專利名稱：：獲自畢赤酵母的自動誘導(dǎo)型磷酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運體啟動子和利用該啟動子制造重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲自畢赤酵母(Pichiapastoris)的自動誘導(dǎo)型NPS啟動子和利用所述啟動子制造重組蛋白的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及獲自畢赤酵母的自動誘導(dǎo)型NPS啟動子；攜帶所述啟動子和核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述序列與所述啟動子可操作地連接并編碼重組蛋白；轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；以及制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述蛋白。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)合成是開始于轉(zhuǎn)錄的多步過程，其中，由DNA編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)移至mRNA模板。轉(zhuǎn)錄開始于起始過程。RNA聚合酶與DNA的稱為啟動子的特定區(qū)域相結(jié)合，所述啟動子通常位于待轉(zhuǎn)錄的基因的上游。許多啟動子(但并非所有的啟動子)含有共同(保守)序列，這樣的序列稱為共有序列。在原核細(xì)胞中，啟動子由位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-10位點和-35位點的兩段短序列構(gòu)成。在-10位點的序列通常由六個核苷酸"TATAAT"(TATA盒)構(gòu)成。在-35位點的另一序列通常由六個核苷酸TTGACA構(gòu)成。大多數(shù)啟動子相互之間的區(qū)別在于實際堿基序列以及離所述共有序列的轉(zhuǎn)錄起始位點的距離。這種變異性據(jù)信會導(dǎo)致啟動子起始轉(zhuǎn)錄的不同頻率，即啟動強度。因此啟動子是決定蛋白質(zhì)制造效率的重要因素之一，并且目前正為在各種微生物中開發(fā)出強的且具有特異性的啟動子而進(jìn)行廣泛的研究。畢赤酵母，一種甲基營養(yǎng)型酵母，正成為甲醇代謝和過氧化物酶體生成的研究中有用的重要生物模型，并且是優(yōu)于作為傳統(tǒng)酵母的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的蛋白制造宿主系統(tǒng)。此外，受益于其特征性代謝和生理活性，畢赤酵母被公認(rèn)是一種有用的工業(yè)資源，其可用于環(huán)境友好的生物過程中。畢赤酵母氧化甲醇經(jīng)過甲醛和甲酸至二氧化碳。這些反應(yīng)分別由醇氧化酶(AOX)、甲醛脫氫酶(FLD)和甲酸脫氫酶(FMDH)催化。畢赤酵母有兩個醇氧化酶基因(A0X1和AOX2)，這兩個基因有各自的誘導(dǎo)型啟動子。受益于其高活性，所述AOXl啟動子通常用以在酵母中表達(dá)重組蛋白，而已知所述AOX2啟動子(美國專利號5,032，516)表現(xiàn)出相對較弱的活性(J.Tschopp等，NucleicAcidsRes.1987，第15巻，第3859-3876頁)。此外，已研發(fā)出FLD基因啟動子(D.Resina等，JournalofBiotechnology,2004，第109巻，第103-113頁)。對于畢赤酵母也已研發(fā)出甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子，該啟動子已知為在各種微生物中的強組成型啟動子(Waterham等，Gene,1997，第186巻，第37-44頁)。通過畢赤酵母制造重組蛋白中最常用的是參與甲醇代謝并由甲醇強烈誘導(dǎo)的啟動子。當(dāng)使用參與甲醇代謝的基因的啟動子時，必須小心謹(jǐn)慎以避免火災(zāi)，這是因為轉(zhuǎn)錄需要甲醇這種高度易燃的燃料。在此情況下，生產(chǎn)設(shè)施必須包括特殊設(shè)備并要求仔細(xì)的檢査。此外，采用GAP啟動子時，難以控制蛋白表達(dá)的效率。當(dāng)對所述細(xì)胞的生長有副作用時，其他組成型啟動子由于會導(dǎo)致細(xì)胞不穩(wěn)定，因此也難以使用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模制造中。因此，需要這樣的強啟動子，即該啟動子經(jīng)誘導(dǎo)可足以調(diào)控重組蛋白在適于大規(guī)模制造的所需時間點的表達(dá)或足以調(diào)控蛋白的過表達(dá)，并且其誘導(dǎo)所需的誘導(dǎo)物或者不受該過程的影響，或者根本不需要誘導(dǎo)物。
