一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體，通過(guò)將雙HA標(biāo)簽序列片段與具有Gateway閱讀框B片段的載體pART27-35Sa-GWB連接得到并在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建方法所得表達(dá)載體可以用于克隆的目的基因或其他來(lái)源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表達(dá)，其方法具有快速、靈活、高效、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)，在基因功能研究方面有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]Gateway技術(shù)是由Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的進(jìn)行基因克隆的一項(xiàng)新技術(shù),是一種快速、高效的大規(guī)模克隆系統(tǒng)，與傳統(tǒng)方法相比，對(duì)載體和宿主沒(méi)有依賴性。
[0003]Gateway技術(shù)原理是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子(INF、Int)的作用下，lambda噬菌體的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn):attL和attR。Gateway技術(shù)可以方便快捷地克隆一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)入到任何蛋白表達(dá)系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)載體構(gòu)建過(guò)程中需進(jìn)行的多次酶切和連接反應(yīng)的繁瑣操作步驟及酶切位點(diǎn)的限制等缺點(diǎn)，同時(shí)典型的克隆效率高達(dá)90%或更高。當(dāng)基因在目的表達(dá)載體之間快速簡(jiǎn)便的穿梭時(shí)，還可以保證正確的方向和閱讀框。
[0004]Gateway技術(shù)主要包括2個(gè)反應(yīng)(參考附圖1) =BP反應(yīng)和LR反應(yīng)。BP反應(yīng)是創(chuàng)建入門(mén)克隆，通過(guò)PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將兩端攜帶attB位點(diǎn)的目的基因克隆進(jìn)入門(mén)載體。LR反應(yīng)是將包含目的基因的入門(mén)克隆和合適的目的載體進(jìn)行重組，構(gòu)建表達(dá)克隆。入門(mén)載體目的基因兩端具有attLl和attL2重組位點(diǎn)，目的載體上具有attRl和attR2重組位點(diǎn)，在LR Clonase II的作用下，兩個(gè)載體間發(fā)生定向重組，從而將目的基因連接到目的載體上。另外，Gateway重組技術(shù)利用了 ccdB致死基因。ccdB蛋白干擾大腸桿菌DNA促旋酶，抑制大腸桿菌大部分菌株的生長(zhǎng)(例如DH5 α和TOPlO菌株)。由于ccdB蛋白的致死作用，只有攜帶重組成功的目的載體的克隆才能生長(zhǎng)，而入門(mén)載體或未重組的目的載體克隆由于帶有ccdB致死基因而不能生長(zhǎng)，極大地降低了高背景的缺點(diǎn)，減少篩選時(shí)間。同時(shí)，結(jié)合抗生素篩選，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物重組率可高達(dá)90%以上。目前該技術(shù)已廣泛用于基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0005]與Gateway技術(shù)兼容載體系統(tǒng)已開(kāi)始應(yīng)用于植物功能基因組的研究,但應(yīng)用這些載體系統(tǒng)的一個(gè)瓶頸問(wèn)題是如何簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和高效地將PCR產(chǎn)物或其他來(lái)源的目的DNA片段構(gòu)建到入門(mén)載體上獲得入門(mén)克隆。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體，其構(gòu)建方法將傳統(tǒng)的TA克隆技術(shù)與Gateway重組克隆技術(shù)進(jìn)行整合,構(gòu)建了與Gateway技術(shù)兼容的目的克隆表達(dá)載體，用于克隆的目的基因或其他來(lái)源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表達(dá)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]—種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體的構(gòu)建方法,構(gòu)建方法包括下述步驟:
[0009]I)使用限制性內(nèi)切酶Not I分別酶切pART7載體質(zhì)粒DNA和pART27雙元載體質(zhì)粒DNA，將pART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段插入到pART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA ;將該pART27_35Sa載體質(zhì)粒DNA通過(guò)限制性內(nèi)切酶Sma I進(jìn)行酶切，插入Gateway閱讀框B片段，得到表達(dá)載體pART27-35Sa_GWB ；
[0010]其中，PART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段按照花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合成酶基因3非編碼區(qū)與報(bào)告基因NPTII方向相同的順序插入到PART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體。
[0011]2)使用引物從表達(dá)載體PART7-DHA中擴(kuò)增出90bp的雙HA標(biāo)簽序列片段:5_AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3 ；
[0012]通過(guò)引入上述標(biāo)簽序列可有效用于蛋白表達(dá)分析。
[0013]上述所得的雙HA標(biāo)簽序列片段，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為KLGGTGGSYPYDVPHYAGYPYDVPDYA-SR，其中HA抗原(YPYDVPDYA)的串聯(lián)重復(fù)前放置有隨機(jī)線圈序列(GGTGGS)。
[0014]其中，所用的特定引物序列如下:
[0015]PRl:
[0016]5-ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA-3 ；
[0017]PR2:
[0018]5-ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3。
[0019]3)將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用HindIII和Xba I進(jìn)行雙酶切后連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)和篩選，從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，獲得用于Gateway克隆的表達(dá)載體pART27-35Sa-GWB_DHA。
