酶廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物?；诓煌瑏?lái)源的植酸酶的特征的分析，微生物植酸酶正越來(lái)越多的受到關(guān)注。并且，微生物來(lái)源的植酸酶作為飼料添加劑，添加到典型的單胃動(dòng)物日糧中，已經(jīng)明顯的提高了植酸磷的營(yíng)養(yǎng)利用率(Cromwell,etal,1993)。其結(jié)果是降低了動(dòng)物飼料中無(wú)機(jī)磷的補(bǔ)充量，同時(shí)降低了排泄物中的磷的含量(Komegay,etal，1996)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，一方面，越來(lái)越多的微生物菌植酸酶已被分離和/或純化。例如，"PurificationandCharacterizationofaPhytasefromKlebsiellaterrigena"，(Greineretal.ArchBiochemBiophys.1997May15;341(2》201-6)，"PurificationandpropertiesofathermostablephytasefromBacillussp.DSl1"(Kimetal.EnzymeMicrobTechnol,1998Jan,22(1),2-7)，"IsolationandcharacterizationofaphytasewithimprovedpropertiesfromCitrobacterbraakii"(Kimetal.BiotechnolLett.2003Aug;25(15):1231-4)，"Genecloning,expressionandcharacterizationofnovelphytasefromObesumbacteriumproteus，，(Zininetal.FEMSMicrobiolLett.2004Jul15;236(2):283-90);另一方面，通過(guò)定點(diǎn)突變或基因改組，常規(guī)植酸酶的性能改良也取得了一定進(jìn)展。例如；"植酸酶phyA-m基因結(jié)構(gòu)延伸突變改善酶的熱穩(wěn)定性"(陳惠等，生物工程學(xué)報(bào)，2005年11月，21巻6期，983-987)，或者"Site-directedmutagenesisofEscherichiacoliphytase"(USpatent6,841,370,Lei2005)。這些取得的成果使得植酸酶的生產(chǎn)成本有了很大程度的降低。因?yàn)檫@些優(yōu)勢(shì)，一些巳知的植酸酶在飼料工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。但是，在這些已廣泛使用的植酸酶中，仍然存在著一些缺陷。因?yàn)檫@些植酸酶作為飼添加劑，并不能發(fā)揮它的理想作用。例如，大部分植酸酶在飼料制粒加工的過(guò)程中就已經(jīng)高溫變性失活了，所以在腸道中不能發(fā)揮降解植酸的作用。其原因因酶不同而不同。主要是由于，這些酶的穩(wěn)定性比較差(pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性以及在儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性)和在胃腸道環(huán)境中活性比較低的緣故。由于目前使用的植酸酶存在的這些缺陷，因此，人們希望能夠找到這樣一種新的植酸酶其具有非常好的穩(wěn)定性，在動(dòng)物胃腸道中有非常高的活性，并且該植酸酶還能夠通過(guò)發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)，這樣可以使其成本大幅度的降低，從而能夠進(jìn)一步推廣該植酸酶的使用。另外，現(xiàn)有技術(shù)中分離植酸酶的手段有限，主要是通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)，或直接從純化蛋白入手。但是，這兩種方式都比較耗費(fèi)時(shí)間和勞力，效率非常的低，并且也非常昂貴。并且，在不同物種中植酸酶的相似性比較低，因此要獲得一段序列比較困難，這也是一個(gè)種對(duì)于利用現(xiàn)有方法去獲得一個(gè)新基因的挑戰(zhàn)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，我們從中國(guó)一號(hào)冰川(新疆)的凍土中的數(shù)千種菌株中分離得到一株新型產(chǎn)植酸酶微生物。我們也確定了編碼具有植酸酶活性蛋白的核苷酸序列。在如畢赤酵母的表達(dá)宿主細(xì)胞中，植酸酶的表達(dá)量達(dá)到了一個(gè)較高水平。因此，重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)適合于工業(yè)化生產(chǎn)。并且這個(gè)新的植酸酶具有多種非常優(yōu)良的特性，這些優(yōu)良特性適合提高飼料的利用效率。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種全新的生產(chǎn)植酸酶的中間耶爾森菌。本發(fā)明也提供了一種新的編碼具植酸酶活性的蛋白的新基因，其包含SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其衍生序列。本發(fā)明還提供了具有如下性質(zhì)的植酸酶，其理論分子量46kDa，最適pH在4-5之間，最適溫度在50-6(TC之間，理論pl值為7.7，比活在3000U/mg以上，且具有強(qiáng)的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。所述植酸酶可分離自耶爾森氏菌屬微生物，優(yōu)選為中間型耶爾森氏菌。因此本發(fā)明也涉及一種分離的蛋白，其選自a)包含SEQIDN0.3所示氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDN0.2所示的核酸分子或其簡(jiǎn)并序列所編碼的多肽；c)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDN0.2所示核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的核酸編碼且具有植酸酶活性的多肽；d)由SEQIDNO.2所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼且具有植酸酶活性的多肽；e)由SEQIDN0.3所示核酸分子所編碼被替換、刪除和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基后具有植酸酶活性的多肽；f)與SEQIDN0.2所示的氨基酸序列具有至少60。/。，優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、或至少90%,更優(yōu)選至少95%同源性且具有植酸酶活性的多肽。特別地，本發(fā)明還提供了一種簡(jiǎn)單有效的從基因組DNA中克隆分離植酸酶的基因的方法，所述方法包括a)基于植酸酶保守序列THGXRXP和HD設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物；b)利用所述引物通過(guò)PCR擴(kuò)增部分植酸酶序列；和c)進(jìn)一步通過(guò)TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。另外，本發(fā)明提供了包括所述編碼植酸酶的核酸的重組載體、已引入所述載體或所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞(如畢赤酵母)、以及在宿主細(xì)胞中表達(dá)該酶的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及所述植酸酶或者該植酸酶的生產(chǎn)菌株在制備飼料添加劑中的應(yīng)用，以及含有作為有效組分的蛋白和/或宿主細(xì)胞的飼料添加劑。