發(fā)明內(nèi)容為實現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明人經(jīng)過深入而全面的研究，建立了不存在傳統(tǒng)方法中所遇到的問題的蛋白制造系統(tǒng)，這導(dǎo)致這樣的發(fā)現(xiàn)，即，當(dāng)隨著細(xì)胞的生長，合適的起始磷濃度降低至一個有限水平時，本發(fā)明的獲自畢赤酵母的NPS啟動子在無需任何誘導(dǎo)物的情況下自動誘導(dǎo)，因此能有效地制造目標(biāo)蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種啟動子，其選自由以下序列組成的組(1)SEQIDNO.:4的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.:4的位點337位點1，044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.:4的位點571位點1，044的核苷酸序列；禾口(4)SEQIDNO.:4的位點743位點1,044的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其包括所述啟動子和與所述啟動子可操作地連接的編碼重組蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種用于制造重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白。由以下詳細(xì)描述并結(jié)合附圖將可以更清楚地理解本發(fā)明的以上以及其他目的、特征和其他優(yōu)點，其中圖1顯示了采用NPS基因?qū)碜杂谠诹紫蘖颗囵B(yǎng)基中培養(yǎng)的畢赤酵母的mRNA進(jìn)行的Northern印跡結(jié)果(所述細(xì)胞以0.14(1)，0.08(2)和0.03(3)的特定生長速度生長)；圖2是顯示重組表達(dá)載體pNPS-AM-CLLip的構(gòu)建的示意圖，所述重組表達(dá)載體包含獲自畢赤酵母的NPS基因和與所述NPS基因可操作連接的報道基因；圖3A是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基(*:磷不足，V:磷限量，磷過量)中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時，細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)時間的脂肪酶活性的曲線圖；圖3B是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基(o:磷不足，磷限量，磷過量)中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時，細(xì)胞培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)時間的磷濃度的曲線圖3C是其中繪制了在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基[葡萄糖濃度-(O:磷酸鹽耗盡，磷限量，磷過量)，細(xì)胞密度-("磷不足，T:磷限量，廳磷過量)]中，分批培養(yǎng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母時，在不同培養(yǎng)時間的葡萄糖濃度和細(xì)胞密度的曲線圖4是在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母所獲得的脂肪酶蛋白的Western印跡結(jié)果；禾口圖5是描述篩選對NPS啟動子生物功能必需的最小核苷酸序列的示意圖(+:陽性脂肪酶活性，ND:未檢測到脂肪酶活性)。具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及編碼用于磷酸鹽運輸?shù)腘a+-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運體(下文中稱為"NPS")的基因。本發(fā)明的NPS基因具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。該NPS基因可根據(jù)SEQIDNO:l的序列進(jìn)行化學(xué)合成，或者采用對應(yīng)于所述基因兩端的預(yù)定區(qū)域的引物，使用畢赤酵母的基因組DNA作為模板，通過PCR進(jìn)行合成。本發(fā)明的獲自畢赤酵母的NPS基因能用作檢測來自畢赤酵母各個種的NPS基因的探針。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)控畢赤酵母中NPS基因的表達(dá)的啟動子。在一個實施方式中，所述NPS基因的啟動子由SEQIDNO.:4(1,044bp)的核苷酸序列構(gòu)成。即使所述SEQIDNO.:4的核苷酸序列的一部分，尤其是TATA區(qū)或CAT區(qū)，也被發(fā)現(xiàn)具有與由SEQIDNO.:4構(gòu)成的啟動子幾乎相同的功能。