專(zhuān)利名稱：：在木糖中選擇和再生轉(zhuǎn)基因芥菜的方法在木糖中選擇和再生轉(zhuǎn)基因芥菜的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明描述了一種改進(jìn)的產(chǎn)生蕓苔轉(zhuǎn)化體的方法，所述方法是在根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化的芥菜(Brassicajuncea)外植體利用木糖作為唯一碳源的能力對(duì)其進(jìn)行選擇的方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。所述發(fā)明包括了用構(gòu)建的載體對(duì)目標(biāo)宿主植物進(jìn)行土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)酶木糖異構(gòu)酶。還公開(kāi)了在用所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)獲得木糖作為碳源的代謝優(yōu)勢(shì)之后，對(duì)推定的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇的方法。本發(fā)明緩解了負(fù)選擇方法的缺點(diǎn)。據(jù)報(bào)，使用木糖異構(gòu)酶進(jìn)行選擇具有穩(wěn)定的34-40%的轉(zhuǎn)化效率。發(fā)明背景轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生通常需要使用選擇系統(tǒng)，所述選擇系統(tǒng)使成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠再生并生長(zhǎng)。當(dāng)必須通過(guò)轉(zhuǎn)化將感興趣的核苷酸(NOI)或感興趣的基因(GOI)引入到細(xì)胞群體中時(shí)，只有一定數(shù)量的細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)化，即，只有少數(shù)細(xì)胞接受了NOI或GOI。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞只構(gòu)成了被處理細(xì)胞的較少部分，相對(duì)而言大部分細(xì)胞仍是未轉(zhuǎn)化的，因此選擇系統(tǒng)在選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行有效的篩選，這樣才能時(shí)的轉(zhuǎn)基因植物的恢復(fù)幾率，尤其是因?yàn)檗D(zhuǎn)化率總是低的(10—3至10—6)。選擇過(guò)程是通過(guò)和感興趣基因一起引入選擇性標(biāo)記基因來(lái)進(jìn)行的。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用這種選擇性標(biāo)記基因目的是給予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇優(yōu)勢(shì)，使其更快、更好地生長(zhǎng)，并殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。理想的選擇性標(biāo)記基因應(yīng)該能夠在所有的細(xì)胞或組織中并且在大多數(shù)植物物種中表達(dá)。這種表達(dá)應(yīng)該能夠容易的和植物組織中的任何內(nèi)源活性相區(qū)別，使轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的表型相區(qū)分。在再生步驟中，在選擇性培養(yǎng)基中頻死的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的影響應(yīng)該是微小的。除了上面的以外，一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)應(yīng)該能夠確證標(biāo)記的存在(ACNFP:1994)。目前確定的、能夠使轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后被鑒定的選擇性標(biāo)記可以被分為兩類(lèi)。它們是正和負(fù)標(biāo)記，分別給予選擇優(yōu)勢(shì)或劣勢(shì)。負(fù)選擇殺死不含有引入的DNA的細(xì)胞，包括基于抗生素和除草劑的選擇。它們通過(guò)在存在抗生素和除草劑的情況下的生長(zhǎng)來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織外植體。到目前為止，最廣泛使用的選擇性基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因(Fraley等人1986)，該基因提供了對(duì)氨基葡糖苷、抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性(Bevan等人1983)?；趯?duì)博來(lái)霉素(Hille等人1986)、溴草腈(bromoxynil)(Stalker等人1988)、氯霉素(Fraley等人1983)、2，4-二氯苯氧乙酸(Streber和Willmitzer1989)、草甘磷(Shah等人1986)、潮霉素(Waldron等人1985)或草丁膦(phosphinothricin)(DeBlock等人1987)的抗性開(kāi)發(fā)出了其它一些選擇系統(tǒng)。依賴于使用抗生素或除草劑的負(fù)選擇方法有一些缺點(diǎn)。死于抗生素毒性的植物細(xì)胞釋放生長(zhǎng)抑制劑和毒素，這被認(rèn)為會(huì)負(fù)面影響轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并且妨礙其生長(zhǎng)(Haldrup等人1988a)。