本發(fā)明的飼料添加劑因其含有促進(jìn)植酸水解的植酸酶，從而可以有效地用于制備動(dòng)物飼料。圖1顯示利用純化的植酸酶及其脫糖基化植酸酶的SDS電泳結(jié)果。泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為純化的植酸酶，泳道3為脫糖基化處理的植酸酶。圖2顯示新酶的最適pH和pH穩(wěn)定性。在使具有最大活性的pH條件下測(cè)定的活性為100%,在各pH值處的活性顯示為相對(duì)活力(％)。圖3A顯示新植酸酶的最適溫度。在使具有最大活性的溫度條件下測(cè)定的活性為100%，在各溫度的活性顯示為相對(duì)活力(％)。圖3B顯示新植酸酶在8(TC時(shí)的熱穩(wěn)定性。圖4顯示新植酸酶的蛋白酶穩(wěn)定性。關(guān)于生物材料的保藏說(shuō)明由發(fā)明人分離的中間型耶爾森氏菌(Yersiniaintermedi)H-27己于2006年4月25曰保藏在位于中國(guó)北京市中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC1702。序列簡(jiǎn)述SEQIDNo.1:中間型耶爾森氏菌(Rry/w'a/"fcnwe必")H-27的16SrDNA序列；SEQIDNo.2:新植酸酶的核酸序列；SEQIDNo.3:新植酸酶的氨基酸序列；SEQIDNo.4:克隆植酸酶基因的正向簡(jiǎn)并引物序列；SEQIDNo.5克隆植酸酶基因的反向簡(jiǎn)并引物序列。發(fā)明詳述為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，首先，本發(fā)明提供了具有植酸酶活性的菌株。該菌株從中國(guó)一號(hào)冰川土樣(新疆)分離的。該菌株產(chǎn)生的植酸酶的活性通過(guò)硫酸亞鐵鉬藍(lán)法被測(cè)定。并且通過(guò)16srRNA序列分析鑒定了顯示植酸酶活性的菌株。結(jié)果，16SrDNA的基本序列顯示與Iferw'm'a!'"f"mec/!'a99.5。/。的一致性，以及與Kra!'m'aaWovae和yea/m'awo//flA"e"/的序列的99%的一致性，所以可以確定本發(fā)明的菌株是一個(gè)新菌株。該菌株為革蘭氏陰性桿菌，具有與大腸桿菌相似的大小，其生長(zhǎng)的最佳溫度的菌株為3(TC，在光顯微鏡下可被觀察。從生理生化特性調(diào)查中，該菌株被證實(shí)為一種兼性好氧微生物，這就是說(shuō)它可以在有養(yǎng)氣或無(wú)氧氣的條件下很好生長(zhǎng)?；谠摼甑男螒B(tài)、生理特性和16SrDNA的序列的研究結(jié)果，在本發(fā)明中分離到的菌株被命名為":rera'm力i"^mec!'aH-27"，已于2006年4月25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC1702。本發(fā)明涉及具有如下性質(zhì)的植酸酶，其理論分子量46kDa;最適pH在4-5之間，優(yōu)選pH4.5;最適溫度在50-60。C之間，優(yōu)選55t:;理論pl值為7.7;高于3000U/mg的高比活，優(yōu)選3300U/mg以上，如3糊、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500U/mg;此酶對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶具有非常強(qiáng)的抗性。所述植酸酶可分離自耶爾森菌屬微生物，優(yōu)選為中間型耶爾森氏菌。本發(fā)明也提供了一種包含SEQIDN0.3所示氨基酸序列的分離蛋白。優(yōu)選地，所述酶是由SEQIDN0.2所示的多核苷酸或其簡(jiǎn)并序列所編碼。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明也提供了所述蛋白的衍生物，其可由SEQIDN0.3所示的多肽序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(例如，一個(gè)或幾個(gè)，或者如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10的選自1~10的值，或者介于上述值中間的范圍)氨基酸殘基的取代、缺失和/或插入獲得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一個(gè)常見的策略是保守氨基酸取代，即將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域己有明確定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有卩-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在植酸酶蛋白中用來(lái)自同一側(cè)鏈類的另一氨基酸殘基替換一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)，將不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響其植酸酶活性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因的克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢(shì)必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動(dòng)分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的標(biāo)簽，或Xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。又在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的具有植酸酶活性的蛋白包括由如在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中的SEQIDN0.2所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交"是用來(lái)描述典型地相互間至少60%同源的核苷酸序列仍可相互雜交的雜交和清洗條件。優(yōu)選地，嚴(yán)謹(jǐn)條件為這樣的條件，在此條件下相互間具有至少約65%、更優(yōu)選地至少約70%、且甚至更優(yōu)選地至少約75%或更高同源性的序列一般仍可相互雜交。此嚴(yán)謹(jǐn)條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，可在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1隱6.3.6中手戈至lj。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)優(yōu)選、非限制性實(shí)例為在6xSSC中于約45'C雜交，然后在0.2xSSC、0.1%SDS中于50-65'C洗滌一次或多次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可通過(guò)提高雜交溫度，例如至5(TC、55°C、6(TC或65'C來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解由于自然變異所致的遺傳多態(tài)性可在群體中的個(gè)體間存在。此類自然變異一般可在植酸酶基因的核苷酸序列中導(dǎo)致1-5%的差異。