專利名稱：一種枯草桿菌克隆載體及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草桿菌克隆載體及其構(gòu)建，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
已有的枯草桿菌克隆載體，大部分沒有重組體篩選標記，少部分雖有篩選標記，但只能通過間接篩選才能區(qū)分重組體和非重組體。有人曾為枯草桿菌引入類似大腸桿菌的LacZ指示基因的外源指示基因，旨在構(gòu)建具有重組體篩選標記的枯草桿菌克隆載體，結(jié)果因異源基因不易表達或不穩(wěn)定而未能達到預(yù)期的目的。
本發(fā)明的目的是提供一種利用枯草桿菌自身(內(nèi)源)的指示基因構(gòu)建成的、具有重組體篩選標記的枯草桿菌克隆載體。本發(fā)明的另一個目的是提供構(gòu)建該枯草桿菌克隆載體的方法。
圖1為枯草桿菌中性蛋白酶基因(nprE)結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為啟動子(promoter)，箭頭方向表示轉(zhuǎn)錄方向自左至右;2為前肽區(qū)域(pro-peptide);3為EcoRI切點;4為成熟酶區(qū)域(matureenzyme);5為信號肽區(qū)域(signalpeptide)。圖2為在前肽區(qū)域2中去除MstⅠ-HindⅢ片段的示意圖，其中6為MstⅠ切點;7為HindⅢ切點;8為MstⅠ-HindⅢ片段。圖3為在前肽區(qū)域2中插入帶有多克隆位點(multiplecloningsites，MCS)的DNA片段的示意圖，其中9為帶有多克隆位點的DNA片段(36bp)，內(nèi)含切點B(BamHⅠ)、X(XbaⅠ)、S(SalⅠ)、P(pstⅠ)、Sp(SphⅠ)和H(HindⅢ)。
現(xiàn)結(jié)合


本發(fā)明的內(nèi)容。
枯草桿菌有一種外分泌蛋白酶叫中性蛋白酶(NprE)，其基因(nprE)由三部分組成信號肽區(qū)域5，前肽區(qū)域2和成熟酶區(qū)域4，見圖1。中性蛋白酶基因是枯草桿菌自身(內(nèi)源)的指示基因，可作重組體篩選標記。中性蛋白酶基因的前肽區(qū)域2具有可縮性(flexibility)，即在該區(qū)域內(nèi)作人為修飾，去除部分前肽區(qū)域2或在前肽區(qū)域2中插入帶有多克隆位點的DNA片段，中性蛋白酶的活性不會遭到破壞。本發(fā)明就是利用枯草桿菌中性蛋白酶基因作指示基因和前肽區(qū)域2具有可縮性作出的。
圖3示出了本發(fā)明產(chǎn)品，枯草桿菌克隆載體的結(jié)構(gòu)。與中性蛋白酶基因的結(jié)構(gòu)相比，其前肽區(qū)域2中插入一段含切點B、X、S、P、Sp和H的多克隆位點的DNA片段(36bp)9，其余部分與中性蛋白酶基因的結(jié)構(gòu)完全相同，見圖1和圖3。本枯草桿菌克隆載體命名為pNC3。
本枯草桿菌克隆載體pNC，的構(gòu)建方法包括(1)把含有中性蛋白酶基因的質(zhì)粒DNA與限制性內(nèi)切酶MstⅠ混和，在37℃的條件下，保溫45～90分鐘，使其徹底酶解，再在65℃的條件下，保溫10～15分鐘，使酶解反應(yīng)中止;
(2)往(1)步驟產(chǎn)物里加入Bam HⅠ連接子(Linker)和T4連接酶，把MstⅠ切點6轉(zhuǎn)換成單一的Bam HⅠ切點;
(3)往(2)步驟產(chǎn)物里加入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ，反應(yīng)在37℃的條件下進行，使連接物徹底酶解;
(4)用凝膠電泳法去除中性蛋白酶基因的前肽區(qū)域2上的MstⅠ-HindⅢ片段8，分離純化帶有中性蛋白酶前肽順序的大片段;
(5)用Bam HⅠ和HindⅢ同時消化pUC1，質(zhì)粒DNA，使其釋放含有Ba HⅠ、X baⅠ、SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ和HindⅢ多克隆位點的DNA片段(36pb)9;