為了鑒別行使NPS基因啟動子功能所必需的最小序列，制備了各種截短的啟動子構(gòu)建體，這些構(gòu)建體包括缺失堿基1336、1570、1742、1838、1891和1921的序列。檢測這些截短的啟動子構(gòu)建體使與其可操作連接的重組蛋白表達(dá)的能力。結(jié)果，觀察到具有SEQIDNO.:4的核苷酸序列的截短構(gòu)建體在缺失堿基1336、1570或1742時能表達(dá)重組蛋白，但在缺失1838、1891或1921時不能表達(dá)重組蛋白。因此，本發(fā)明的NPS基因啟動子選自由(1)SEQIDNO.:4的全長核苷酸序列；(2)SEQIDNO.:4的位點337位點1,044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.:4的位點571位點1,044的核苷酸序列；禾口(4)SEQIDNO.:4的位點743位點1，044的核苷酸序列組成的組。優(yōu)選的是，本發(fā)明的NPS基因啟動子包括SEQIDNO.:4的位點743位點1,044的核苷酸序列，該核苷酸序列由SEQIDNO.:15表示。這些NPS基因啟動子可以根據(jù)在本發(fā)明中公開的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)合成，或者采用對應(yīng)于所述公開的各核苷酸序列的兩端的預(yù)定區(qū)域的引物，使用畢赤酵母的基因組DNA作為模板，通過PCR進(jìn)行合成。由于本發(fā)明的NPS基因啟動子獲得自畢赤酵母，因而能用作檢測至少來自畢赤酵母各個種的NPS基因的啟動子的探針。當(dāng)在磷限量的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時，可觀察到畢赤酵母過表達(dá)所述NPS基因(實施例1)。在表達(dá)與所述NPS啟動子結(jié)合的報道基因的試驗中，觀察到由于隨著細(xì)胞生長，耗盡了起始濃度的磷酸鹽，所述NPS啟動子發(fā)生了自動誘導(dǎo)，因此使得即使在不存在任何誘導(dǎo)物的情況下也能過表達(dá)所述目標(biāo)蛋白(實施例4)。當(dāng)在細(xì)胞生長過程中，培養(yǎng)基中可供使用的磷酸鹽變得有限時，所述NPS啟動子自動誘導(dǎo)，并因此強烈表達(dá)與其可操作連接的基因。因此，獲得自畢赤酵母的所述"NPS啟動子"可用作自動誘導(dǎo)型啟動子。"啟動子"是位于基因上游的DNA調(diào)控區(qū)域，該調(diào)控區(qū)域募集RNA酶到該調(diào)控區(qū)域上以提供調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的控制點。通常，啟動子可分為兩類。首先，響應(yīng)于誘導(dǎo)物的存在而激活，"誘導(dǎo)型啟動子"可啟動與之相關(guān)的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子在用于表達(dá)基因時要求募集誘導(dǎo)物，這類誘導(dǎo)物通常價格昂貴，并且在一些情況下可導(dǎo)致身體或宿主細(xì)胞的毒性。此外，誘導(dǎo)物的使用要求進(jìn)行培養(yǎng)時要進(jìn)行多種考慮，包括提供所述誘導(dǎo)物的時間點、培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的濃度等。另一方面，"組成型啟動子"是未受調(diào)控的啟動子，可使與其相關(guān)的基因連續(xù)轉(zhuǎn)錄而無需誘導(dǎo)物。然而，當(dāng)使用組成型誘導(dǎo)物時，基因表達(dá)的時間點不受控制。因此，當(dāng)目標(biāo)蛋白導(dǎo)致對宿主細(xì)胞的生長的毒性或副作用時，其難以大規(guī)模制造。相反，"自動誘導(dǎo)型啟動子"使與之相關(guān)的基因在所希望的時間點表達(dá)，這是因為它的激活并非響應(yīng)于誘導(dǎo)物的存在而發(fā)生。它響應(yīng)于培養(yǎng)條件的限制或特定營養(yǎng)的耗盡而被誘導(dǎo)，因此克服了誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子的多種缺點。得益于NPS基因的表達(dá)水平，可預(yù)期到本發(fā)明的NPS基因啟動子對與其相關(guān)的基因的表達(dá)的作用。在一個實施方式中，采用對所述NPS基因的mRNA水平的檢驗，可定量地確定其表達(dá)水平。在本領(lǐng)域中已知多種RNA檢驗技術(shù)。例如，可使用RT-PCR、Northern印跡、雜交、斑點雜交、DNA陣列雜交和/或DNA微珠。此外，獨立檢驗了本發(fā)明NPS啟動子誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的能力。在本發(fā)明的一個實施方式中，報道基因的表達(dá)處于NPS啟動子的控制之下，并可以定量地測量。