植酸酶中任何以及所有這種自然變異產(chǎn)生的、并且不改變植酸酶功能活性的核苷酸突變和所得氨基酸多態(tài)性也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明也包括由SEQIDN0.2所示多聚核苷酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，植酸酶蛋白為至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%，或至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%，或至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%，或者至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，更優(yōu)選地至少約98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%，甚至更優(yōu)選地至少約99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8。/。、99.9。/?；蚋叩赝从诒景l(fā)明的SEQIDN0.3所示的全長(zhǎng)氨基酸序列的活性蛋白。介于上述值中間的范圍和同一性值(例如，69-90%同源性或98.1-99.9%—致性)也包括在本發(fā)明中。例如，也包括使用任一上述值的組合作為上限和/或下限的同一性值范圍。在兩個(gè)序列間比較序列、并確定百分同源性為本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可利用數(shù)學(xué)算法完成，如市售可得的軟件，或整合在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的軟件，例如多序列比對(duì)程序CLUSTALWBLOCKS或BLAST等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道針對(duì)所分析的具體序列如何優(yōu)化各程序中相應(yīng)的參數(shù)設(shè)置(如分值、字長(zhǎng)、缺口罰分、權(quán)重等等)。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，獲得比對(duì)結(jié)果如下表1:本發(fā)明植酸酶蛋白與已知植酸酶蛋白的一致性比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>另一方面，本發(fā)明提供一種新的植酸酶基因SEQIDNO.2。本發(fā)明進(jìn)一步包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于本發(fā)明的SEQIDN0.2所述核苷酸序列之一的核酸分子、及其編碼的植酸酶蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子為如在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDN0.2所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，優(yōu)選其等位基因或天然突變體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的分離核酸分子具有編碼具SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在再一實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子編碼與SEQIDN0.3的氨基酸序列基本一致的全長(zhǎng)植酸酶蛋白質(zhì)，例如，通過(guò)取代、刪除和/或插入一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或幾個(gè)，或者選自1~10的值)氨基酸殘基而源自SEQIDN0.3的蛋白，或者，與SEQIDN0.3的氨基酸序列至少99%同源的蛋白。該核酸分子優(yōu)選為至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%，或至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%，或至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%，更優(yōu)選至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97.7%、97.8%、97.9%，或至少約98%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%,甚至更優(yōu)選地至少約99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9W或更高地同源于SEQIDN0.2的核苷酸序列，介于上述值的范圍或同一性值(如76~97%同源或97.8~99.9%相同)也包括在本發(fā)明中。利用GenBank中BLAST的缺省參數(shù)設(shè)置，獲得以下比對(duì)結(jié)果。表2:比對(duì)結(jié)果來(lái)源/編碼的多肽Genbank登錄號(hào)一致性變形月巴桿菌(Obesumbacteriumproteus)應(yīng)酸酶AY37809656%大腸桿菌^Esc/7m'c//aco//9/phytaseAF53721950%又在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有所述植酸酶基因的重組載體、已導(dǎo)入所述載體或所述基因的重組宿主細(xì)胞(例如，巴斯德畢赤酵母PichiaPastoris)、以及在宿主細(xì)胞中表達(dá)酶的方法。術(shù)語(yǔ)"載體"指能運(yùn)送已與其連接的另一核酸的核酸分子，例10如其可以為質(zhì)?；虿《据d體。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含以適于核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式的本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的調(diào)節(jié)序列，其與表達(dá)的核酸可操作地連接。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞中)的方式連接。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)、激活物結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件(例如，終止子、多聚腺苷酸化信號(hào)、或mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的其它元件)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于如欲轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包括融合蛋白的蛋白或肽。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、酵母(如畢赤酵母、黑曲霉)、昆蟲細(xì)胞(如使用桿狀病毒表達(dá)載體的Sf9細(xì)胞或家蠶細(xì)胞)或植物細(xì)胞(如膿桿菌介導(dǎo)的擬南芥、煙草、玉米等)中表達(dá)。從而，本發(fā)明涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、優(yōu)選畢赤酵母。宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞，其包括但不限于上述的那些宿主細(xì)胞。優(yōu)選畢赤酵母細(xì)胞。巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a戶o^w^)是一種甲醇酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行代謝。