(6)把(4)步驟和(5)步驟的產(chǎn)物按1∶10的比例混和，加入T4連接酶，使帶有多克隆位點的DNA片段(36bp)9連接到中性蛋白酶基因的前肽區(qū)域2的Bam HⅠ-HindⅢ位點上;
(7)用(6)步驟的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草桿菌(如DB403)，在含有卡那霉素(5微克/毫升)和1%脫脂奶粉的營養(yǎng)平板上篩選出重組轉(zhuǎn)化子，即得到本枯草桿菌克隆載體pNC3。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點1。用本發(fā)明構(gòu)建的枯草桿菌克隆載體pNC3來克隆外源基因，能直接篩選出重組體，這是迄今為止已有的枯草桿菌克隆載體所做不到的。
2。利用中性蛋白酶基因作指示基因，有易于檢測(一般半定量測定只要在培養(yǎng)基中加入0。5～1%的脫脂奶粉)和蛋白酶的底物成本低(比β-gal的底物X-gal及所需誘導(dǎo)物IPIG的成本至少低幾百倍)的優(yōu)點。
3。由于中性蛋白酶為外分泌蛋白酶，所以本枯草桿菌克隆載體pNC，特別適用于研究生物工程中的蛋白質(zhì)分泌機制。
本枯草桿菌克隆載體pNC3可用于枯草桿菌基因工程基礎(chǔ)研究，可作表達載體，表達融合型真核生物基因產(chǎn)物，可作分泌載體，以獲得單一的基因產(chǎn)物，此外，還可用于篩選“蛋白質(zhì)分泌衰減順序”，研究蛋白質(zhì)分泌機制，是一種應(yīng)用前景極為寬廣的分子生物學(xué)研究工具。
權(quán)利要求
1.一種枯草桿菌克隆載體，由信號肽區(qū)域5、前肽區(qū)域2和成熟酶區(qū)域4構(gòu)成，其特征在于，其前肽區(qū)域2內(nèi)插入含切點B、X、S、P、Sp和H多克隆位點的DNA片段(36bp)9，是一種利用枯草桿菌自身(內(nèi)源的指示基因構(gòu)建而成的、具有重組體篩選標記的枯草桿菌克隆載體。
2.按權(quán)利要求1所述的枯草桿菌克隆載體，其特征在于，其構(gòu)建方法包括(1)把含有中性蛋白酶基因的質(zhì)粒DNA與限制性內(nèi)切酶MstⅠ混和，在37℃的條件下，保溫45～90分鐘，使其徹底酶解，再在65℃的條件下，保溫10～15分鐘，使酶解反應(yīng)中止;(2)往(1)步驟產(chǎn)物里加入Bam HⅠ連接子(Linker)和T4連接酶，把MstⅠ切點6轉(zhuǎn)換成單一的Bam HⅠ切點;(3)往(2)步驟產(chǎn)物里加入限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Hind Ⅲ。反應(yīng)在37℃的條件下進行，使連接物徹底酶解;(4)用凝膠電泳法去除中性蛋白酶基因的前肽區(qū)域2上的MstⅠ-HindⅢ片段8，分離純化帶有中性蛋白酶前肽順序的大片段;(5)用Bam HⅠ和HindⅢ同時消化pUC1，質(zhì)粒DNA，使其釋放含有Ba HⅠ、X baⅠ、SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ和HindⅢ多克隆位點的DNA片段(36pb)9;(6)把(4)步驟和(5)步驟的產(chǎn)物按1∶10的比例混和，加入T4連接酶，使帶有多克隆位點的DNA片段(36bp)9連接到中性蛋白酶基因的前肽區(qū)域2的BamHⅠ-HindⅢ位點上;(7)用(6)步驟的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草桿菌(如DB403)，在含有卡那霉素(5微克/毫升)和1%脫脂奶粉的營養(yǎng)平板上篩選出重組轉(zhuǎn)化子，即得到本枯草桿菌克隆載體pNC3。
全文摘要
一種枯草桿菌克隆載體pNC
文檔編號C12N15/74GK1068853SQ9110745
公開日1993年2月10日 申請日期1991年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月19日
發(fā)明者吳自榮, 戚蓓靜, 王林發(fā) 申請人:華東師范大學(xué)