適于該目的的報道基因的例子包括lacZ(卩-半乳糖苷酶)、uidA(卩-葡萄糖醛酸酶)、neo(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、dhfr(二氫葉酸還原酶)、aphlV(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)和lux(熒光素酶)。在本發(fā)明中，其中纖維素結(jié)合域與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的脂肪酶連接的融合蛋白(Ahn等，JournalofMicrobiol.Biotechnol.2003，第13巻，第451頁)優(yōu)選用作報道子。除了不導(dǎo)致毒性之外，所述融合蛋白還具有由于該纖維素結(jié)合域而高效率地分泌脂肪酶的優(yōu)點，并能測量活性，因此反映出了所述融合蛋白的表達(dá)水平(實施例2)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中廣泛已知的方法定性地或定量地分析所表達(dá)的報道子。盡管取決于報道基因，但是所述方法優(yōu)選涉及使用與相應(yīng)報道蛋白或其片段特異性結(jié)合的抗體。適合的抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，并包括可接受修飾抗體或衍生物，如Fab片段和單鏈抗體。為通過抗原-抗體反應(yīng)對分析物進(jìn)行鑒別和定量，可采用凝集法測定、Western印跡、ELISA、RIA、酶免疫測定(EIA)、熒光免疫測定(FIA)或免疫沉淀。如上所述，本發(fā)明的NPS啟動子能在所希望的時間點強烈表達(dá)可操作連接的基因而無需誘導(dǎo)物的協(xié)助，并因此可用在重組蛋白的制造中。術(shù)語"重組蛋白"意指通過基因工程技術(shù)制備的蛋白，而并非局限于任何特定的一種蛋白。因此，術(shù)語"重組蛋白"可與術(shù)語"目標(biāo)蛋白"交換使用。重組蛋白的制造之前必須構(gòu)建攜帶有NPS啟動子和與該啟動子可操作連接的編碼所述重組蛋白的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體構(gòu)成本發(fā)明的一個方面。所述重組載體可由商業(yè)提供的載體進(jìn)行制備。在此情況下，在所述載體中原本存在的啟動子可由本發(fā)明的NPS啟動子所替代。此外，所述重組載體可經(jīng)過設(shè)計以含有本發(fā)明的NPS啟動子和通常使用的調(diào)控序列。如此處所使用的術(shù)語"載體"是指起到穩(wěn)定地將重組蛋白的核苷酸序列輸送到宿主細(xì)胞中的作用的媒介物。為了能夠使用，載體必需具有自身復(fù)制并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中的能力，并且必須包括可檢測部分。如此處所使用的術(shù)語"重組表達(dá)載體"意指用于向宿主細(xì)胞中引入并表達(dá)特定可操作連接的基因的環(huán)狀DNA分子。如在本領(lǐng)域中廣泛已知的，為了提高引入到宿主細(xì)胞中的異源基因的表達(dá)水平，所述基閑必須可操作地與能在所述宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列連接。優(yōu)選的是，感興趣的基因由含有調(diào)控序列、可選擇的標(biāo)記和復(fù)制起點的一個載體所攜帶。如此處所使用的術(shù)語"調(diào)控序列"指對重組蛋白的表達(dá)是必須的或者有益的核苷酸序列。調(diào)控序列的例子包括分泌信號序列、多聚腺苷酸化信號序列、前肽序列、增強子、上游激活序列和轉(zhuǎn)錄終止因子。在本發(fā)明中，所述調(diào)控序列至少包括啟動子，并優(yōu)選包括啟動子和分泌信號序列?？蛇x的是，所述調(diào)控序列可包括其他調(diào)控因子，以提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。如此處使用的術(shù)語"分泌信號序列"意指能使所表達(dá)的蛋白運輸?shù)郊?xì)胞外的氨基酸序列，并通常用以促進(jìn)重組蛋白的分離和純化。轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的表面蛋白或分泌蛋白具有在細(xì)胞膜中被信號肽酶切割的N-末端序列?？捎迷诒景l(fā)明中的分泌序列的例子包括但不局限于a-因子信號序歹ll、殺〈矢毒素前導(dǎo)l言號序歹!j(killertoxinleadersignalsequence)、轉(zhuǎn)化酶信號序列和a-淀粉酶信號序列。為了被表達(dá)，編碼重組蛋白的核苷酸序列必須可操作地連接于包括本發(fā)明的啟動子的調(diào)控序列。如此處所使用的術(shù)語"可操作地連接"指一條核苷酸序列與另一條核苷酸序列功能性地排列。例如，如果其參與成熟蛋白的分泌，則分泌序列可操作地連接于所述蛋白。