這個(gè)系統(tǒng)因?yàn)槠浔磉_(dá)高水平的異源蛋白的能力而聞名。作為有效的表達(dá)系統(tǒng)，許多植酸酶基因己成功地在畢赤酵母中表達(dá)。同樣本發(fā)明提供的新的植酸酶基因也在畢赤酵母中表達(dá)，并具有高表達(dá)水平。在500ml燒瓶中，誘導(dǎo)48h后，細(xì)胞外植酸酶活性達(dá)到389U/mL。因此，通過(guò)發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)植酸酶非常容易，并且成本比任何時(shí)候都低。載體DNA可通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"、"接合"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(例如，線性DNA或RNA(例如，線性化載體或無(wú)載體的單獨(dú)的基因構(gòu)建體))或載體形式的核酸(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子或其它DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可在《分子克隆》實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,NY,1989，Sambrook等人，和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))植酸酶蛋白。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞制備植酸酶蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已導(dǎo)入了編碼植酸酶蛋白的重組表達(dá)載體，或其基因組中已導(dǎo)入了編碼野生型或改變的植酸酶蛋白的基因)，直至產(chǎn)生植酸酶蛋白。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離植酸酶蛋白。本發(fā)明的再一方面為在畢赤酵母中表達(dá)的植酸酶。為了測(cè)定植酸酶的性質(zhì)，通過(guò)如硫酸銨沉淀，透析、超濾和層析的簡(jiǎn)單方法純化植酸酶。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的凈化，植酸酶的純度足以研究酶學(xué)性質(zhì)的研究。純化的重組植酸酶分子量為45kDa，并且當(dāng)使用植酸作為底物時(shí)被活化。植酸酶為在50-6(TC下時(shí)顯示高酶活性的酸性酶，并且在55'C下觀察到最佳活性。在pHl-10之間都具有非常穩(wěn)定的酶活性，在pH4-5之間可以觀察到最佳活性，并且最適pH為4.5。Fe2+、Z^+和Cu2+強(qiáng)烈抑制酶活性，但其他金屬離子對(duì)該酶沒有明顯的影響。同時(shí)，在較高溫度下該酶具有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)該酶在8(TC放置一小時(shí)，仍有40%的酶活性保留。此外，該植酸酶對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常強(qiáng)的抗性。此外，本發(fā)明還涉及所述植酸酶或生產(chǎn)植酸酶的宿主細(xì)胞在制備詞料添加劑中的應(yīng)用，以及含有作為有效組分的所述蛋白和/或宿主細(xì)胞的飼料添加劑。本發(fā)明的飼料添加劑由于其含有增強(qiáng)飼料谷物中磷的利用的植酸酶，從而可以有效地用于動(dòng)物飼料的生產(chǎn)。所述飼料添加劑可制備為干粉或液體制劑，并且可額外地包括一種或多種酶制劑。所述額外的酶制劑也可以為干燥的或液體制劑形式，并且可以選自包括以下酶的組角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、和產(chǎn)生葡萄糖的酶，如水解淀粉和糖原的a-l,4糖苷鍵的淀粉酶、水解有機(jī)磷酸的磷酸酶、降解纖維素的羧甲基纖維素酶、降解木糖的木聚糖酶、將麥芽糖水解為兩種葡萄糖的麥芽糖酶、以及將蔗糖水解為葡萄糖-果糖混合物的轉(zhuǎn)化酶。除了植酸酶和/或產(chǎn)植酸酶微生物，本發(fā)明的飼料添加劑還可額外包括其它非致病性的有益微生物。所述附加微生物可以選自包括以下的組可以產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶的枯草桿菌、如雙歧桿菌的益生菌、具有在厭氧條件下降解有機(jī)物能力和生理活性的乳酸菌、增加家畜重量、促進(jìn)牛奶生產(chǎn)并有助于詞料的消化和吸收的如米曲霉菌的絲狀真菌、以及如釀酒酵母的酵母。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種從基因組DNA中獲取植酸酶基因的簡(jiǎn)便有效方法。具有兩種獲取新植酸酶基因的常規(guī)方法一種方法是從基因組庫(kù)中分離新植酸酶基因，另一種是以蛋白開始。但是，常規(guī)方法都比較耗費(fèi)時(shí)間和勞力、困難、并且昂貴。為了解決上述問題，我們嘗試發(fā)展一種通過(guò)結(jié)合各種現(xiàn)有技術(shù)能夠容易地獲得植酸酶基因的方法。具體而言，通過(guò)分析大量的為主要植酸酶主要種類的組氨酸酸性磷酸酶的氨基酸序列，利用BLOCKS[http://blocks.flicrc.org/blocks/make_blocks.html〗，我們?cè)诮M氨酸酸性磷酸酶中找到了兩個(gè)保守序列RHGXRXP和HD。基于這兩個(gè)保守序列和在不同生物中的偏愛密碼子，我們?cè)O(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物正向簡(jiǎn)并引物，F(xiàn)I(ForwardPrimer):5'-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA陽(yáng)3，(20mer)(SEQIDN0.4)和反向簡(jiǎn)并引物RI(ReversePrimer):5，陽(yáng)TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3，(20mer)(SEQIDN0.5)，通過(guò)PCR從染色體DNA中擴(kuò)增部分植酸酶基因序列(其中，各縮寫的含義如下表3所示)。這個(gè)部分序列在己知的組氨酸酸性磷酸酶中約為900bp，可以根據(jù)該部分序列的大小通過(guò)在瓊脂糖凝膠上電泳篩選擴(kuò)增的序列。然后，所獲得的900bp的序列進(jìn)行測(cè)序和BLAST分析。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，我們可以判斷所獲的900bp序列是否為新的植酸酶基因。如果分析顯示該卯0bp的序列為部分的新植酸酶基因，則下一步為獲得新植酸酶基因的全序列。為了獲得可能的植酸酶基因的全序列，通過(guò)TAIL-PCR(Liuetal.，1995)分別克隆該部分序列的上下游區(qū)域。與常規(guī)方法相比，新方法是非常方便、有效、價(jià)格低廉、易于獲取新型植酸酶基因。通過(guò)這種方法，我們目前已經(jīng)成功地獲得了兩個(gè)新植酸酶基因(一個(gè)來(lái)自本申請(qǐng)描述的中間型耶爾森氏菌H-27(YersiniaintermediH-27)，另一來(lái)自本發(fā)明人的另一申請(qǐng)中描述的無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus))。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，而并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例l:植酸酶產(chǎn)生菌的分離植酸酶產(chǎn)生菌株是從中國(guó)一號(hào)冰川(新疆)的凍土樣品中分離的。