[0020]相應(yīng)的，本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于Gateway克隆的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，如上所述。
[0021]通過(guò)上述方法，本發(fā)明得以得到一種用于Gateway克隆表達(dá)載體，該載體可作為Gateway克隆過(guò)程中的入門(mén)載體，該方法具有快速、靈活、高效、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)，可用于多種基因功能研究和蛋白表達(dá)分析。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為Gateway克隆技術(shù)的流程示意圖；
[0023]圖2a、2b、2c、2d、2e、2f分別本發(fā)明表達(dá)載體的構(gòu)建方法各流程階段生成的質(zhì)粒或所插入的序列，依次為PART7載體質(zhì)粒、pART27雙元載體質(zhì)粒、pART27_35Sa載體質(zhì)粒、Gateway轉(zhuǎn)換盒閱讀框B、pART27-35Sa_GWB載體、雙HA標(biāo)簽序列片段、pART27-35Sa-GWB-DHA 表達(dá)載體。

【具體實(shí)施方式】
[0024]在下述實(shí)施例中，所用質(zhì)粒和酶均可從生物制劑公司購(gòu)買(mǎi)，GatewayKit可從Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)。
[0025]參考圖2a_2f，本發(fā)明通過(guò)該過(guò)程獲得Gateway克隆表達(dá)載體:
[0026]1.將50-100叩的？六町7載體質(zhì)粒0嫩與0.5-14 1^限制性內(nèi)切酶吣七I混合，37°C保溫2h進(jìn)行酶切，獲得一個(gè)表達(dá)片段。
[0027]2.把50-100ng雙元載體pART27質(zhì)粒DNA用0.5-1 μ L限制性內(nèi)切酶Not I酶切，將上述步驟I所得片段插入到酶切后的PART27中，構(gòu)建pART27-35Sa，在該載體中，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合成酶基因3'非編碼區(qū)與報(bào)告基因NPT II的方向相同。
[0028]3.將 50-100ng 的 pART27_35Sa 質(zhì)粒 DNA 與 0.5-1 μ L 限制性內(nèi)切酶 Sma I 混合，37°C保溫2h進(jìn)行酶切。
[0029]4.把Gateway轉(zhuǎn)換盒的閱讀框B插入到酶切后的pART27_35Sa，獲得表達(dá)載體pART27-35Sa-GWB。
[0030]5.以
[0031]PRl:5 ' -ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA_3 ；
[0032]PR2:5 ' -ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3為引物，從表達(dá)載體PART7-DHA中擴(kuò)增得到I個(gè)90bp雙HA (Double HA)標(biāo)簽序列片段，如下所示:
[0033]5-AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3。
[0034]6.將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用HindIII和Xba I進(jìn)行雙酶切，純化后的DNA由T4連接酶連接。
[0035]7.上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl，在含20 μ g / mL卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。
[0036]8.通過(guò)BamH I酶切和pART7R04引物測(cè)序確定，獲得適用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體 pART27-35Sa-GWB-DHA。
【權(quán)利要求】
1.一種用于Gateway克隆系統(tǒng)的表達(dá)載體，其特征在于其構(gòu)建方法包括下述步驟: 1)使用限制性內(nèi)切酶NotI分別酶切pART7載體質(zhì)粒DNA和pART27雙元載體質(zhì)粒DNA，將pART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段插入到pART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA ;將該pART27_35Sa載體質(zhì)粒DNA通過(guò)限制性內(nèi)切酶Sma I進(jìn)行酶切，插入Gateway閱讀框B片段，得到表達(dá)載體pART27-35Sa_GWB ； 2)使用引物從表達(dá)載體PART7-DHA中擴(kuò)增出90bp的雙HA標(biāo)簽序列片段:5_AAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTTGATCTAGA-3 ； 3)將雙HA片段和pART27-35Sa-GWB分別用Hindlll和XbaI進(jìn)行雙酶切后連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)和篩選，從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和測(cè)序，獲得用于Gateway 克隆的表達(dá)載體 pART27-35Sa-GWB_DHA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述步驟1)的將PART7載體質(zhì)粒DNA酶切片段按照花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合成酶基因3非編碼區(qū)與報(bào)告基因NPTII方向相同的順序插入到PART27雙元載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到pART27_35Sa載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述步驟1)的把Gateway閱讀框B片段插入到pART27-35Sa載體質(zhì)粒DNA酶切片段中，得到表達(dá)載體pART27_35Sa_GWB。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述步驟2)的引物序列為
PR1:
5-ATAAGCTTGGAGGTACTGGAGGATCCTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGTTA-3 ；
PR2:
5-ATTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGGTAACCAGCGTAGTCTGGAACGT-3。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104250653SQ201410098146
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】高俊山, 吳楠, 巫飛飛, 孟艷, 蔡永萍, 林毅 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)