如果編碼序列的轉(zhuǎn)錄處于啟動子的控制之下，則其可操作地連接于所述啟動子。如果核糖體結(jié)合位點位于能使編碼序列被翻譯的位置，則其可操作地連接于所述編碼序列。通常，"可操作地連接的"DNA序列與另一序列相接觸。例如，分泌性前導(dǎo)序列與目標(biāo)基因相接觸，并存在于開放閱讀框之內(nèi)。然而，增強子不需要與目標(biāo)基因相接觸。用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。可用在本發(fā)明中的宿主細(xì)胞的例子包括典型的真核細(xì)胞宿主和原核細(xì)胞宿主，如大腸桿菌(E.coli)、各假單胞菌種(Pseudomonasspp.)、各芽包桿菌禾中(Bacillusspp.)、各鏈霉菌種(Streptomycesspp.)，真菌和酵母，昆蟲細(xì)胞如草地貪夜蛾(SF9),動物細(xì)胞如CHO和小鼠細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞(如C0S1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10),培養(yǎng)得到的人類細(xì)胞和植物細(xì)胞。在本發(fā)明中優(yōu)選酵母細(xì)胞。更優(yōu)選為畢赤酵母，這足因為它有與本發(fā)明的NPS啟動子相同的來源?？筛鶕?jù)由Davis等在BasicMethodsinMolecularBiology,198中公開的技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。優(yōu)選的例子包括DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、劃痕荷載和感染。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及制造重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述重組蛋白。根據(jù)常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)在適用于重組蛋白生成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，例如，在早期階段(初始培養(yǎng)階段)磷濃度為0.0010.02mM的含磷培養(yǎng)基。例如，可通過在允許表達(dá)和/或分離目標(biāo)蛋白的條件下小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵或搖瓶發(fā)酵而在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？刹捎靡阎夹g(shù)在含有碳源、氮源和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以是商業(yè)提供的一種培養(yǎng)基，或者可以參考在AmericanTypeCultureCollection的目錄中公開的組分和組成而制備的培養(yǎng)基。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可經(jīng)過分批培養(yǎng)或補^j"分批培養(yǎng)。如此處所使用的術(shù)語"分批培養(yǎng)"指使用在初始階段將生長所必需的所有營養(yǎng)物一次加入的培養(yǎng)基的生物分批過程。在分批培養(yǎng)中，所述宿主細(xì)胞能夠生長到一種必需營養(yǎng)物耗盡之后，或者生長到不適于其生長的條件形成(例如，pH降低，因此抑制宿主細(xì)胞的生長)之后。如此處所使用的術(shù)語"補料分批培養(yǎng)"指基于在發(fā)酵開始后立即、或者在所述培養(yǎng)基達(dá)到預(yù)定階段后、或者所述營養(yǎng)底物耗盡之后，將--種或多種生長營養(yǎng)底物補加到培養(yǎng)物中的生物分批過程。在補料分批過程中，例如將pH調(diào)節(jié)至預(yù)定值，并且將至少一種生長營養(yǎng)物再補加到培養(yǎng)物中。所述宿主細(xì)胞的生長速度取決于營養(yǎng)物的補加速率。通常，單種營養(yǎng)物或碳源是生長限制因素。同樣，其他營養(yǎng)或條件也可用作限制因素。例如，宿主細(xì)胞的生長可受限制于氮源、氧或各種特定營養(yǎng)物如維生素或氨基酸(當(dāng)所述宿主細(xì)胞對此是營養(yǎng)缺陷型時)?？刹捎帽绢I(lǐng)域中己知的方法從所述培養(yǎng)物中分離重組蛋白。例如，從所述培養(yǎng)物中分離重組蛋白可通過但不局限于傳統(tǒng)方法來實現(xiàn)，所述傳統(tǒng)方法例如為離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)和沉淀。此外，各種技術(shù)，包括色譜法(例如離子交換法、親合法、疏水法和尺寸排阻法)、電泳法、分離結(jié)晶法(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE和萃取法可使用在所述重組蛋白的純化中。