具體地，為了分離植酸酶產(chǎn)生菌種，于2005年4月采集了中國(guó)一號(hào)冰川(新疆)的凍土樣品，并在冰柜中儲(chǔ)存數(shù)日，直到其可以在實(shí)驗(yàn)室被加工操作。冰凍土壤被懸浮在無(wú)菌水中，并稀釋，然后，不同樣品的懸浮液接種無(wú)瓊脂的LB培養(yǎng)基中，接著分別在4'C、l(TC、15'C和3(TC下培養(yǎng)1-2天。接著利用硫酸亞鐵鉬藍(lán)法(詳見下面的實(shí)施例4)測(cè)定在不同溫度下、在不同樣品的培養(yǎng)液和細(xì)胞破碎液中的植酸酶活性。在細(xì)胞破碎液中的植酸酶活性是可檢測(cè)的，其顯示這些菌株具有細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性。首先挑選植酸酶活性的樣品，并且判定適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度為3(TC。具有植酸酶的活性的樣品被稀釋，并涂覆于具1.5M瓊脂的LB培養(yǎng)基上，在30'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天。挑選具有各種形態(tài)的不同克隆，接種于5毫升LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。測(cè)量細(xì)胞破碎液中各菌落的植酸酶活性，最后在所選菌落中挑選顯示最高植酸酶活性的菌株。該菌株的編號(hào)為H-27。實(shí)施例2:分析植酸酶產(chǎn)生菌H-27的特征通過(guò)革蘭氏染色法，在實(shí)施例l中分離的H-27菌被確定為是革蘭氏陰性菌。此菌是典型的桿菌，在顯微鏡下具有與大腸桿菌相似的大小。進(jìn)一步研究了其部分生理生化特性。結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陰性、兼性、厭氧微生物，其可以在無(wú)氧或有氧的環(huán)境中生長(zhǎng)。此菌的最適生長(zhǎng)溫度為3(TC，我們也分析了該菌的16srRNA序列。使用PromegaTaq試劑盒，通過(guò)PCR擴(kuò)增該菌的16SrDNA序列(SEQIDNO.l)，并且，通過(guò)使用BLAST和多序列比對(duì)程序CLUSTALW比對(duì)該菌的16SrDNA序列和在GenBank中的參考序列。結(jié)果16srDNA的堿基序列顯示了與中間型耶爾森氏菌之間具有99.5%的一致性，與阿氏耶爾森菌(1fersz力/aofWorae)禾口莫氏耶爾森菌(ifers/m'amollaretii)的16srDNA序列之間具有99。/。的一致性?；谒x菌株的形態(tài)、生理和16SrDNA的研究結(jié)果，我們可以確定此菌為新的中間型耶爾森氏菌(;rera'm'a/wfew7e^fl)。根據(jù)以上結(jié)果和研究過(guò)程中使用的記錄號(hào)，此菌株被命名為"中間型耶爾森氏菌H-27"，并在2006年4月25日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏號(hào)為CGMCC1702。實(shí)施例3:植酸酶基因的克隆當(dāng)?shù)鞍椎幕驗(yàn)槎嗷蚣易宓囊阎蓡T時(shí)，同源克隆是非常有效簡(jiǎn)單。明顯地，根據(jù)植酸酶的分類，大部分細(xì)菌源的植酸酶都屬于組氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族。通過(guò)多序列比對(duì)程序CLUSTALW和BLOCKS(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make—blocks.html)分析HAP家族的各種序列，我們發(fā)現(xiàn)HAP酶中具有兩個(gè)保守區(qū)域，即RHGXRXP和HD區(qū)域。基于這兩個(gè)保守區(qū)域，能夠設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，從而通過(guò)PCR從中間型耶爾森菌(&M/m'fl/Wwme&'a)基因組DNA中擴(kuò)增部分植酸酶序列。<3-1>部分植酸酶基因序列的獲得根據(jù)兩個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并使用DNA合成儀合成。以中間型耶爾森菌(y^y/m'a/w^7we&a)基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。除了簡(jiǎn)并引物和基因組DNA模板外，其他用于PCR擴(kuò)增的試劑都購(gòu)自TIANGENBIOTECHCO.,LTD。通過(guò)優(yōu)化PCR參數(shù)，我們確定了PCR退火溫度為5(TC，并且PCR的反應(yīng)條件為l個(gè)循環(huán)，95°C，2分鐘；30個(gè)循環(huán)，95°C，30秒/退火溫度，30秒/72。C，l分鐘；最后在72。C延伸5分鐘，PCR產(chǎn)物保存于4'C。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)一系列由簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的片段。使用適當(dāng)?shù)腄NA標(biāo)準(zhǔn)分子量，能夠選擇期望大小(900bp)的條帶。結(jié)果，通過(guò)TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收約900bp的DNA條帶大小，再將其克隆至pGEMTeasy載體(Promega)，然后轉(zhuǎn)化大腸菌JM109。分離具有靶DNA片段的轉(zhuǎn)化菌株，并提取含耙DNA片段的質(zhì)粒，測(cè)序約900bpDNA序列。結(jié)果確定了901bp的DNA序列為部分植酸酶基因。<3-2>完整的植酸酶序列的克隆為了獲得完整的植酸酶基因序列，通過(guò)熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)(Liuetal.,1995)分別克隆以上所獲得的901bp片段的上游和下游區(qū)域。TAIL-PCR是一種非常強(qiáng)大的用于揭示已知序列兩端的未知序列的工具，并且是非常簡(jiǎn)單、快速、便宜、有效的方法。根據(jù)以上所獲得的901bp片段的DNA序列，設(shè)計(jì)了用于TAIL-PCR的巢式特異性引物，它們分別為uspl(5'-CTATTCCATCAAGGAATGCCTGCCCCG-3，)(upspecialprimer),usp2(5，-CGCGTTCGTTGATCAACATCGGCCtg-3，)，usp3(5，-GGGTTAAGTATCCTGCGGCG-3，)，dspl(5'-GTTGCCTGGCATCGGTTAACGGGAG-3)(downspecialprimer),dsp2(5'-CGCTCGTCATAAGGGCACACCGTTGC-3，)，dsp3(5,-CCGTCTCATTATTGTTTATTGCTGG-3，)。另外一端的任意簡(jiǎn)并引物((AD，arbitrarydegenerateprimers)包括AD6(5，-CAWCGICNGAIASGAA-3，)；AD9(5，-WCAGNTGWTNGTNCTG-3，))是TAIL-PCR成功擴(kuò)增的關(guān)鍵。巢氏特異性引物和AD引物一起使用，他們的區(qū)別在于其退火溫度不同。TAIL-PCR擴(kuò)增的程序和Liu(Liuetal.，ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995Feb10;25(3):674-81)相同，此處通過(guò)引用包含其全部?jī)?nèi)容。