通過以下實施例能更好地理解本發(fā)明，提供所述實施例的目的是為了說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實施例<實施例1>來自畢赤酵母的NPS啟動子的克隆為了篩選在磷限量條件下能夠在畢赤酵母中過表達(dá)的基因，根據(jù)本申請人:在2004年11月27日遞交的韓國專利申請2004-98303中公開的方法，在磷限量培養(yǎng)基中以連續(xù)方式進(jìn)行培養(yǎng)。將從如此培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)(cellmass)中分離出的mRNA用作RT-PCR的底物，以獲得過表達(dá)基因庫。通過核苷酸測序發(fā)現(xiàn)，所述基因庫含有負(fù)責(zé)磷代謝的N^-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運體(NPS)基因。隨之，克隆了用于調(diào)控所述基因表達(dá)的啟動子。在這點上，在合成引物(SEQIDNO.:2和SEQIDNO.:3)的存在下，用先前克隆的Na+-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運體(NPS)基因作為探針進(jìn)行反向PCR。使用畢赤酵母的經(jīng)各種限制性酶消化后的基因組DNA作為所述反向PCR的模板。通過反向PCR從Kpnl消化后所得的基因組DNA片段中檢測到編碼Na^-磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)運體(NPS)的基因。將該NPS基因克隆在pSTBlue-1載體中，由此形成的重組載體命名為"pSTl"。通過堿基測序，發(fā)現(xiàn)了NPS的開放閱讀框及其上游區(qū)域，即1,044bp長的啟動子(SEQIDNO.:4)。該啟動子稱為"PNPS"。通過使用分離自在磷限量條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的mRNA對所述NPS基因進(jìn)行Northern印跡，觀察到所述基因在磷限量條件下的過表達(dá)(圖1)。<實施例2>攜帶所述啟動子PNPS的重組表達(dá)載體的構(gòu)建使用脂肪酶基因作為報道基因以驗證所克隆的啟動子PNPS的活性。詳細(xì)地說，脂肪酶LlF(CBD-Ll-脂肪酶，其中編碼纖維素結(jié)合域的基因與脂肪酶連接)用作報道基因，這是因為它能更穩(wěn)定地表達(dá)脂肪酶Ll(Ahn等JournalofMicrobiol.Biotechnol.2003，第13巻，第451貞)。攜帶有脂肪酶基因和所述啟動子PNPS的重組表達(dá)載體基于pPIC9載體(Invitrogen，U.S.A.)。參考圖2，其中描述了制備攜帶有脂肪酶報道基因和所述啟動子PNPS的重組表達(dá)載體的方法。在合成引物SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6(分別含有AvrII和Notl限制性位點)的存在下，通過PCR由pYEGA-AM國CLLip(Ahn等，JournalofMicrobial.Biotechnol.2003，第13巻，第451頁)擴(kuò)增含有源自cc-淀粉酶的分泌信號和脂肪酶的序列。同樣，在合成引物SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8(分別含有BglII和AvrII限制性酶位點)的存在下，將實施例1中克隆的pST〗用作模板，通過PCR擴(kuò)增所述啟動子Pwps。編碼源自cc-淀粉酶的分泌信號和脂肪酶的基因用AvrII和Notl進(jìn)行消化，而所述啟動子Pws用BglII和AvrII進(jìn)行處理。隨后，將編碼源自oc-淀粉酶的分泌信號和脂肪酶的報道基因和所述啟動子Pws連接至用BglII和Notl部分消化的pPIC9載體。結(jié)果，制備了攜帶所述啟動子PwPS和編碼源自ct-淀粉酶和脂肪酶的基因的重組表達(dá)載體，并稱之為"pNPS-AM-CLLip"。當(dāng)由所述載體表達(dá)時，所述(x-淀粉酶用作分泌信號以對所述脂肪酶進(jìn)行胞外分泌。<實施例3>畢赤酵母的轉(zhuǎn)化用在實施例2中制備的重組表達(dá)載體pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。實施例2中制備的表達(dá)載體插入到畢赤酵母GSU5基因組上的his4基因中。為此，使用也存在于所述his4基因中的BspEI消化所述重組表達(dá)載體，然后采用鋰/TE法(Hill等，Nucl.Acids.Res.1991，第19巻，第5791頁)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。詳細(xì)地說，將經(jīng)BsPEI消化的所述重組表達(dá)載體、載體DNA和PEG/LiAc相混合并在3(TC下反應(yīng)30分鐘。然后，在加入DMSO后，在42"C下反應(yīng)15分鐘。離心后，將沉淀在200plTE緩沖液中懸浮。將所述懸浮液鋪在His(-)板上(葡萄糖2%、酵母氮源0.67%、無his的氨基酸混合物0.077%、瓊脂2%)，然后進(jìn)行23天的培養(yǎng)。從所得的轉(zhuǎn)化體中，選擇出在基因組中僅插入單拷貝的所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。<實施例4>脂肪酶在Pwps控制下的表達(dá)采用報道基因來觀察所述啟動子PNPS對所述報道基因在多種磷濃度下的表達(dá)方式的影響。更詳細(xì)地說，將實施例3中選擇出的用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母以分批方式在含有不同初始磷濃度(用NaH2P04，2H20迸行調(diào)節(jié))的培養(yǎng)基(如以下表1所示)中培養(yǎng)。取出來自細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)物并分析脂肪酶水平。根據(jù)培養(yǎng)時間測量細(xì)胞團(tuán)干重、脂肪酶活性以及葡萄糖、甘油和磷的濃度。如下進(jìn)行所述測量。(1)細(xì)胞團(tuán)干重將通過細(xì)胞培養(yǎng)物的離心獲得的細(xì)胞沉淀用等滲緩沖液洗滌，在8(TC干燥并稱重。(2)脂肪酶活性用pH-stat法測量脂肪酶的滴度。(3)葡萄糖水平用葡萄糖分析儀定量分析葡萄糖。磷水平用Fiske-Shubbarow法(Fiske等，JournalofBiologicalChemistry,1925，第66巻，第375頁)定量分析磷。表1在分批方式中采用的培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>參考圖3A、3B和3C，繪制了當(dāng)用pNPS-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母以分批方式在含有不同起始磷含量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，脂肪酶活性、磷濃度、細(xì)胞密度和葡萄糖濃度相對于培養(yǎng)時間的圖。如圖所示，培養(yǎng)基中較高的起始磷濃度導(dǎo)致較快的細(xì)胞生長速率和葡萄糖攝入速率。在培養(yǎng)基C中，含有20mM的起始磷濃度(磷過量)，細(xì)胞生長至70O.D.并且50g/L葡萄糖在開始培養(yǎng)后22小時內(nèi)完全耗盡的程度。在培養(yǎng)基B中，含有2.0mM的起始磷濃度(磷限量)，細(xì)胞生長至610.D.并且起始量為50g/的L葡萄糖在開始培養(yǎng)后37.5小時完全消耗。培養(yǎng)基A含有0.20mM的起始磷濃度(磷貧乏)，即使在培養(yǎng)40小時后，經(jīng)測量還具有43g/L的葡萄糖，而細(xì)胞生長至至多15O.D.。這些數(shù)據(jù)表明，磷濃度影響了細(xì)胞的生長。培養(yǎng)基C僅在對數(shù)期生長末期顯示出低濃度磷，表明所述細(xì)胞的生長不受限于磷。在培養(yǎng)基B中，從開始培養(yǎng)后12小時開始，細(xì)胞的生長受到限制。因為起始提供非常少量的磷，培養(yǎng)基A僅允許細(xì)胞以受限的速率生長。在培養(yǎng)基B中觀察到脂肪酶活性，然而在培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基C中幾乎未檢測到脂肪酶活性。這可由圖4的Western印跡結(jié)果所證實。因此，當(dāng)隨著細(xì)胞為其生長而消耗磷，使磷濃度由恰當(dāng)?shù)钠鹗妓浇档椭潦芟匏綍r，所述NPS啟動子自動誘導(dǎo)，因而能夠制造可操作連接的蛋白。相反，當(dāng)磷的濃度豐富而使所述細(xì)胞未受磷的限制時，或者所述磷的濃度對于細(xì)胞生長而言太低時，則沒有制造目標(biāo)蛋白。結(jié)果，本發(fā)明的NPS啟動子是可自動誘導(dǎo)的，因此能用磷濃度進(jìn)行控制，可以在磷限量條件下表達(dá)而無需任何誘導(dǎo)物。<實施例5〉NPS啟動子的必要控制區(qū)的篩選為了鑒別其在轉(zhuǎn)錄中起到根本作用的區(qū)域，從5'-端將先前克隆的1,044bp長的PNPS(SEQIDNO.:4)截短至預(yù)定位點，并將由此形成的啟動子片段與如同實施例2的在pNPS-AM-CLLip載體中那樣用作報道基因的所述脂肪酶基因連接。詳細(xì)地說，所述啟動子Pws(SEQIDNO.:4)的、缺失位點1位點336、570、742、838、891和921的區(qū)域的多條核苷酸片段是采用SEQIDNO.:9和8、SEQIDNO.:10和8、SEQIDNO.:11禾卩8、SEQIDNO.:12和8、SEQIDNO.:13和8、以及SEQIDNO.:14和8多套引物，用pNPS-AM-CLLip作為模板，通過PCR進(jìn)行制備的。