交替高、低溫退火溫度循環(huán)產(chǎn)生在一端具有特異性引物、在另一端具有AD引物的特異性產(chǎn)物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析TAIL-PCR的產(chǎn)物，我們獲得已知序列的約900bp的上游DNA，并且，通過(guò)優(yōu)化TAIL-PCR參數(shù)，也獲得已知片段的約650bp的下游DNA。通過(guò)TaKaRa的瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別純化回收兩個(gè)片段，并將所回收的片段連接到pGEMTeasy載體(Promega)。，然后轉(zhuǎn)化大腸菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。兩個(gè)片段被分別測(cè)序。三個(gè)序列都被輸入DNASTAR軟件，并通過(guò)序列拼接程序組裝，這樣確定開放閱讀框。該1326bp閱讀框含有一段信號(hào)肽序列和活性蛋白。<3-3>所獲得完整序列的分析所獲得的完整片段全長(zhǎng)2354bp，含有一個(gè)通過(guò)ORF査找程序在VectorNTI中發(fā)現(xiàn)的1326bp的開放閱讀框(SEQIDNO.2)。該閱讀框編碼了一段信號(hào)肽和一個(gè)成熟蛋白，通過(guò)SignalP程序[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]和多序列比對(duì)，確定信號(hào)肽N端的可能的切割位點(diǎn)為Ser23-Ala2。該關(guān)于成熟活性蛋白的N端位置的數(shù)據(jù)對(duì)于蛋白質(zhì)在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)是必要的。利用PeptideMass程序[http:Vcn.expasy.org/tools/peptide-masshtml]確定了成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的預(yù)測(cè)分子量為45.5kDa，它和SDS-PAGE的結(jié)果(圖l)基本一樣。通過(guò)VectorNT預(yù)測(cè)該成熟蛋白的理論等電點(diǎn)約為7.7。在NCBI的GenBank中利用BLAST服務(wù)器[http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]進(jìn)行相似性分析。結(jié)果表明ORF的氨基酸序列(SEQIDNO.3)顯示與變形肥桿菌(C^^,6fl"m^m;rafe^)的已知植酸酶的低一致性(54%),并且具有與大腸桿菌植酸酶的低一致性(45%)。因此可以確定這個(gè)來(lái)源于耶爾森氏菌的開放閱讀框編碼了一個(gè)新的植酸酶。和其他植酸酶一樣，該開放閱讀框的氨基酸序列被命名為AppA。盡管與來(lái)源于中間型耶爾森菌ATCC29909的一個(gè)假定蛋白具有較高的一致性，但是該假定蛋白是通過(guò)自動(dòng)的計(jì)算機(jī)分析而由注釋基因組序列(NZAALF01000052)推測(cè)獲得的，沒有驗(yàn)證酶活性或任何關(guān)于生理或化學(xué)特性的信息。實(shí)施例4:植酸酶AppA在畢赤酵母中的表達(dá)<4-1>表達(dá)載體的構(gòu)建為了獲得成熟蛋白的編碼區(qū)，設(shè)計(jì)合成了引物，yermF:5，-GCGGAATTCGCCGCGCCGGTTGCCATA-3，(27mer)，禾口yermR:5，-GTAGCGGCCGCTTAAATATGGCAAGCAGGTTC-3'(32mer)。利用引物yermF和yermR，成熟蛋白的編碼區(qū)被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下預(yù)計(jì)大小的條帶，并用TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒提取DNA。如廠商說(shuō)明所述，純化的DNA插入表達(dá)載體pPIC9(Invitrogen，SanDiego，Calif.)的EcoRI禾卩Notl酶切位點(diǎn)處。構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化至涂覆于含100ugamp/mL的LB培養(yǎng)基上的JM109細(xì)胞內(nèi)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子被測(cè)序，并生長(zhǎng)用于酵母轉(zhuǎn)化的DNA的制備。<4-2>轉(zhuǎn)化酵母及表達(dá)根據(jù)廠商說(shuō)明，用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen)，并準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化。使用Z)ral線性化約8ug的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9DNA然后通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于RDB培養(yǎng)基上，以篩選///S4基因整合到宿主染色體DNA中。含有轉(zhuǎn)化的HIS4基因的轉(zhuǎn)化子才能在RDB平板上生長(zhǎng)。在RDB平板上培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)化子在含甘油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BMGY培養(yǎng)基)上培養(yǎng)48小時(shí)，然后旋轉(zhuǎn)(2500g,5分鐘)收集細(xì)胞，并在0.5%甲醇培養(yǎng)基(BMMY)中懸浮，以誘導(dǎo)植酸酶表達(dá)。<4-3>轉(zhuǎn)化子植酸酶活性的檢測(cè)通過(guò)硫酸亞鐵鉬藍(lán)法分析了總共72個(gè)轉(zhuǎn)化子的植酸酶活性。其測(cè)定過(guò)程如下在950UL的底物溶液(4mM的植酸鈉，溶解在0.25M的乙酸鈉緩沖液中，pH為5.0)被加至50uL稀釋的酶溶液中，并混合均勻，在37C反應(yīng)30分鐘。接著向以上反應(yīng)體系中加入1mL10。/。的TCA(三氯乙酸)，終止反應(yīng)。作為對(duì)照，在酶液中先加入lmL10。/。的TCA，使酶蛋白失活，接著在加入底物溶液，37i:放置30分鐘。反應(yīng)終止后，再加入2mL的顯色液(0.576M的硫酸，1%的鉬酸銨，7.32%的七個(gè)結(jié)晶水硫酸亞鐵)，放置10分鐘。在700nm下檢測(cè)吸光值，并測(cè)定酶溶液和對(duì)照的活性。一個(gè)酶活單位指37'C時(shí)，1分鐘釋放luM無(wú)機(jī)磷所需的酶蛋白的量。經(jīng)過(guò)兩天的甲醇誘導(dǎo)后，72個(gè)轉(zhuǎn)化子中有11轉(zhuǎn)化子被檢測(cè)到植酸酶活性，酶活單位范圍約在48-270U/mL之間。明顯地，以上所獲得的開放閱讀框?yàn)橐粋€(gè)新的有功能的植酸酶基因，其編碼具有植酸酶活性的蛋白。這個(gè)由以上開放閱讀框的成熟區(qū)域編碼的具植酸酶活性的多肽被命名為r-AppA。實(shí)施例5:重組植酸酶r-AppA的純化為了純化酵母表達(dá)的重組植酸酶r-AppA，上清液酶活為270U/mL的轉(zhuǎn)化子在較優(yōu)的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)兩天的甲醇誘導(dǎo)之后，利用與實(shí)施例4所述相同的方法檢測(cè)植酸酶活性，上清液的酶活達(dá)到389U/mL。經(jīng)過(guò)12000g離心10分鐘，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌體被去除。硫酸銨粉末被加入到上清液中，到達(dá)80%的飽和度，然后以12000g離心10分鐘收集沉淀。沉淀用0.1M，pH5.0的乙酸鈉緩沖液溶解，以12000g離心10分鐘。然后，獲得上清液，并使用相同的緩沖液進(jìn)行透析。接下來(lái)，使用具有10kDa截留濾器的的超濾裝置濃縮所得滲析液。最后，濃縮液通過(guò)SephacrylS-200(PharmaciaBiotech)進(jìn)行分離純化。最后，用相同緩沖液通過(guò)SephacrylS-200純化植酸酶。實(shí)施例6:重組植酸酶r-AppA酶學(xué)性質(zhì)分析<6-1>重組植酸酶r-AppA分子量的確定以及脫糖基處理純化的重組植酸酶r-AppA分子量通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行測(cè)定。電泳結(jié)果圖1:泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量;泳道2為純化的重組植酸酶r-AppA;泳道3為脫糖基的r-AppA。根據(jù)電泳檢測(cè)的結(jié)果，純化的r-AppA被證實(shí)其分子量約為45kDa。通過(guò)NetNglyc(預(yù)測(cè)N糖基化位點(diǎn)的程序)程序，預(yù)測(cè)了r-AppA的蛋白質(zhì)序列。該蛋白沒有潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser/Thr)。因?yàn)榧兓拿负徒?jīng)脫糖基化的酶的分子量一樣，所以同樣的結(jié)果在圖1中也能看到。<6-2>重組植酸酶r-AppA的溫度和pH特性在不同的溫度和pH條件下，研究經(jīng)SephacrylS-200純化的重組植酸酶r-AppA的酶活性。利用以下緩沖液確定pH值對(duì)植酸酶的影響甘氨酸-鹽酸pH1.5-3.5;乙酸鈉-乙酸pH3.5-6.0;Tris-鹽酸pH6.0-8.5;和甘氨酸-氫氧化鈉pH8.5-10。所有用于稀釋的緩沖液都含有0.05%BSA和0.05%Triton。如圖2所示，植酸酶的活性隨pH值的變化而變化。重組酶的最適pH為4.5，在pH2.5時(shí)仍有70%的酶活性，在pH5.5時(shí)仍有65%的酶活性。明顯地，現(xiàn)有植酸酶相比，重組的植酸酶r-APPA在18pH2.0-6.0的適宜范圍內(nèi)有更高的酶活性。圖2顯示了該酶具有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)該酶放置在37°C，pH2.5-10.0處理2小時(shí)后，仍有超過(guò)85%的酶活性存在。在pH1.0-2.0處理后也有超過(guò)70%的活性保留。圖3A顯示了酶活性隨溫度的變化關(guān)系。在最適pH4.5下測(cè)定了2(TC到8(TC范圍內(nèi)的酶活性，結(jié)果表明最適溫為55'C。如圖3B所示，酶液在80'C處理10分鐘時(shí)，仍保留超50%的酶活性，在8(TC處理1小時(shí)，仍保留40%的酶活性。與在飼料工業(yè)中被廣泛用作飼料添加劑的大腸桿菌植酸酶相比，r-AppA在高溫下具有更好的熱穩(wěn)定性。根據(jù)對(duì)r-AppA的溫度和pH測(cè)試，以及與其他常規(guī)的植酸酶相比，本發(fā)明的植酸酶r-APPA被認(rèn)為是非常適于單胃動(dòng)物的飼料添加劑。因?yàn)榕c常規(guī)使用的植酸酶相比，本發(fā)明提供的植酸酶具有寬的pH穩(wěn)定性和高溫穩(wěn)定性，所以該植酸酶，r-APPA具有非常好的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的應(yīng)用潛力。<6-3>金屬離子及抑制劑對(duì)重組植酸酶r-AppA活性的影響金屬離子及抑制劑對(duì)重組植酸酶r-AppA活性的影響在最適pH(pH4.5)下進(jìn)行。如表4所示，在各種金屬離子中，酶活受濃度為lmM的許多金屬離子的抑制較弱，F(xiàn)e",Zn"和Cuh明顯抑制酶活性。Mn"對(duì)酶活性有弱的增強(qiáng)作用。作為抑制劑，SDS對(duì)酶活性有強(qiáng)的抑制作用，但是EDTA對(duì)酶活性基本沒有影響。表4金屬離子及抑制劑對(duì)重組植酸酶活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><6-4>蛋白酶對(duì)重組植酸酶r-AppA活性的影響為了確定蛋白酶抗性，純化的重組酶(0.025mg/ml)與O.lmg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶在37'C孵育。然后，分別在5、10、20、30、60、禾ni20分鐘時(shí)取樣。如圖4所示，該重組植酸酶r-AppA對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很強(qiáng)的抗性。該植酸酶顯示高于任何其它曾報(bào)道的植酸酶的蛋白酶抗性。結(jié)果暗示該植酸酶因其對(duì)胃腸中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抗性，從而可以提高植酸酶在單胃動(dòng)物體內(nèi)的水解效率。<6-5>重組植酸酶r-AppA比活的測(cè)定為了確定該植酸酶r-AppA的比活，首先通過(guò)Lowry方法確定了通過(guò)SephacrylS-200純化的重組酶r-AppA的酶蛋白的濃度。并且在pH4.5的條件下，通過(guò)硫酸亞鐵鉬藍(lán)法確定重組酶r-AppA的酶活。結(jié)果，該重組植酸酶r-AppA的比活為3960±248U/mg，這是至今報(bào)道的比活最高的植酸酶。工業(yè)應(yīng)用根據(jù)以上所述，本發(fā)明的新的植酸酶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)高比活，合適的作用pH，良好的熱穩(wěn)定性，強(qiáng)的蛋白酶抗性，容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點(diǎn)都意味著該植酸酶作為詞料添加劑，比以前所報(bào)道的植酸酶將會(huì)更有應(yīng)用價(jià)值。第一，高比活意味著生產(chǎn)同樣量的酶蛋白，可以降解更多的植酸。即降解同樣量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也將更低。第二，合適的作用pH意味著該植酸酶可以更好的在動(dòng)物腸道內(nèi)發(fā)揮作用。第三，良好的熱穩(wěn)定性意味著該酶在制粒加工的過(guò)程中不容易失活。第四，強(qiáng)的蛋白酶抗性意味著該植酸酶在動(dòng)物腸道內(nèi)可以穩(wěn)定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易發(fā)酵生產(chǎn)說(shuō)明，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的工業(yè)發(fā)酵大量生產(chǎn)該植酸酶，并用于飼料行業(yè)?；谝陨蟽?yōu)良特性，任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都知道，本發(fā)明所提供的植酸酶作為飼料添加劑將發(fā)揮重要的作用。這一新的分離于J^^'m》/"^7^^a的植酸酶已經(jīng)克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，因此有著極大的商業(yè)價(jià)值。參考文獻(xiàn)EGraf,KLEmpsonandJWEaton.Phyticacid.Anaturalantioxidant.J.Biol.Chem.