由此得到的各PCR產(chǎn)物用BglII和AvrII消化并獨立地連接至預(yù)先用Bgin和AvrII消化的pNPS-AM-CLLip。所得重組表達(dá)載體分別命名為pNPS(A336)-AM-CLLip、pNPS(A570)-AM-CLLip、pNPS(A742)-AM-CLLip、pNPS(A838)-AM-CLLip、pNPS(A891)-AM-CLLip和pNPS(A921)-AM-CLLip。如實施例3所述，將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115之中，并選擇在所述基因組中僅分別插入單拷貝的相應(yīng)重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。為了測定截短的啟動子是否是活性的，將所選擇的轉(zhuǎn)化體在能利ffl脂肪酶活性形成暈圈(halo)的板上進(jìn)行培養(yǎng)。如圖5所示，分別用pNPS(A336)-AM-CLLip，、pNPS(A570)-AM-CLLip和pNPS(A742)-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母株觀察到具有相似的脂肪酶活性，而在用pNPS(A838)-AM-CLLip、pNPS(A891)-AM-CLLip或pNPS(A921)-AM-CLLip轉(zhuǎn)化的畢赤酵母中未檢測到活性。因此，從3'-端沿5'-端方向跨越302bp長度的區(qū)域?qū)τ赟EQIDNO.:4的Pnps功能是必需的。啟動子P^s的必需部分用SEQIDNO.:15表示。工業(yè)應(yīng)用性隨著細(xì)胞生長，當(dāng)恰當(dāng)?shù)钠鹗剂诐舛冉抵潦芟匏綍r，本發(fā)明的源自畢赤酵母的NPS啟動子自動誘導(dǎo)，從而能有效地制造目標(biāo)蛋白。利用本發(fā)明的可自動誘導(dǎo)的NPS啟動子的誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)系統(tǒng)可以是解決大規(guī)模制造重組蛋白的傳統(tǒng)方法所面臨的細(xì)胞株的穩(wěn)定性問題和其他問題的有前景的解決方案。盡管結(jié)合目前認(rèn)為最實際和最優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于所公開的實施方式及其附圖，而相反，本發(fā)明旨在涵蓋在所附權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的各種改進(jìn)和變化。權(quán)利要求1.一種啟動子，所述啟動子選自由以下核苷酸序列組成的組(1)SEQIDNO.4的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.4的位點337～位點1,044的核苷酸序列；(3)SEQIDNO.4的位點571～位點1,044的核苷酸序列；和(4)SEQIDNO.4的位點743～位點1,044的核苷酸序列。2.—種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求l的啟動子和與所述啟動子可操作地連接的編碼重組蛋白的核苷酸序列。3.—種用權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為酵母。5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。6.用于制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求35中任一項所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含有濃度為1mM20mM的磷的培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明公開了獲得自畢赤酵母的自動誘導(dǎo)型NPS啟動子；攜帶所述啟動子和核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述序列與所述啟動子可操作地連接并編碼重組蛋白；用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；以及制造重組蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白并分離所述蛋白。所述NPS啟動子可大規(guī)模地制造感興趣的重組蛋白而無需任何誘導(dǎo)物。文檔編號C12N15/11GK101415824SQ200680054180公開日2009年4月22日申請日期2006年8月7日優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日發(fā)明者安廷梧,崔毅星,樸明洙,李弘遠(yuǎn),李殷教,李赫遠(yuǎn),洪智涎,鄭俊基,金千錫申請人:韓國生命工學(xué)研究院