，Vol.262，Issue24,11647-11650，Aug,1987CromwellGL，StahlyTS，CoffeyRD,MonegueHJ，RandolphJH.Efficacyofphytaseinimprovingthebioavailabilityofphosphorusinsoybeanmealandcorn-soybeanmealdietsforpigs.JAnimSci.1993Jul;71(7):1831-40.KomegayET,QianH.Replacementofinorganicphosphorusbymicrobialphytaseforyoungpigsfedonamaize-soyabean-mealdiet.BrJNutr.1996Oct;76(4):563-78.GreinerR,HallerE，KonietznyU,JanyKD.Purificationandcharacterizationofaphytasefrom^/e6w'e〃aArchBiochemBiophys.1997May15;341(2):201-6.KimY.-O.;KimH,K.;BaeK,S.;YuJ.-H.;OhT,K.Purificationandpropertiesofathermostablephytasefrom5a"7/wssp.DS11.EnzymeMicrobTechnol,1998Jan,22(l),.2-7KimHW,KimYO，LeeJH,KimKK,KimYJ.IsolationandcharacterizationofaphytasewithimprovedpropertiesfromC"ra6a"er6raflfo7.Biotechno1Lett.2003Aug;25(15):1231-4.ZininNV,SerkinaAV,GelfandMS,ShevelevAB,SineokySP.Genecloning,expressionandcharacterizationofnovelphytasefrom06esww6acfen.wm;rofei^.FEMSMicrobiolLett.2004Jul15;236(2):283-90.Chenetal,Improvingthermostabilityof爿5pergz7/wsm.gerphytasebyelongationmutation.ChineseJournalofBiotechnology,November2005;21(6):983-987.21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>權(quán)利要求1、一種分離的具有如下特征的植酸酶蛋白a)理論分子量45.5kDa；b)最適pH在4-5之間；c)最適溫度在50-60℃之間；d)理論pI值為7.2；e)比活在3000U/mg以上；且f)對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶具有高抗性。2、一種分離的蛋白，其選自a)包含SEQIDNO.3所示氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDN0.2所示的多核苷酸或其簡(jiǎn)并序列所編碼的多肽；c)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO.2所示多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的具有植酸酶活性的多肽；d)由SEQIDNO.2所示多核苷酸的等位基因或天然突變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；或e)由SEQIDNO.3所示的多肽序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的具有植酸酶活性的多肽；或f)與SEQIDNO.2所示氨基酸具有至少60%，優(yōu)選65%，70%，75%，80%，85%，或至少90%，特別優(yōu)選95%—致性的具有植酸酶活性的多肽。3、如權(quán)利要求1或2所述的蛋白，其來(lái)自耶爾森氏菌屬微生物，優(yōu)選中間型耶爾森氏菌。4、一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的蛋白。5、一種DNA構(gòu)建體或重組載體，其含有如權(quán)利要求4中所述的核酸分子。6、一種宿主細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求5中所述的DNA構(gòu)建體或重組載體，或已整合至其基因組內(nèi)的如權(quán)利要求4中所述的核酸分子。7、如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其為真核生物細(xì)胞。8、如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母細(xì)胞。9、中間型耶爾森氏菌H-27，其保藏號(hào)為CGMCC1702。10、一種產(chǎn)生植酸酶的方法，包括在適于植酸酶表達(dá)的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。11、一種飼料添加劑，其含有選自如下的有效成分a)如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的蛋白；和減b)如權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。12、如權(quán)利要求ll所述的詞料添加劑，其還含有一種或多種選自包含以下組分的酶制品角蛋白酶、脂解酶、淀粉酶、磷酸酶、麥芽糖酶、轉(zhuǎn)化酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶的。13、如權(quán)利要求l至3中任一項(xiàng)所述的多肽/或如權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在制備詞料添加劑中的用途。14、一種從靶生物體中分離植酸酶基因的新方法，包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物；b)利用所述引物通過(guò)PCR擴(kuò)增部分植酸酶序列；和c)進(jìn)一步通過(guò)TAIL-PCR獲取植酸酶的全序列。15、如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的簡(jiǎn)并引物對(duì)如SEQIDNO.4和5所示。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的植酸酶、編碼這個(gè)酶的基因以及具有植酸酶活性的新中間型耶爾森氏菌。具體地，本發(fā)明涉及具有以下性質(zhì)的植酸酶(a)理論分子量為45.5kDa，(b)高比活為3960±248U/mg，(c)高溫下的良好熱穩(wěn)定性和寬的pH作用范圍，(d)最適pH為4.0-5.0，(e)最適溫度50-60℃，(f)強(qiáng)的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。此植酸酶非常適合作為添加劑在單胃動(dòng)物中使用。本發(fā)明也涉及含有所述基因的重組載體，含有所述重組載體的重組宿主細(xì)胞(例如，巴斯德畢赤酵母)，以及使用所述重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)植酸酶的方法。而且，本發(fā)明還涉及包含所述植酸酶和/或表達(dá)作為有效成分的植酸酶的宿主細(xì)胞的飼料添加劑。此外，本發(fā)明還提供了一種全新的從靶生物體中分離植酸酶基因的方法。文檔編號(hào)C12N15/55GK101426907SQ200680054340公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2006年4月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日發(fā)明者史秀云,斌姚,昆孟,楊培龍,柏映國(guó),王亞茹,羅會(huì)穎,袁鐵錚,黃火清申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所