在存在殺植物產(chǎn)物時(shí)未轉(zhuǎn)化細(xì)胞會(huì)被殺死，并且在使用粘接組織(coherenttissue)時(shí)存在轉(zhuǎn)化細(xì)胞也死亡的危險(xiǎn)，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡會(huì)截?cái)鄬?duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，或者是由于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的損傷或死亡會(huì)分泌毒性化合物，因此限制了負(fù)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率。此外，使用負(fù)選擇進(jìn)行細(xì)胞或組織的選擇需要對(duì)引入基因的表達(dá)相對(duì)于選擇過(guò)程進(jìn)行精確計(jì)時(shí)。如果在解毒基因表達(dá)前或者產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物來(lái)改變毒性化合物的作用之前，用毒性化合物處理轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞都會(huì)被殺死。如果選擇延遲了，可能會(huì)因?yàn)?，例如，從非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織中形成芽或愈傷組織，這會(huì)阻礙用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物的滲透，從而阻礙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織的選擇。它們引起基因組規(guī)模的DNA甲基化改變(Schmitt等人1997)。這種不可逆表型導(dǎo)致基因的沉默，并且被認(rèn)為會(huì)阻礙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的選擇和植物再生過(guò)程。甲基化的改變可以是劑量依賴的，并且導(dǎo)致序列突變(Bardini等人2003)。在攝入植物中存在抗生素抗性基因是一個(gè)環(huán)境有關(guān)問(wèn)題，主要的憂慮在于，該基因的可能的轉(zhuǎn)移會(huì)將抗生素抗性帶入到消化道微生物中。在原核來(lái)源的消化道微生物中更有可能發(fā)現(xiàn)原核來(lái)源的抗生素抗性標(biāo)記基因序列和受體DNA序列之間的同源性。因此，在消化道微生物中標(biāo)記基因的整合和表達(dá)的可能性要大于消化道上皮細(xì)胞。在選擇壓力下，罕見(jiàn)的轉(zhuǎn)移事件會(huì)非常快速的增加。如果一種能帶來(lái)對(duì)臨床重要抗生素的抗性的基因被轉(zhuǎn)移到通常用這種抗生素治療的病原微生物中并在其中表達(dá)，將會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生顯著影響。這種生態(tài)問(wèn)題會(huì)使政府限制抗生素抗性基因在植物中的使用，并且需要開(kāi)發(fā)出新的、不依賴這種基因的選擇方法。歐共體已經(jīng)制定了禁止抗生素抗性基因用于選擇轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，并在2004年年末生效，因此，在歐共體銷(xiāo)售的任何未來(lái)的遺傳增強(qiáng)植物和食物產(chǎn)品都將不得不含有替代的選擇標(biāo)記。甚至在使用除草劑抗性基因作為選擇標(biāo)記方面，也有通過(guò)異型雜交使抗性轉(zhuǎn)移到作物相關(guān)雜草中的可能性(Rieger等人1999)。通過(guò)正選擇方法使上面提到的擔(dān)憂得到很大程度的緩解，其操作原理和負(fù)選擇相反。和負(fù)選擇相反，正選擇通過(guò)使用特定的碳、氮或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)作為選擇試劑使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠生長(zhǎng)(Joersbo和Okkels1996;Bojsen等人1998;Haldrup等人1998a)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得了給予其相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有代謝優(yōu)勢(shì)的基因，與此同時(shí)使非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞饑餓，而不是殺死它們。發(fā)明中采用的選擇方法使用了選擇試劑，所述選擇試劑是不被多種植物物種代謝的碳水化合物(Bojsen等人1994)。通過(guò)用這些化合物中的一種代替正常使用的碳水化合物，使轉(zhuǎn)化有編碼能夠使該化合物轉(zhuǎn)化為可代謝的異構(gòu)體的基因的細(xì)胞在生長(zhǎng)沖處于有利地位，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是饑餓的。因此給予了轉(zhuǎn)化細(xì)胞一種代謝優(yōu)勢(shì)。木糖可以被木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為酮糖，可以在這種系統(tǒng)中發(fā)揮選擇標(biāo)記的功能(Haldrup1996)。用于正選擇的這些標(biāo)記基因能夠鑒定和選擇遺傳修飾的細(xì)胞，并且不使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體受到損傷或死亡(負(fù)選擇)。在再生過(guò)程中向培養(yǎng)基中加入新化合物作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和分化，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞將不能生長(zhǎng)或再生出新生植物。在這個(gè)發(fā)明中公開(kāi)的是一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蕓苔(Brassica)的方法，該方法采用了一種不使用任何熟知的抗生素抗性基因或除草劑抗性基因的選擇方法。描述了選擇并再生芥菜物種(Brassicajuncea)轉(zhuǎn)化體的方法，具體示例說(shuō)明了一種陽(yáng)性選擇方法，所述陽(yáng)性選擇方法涉及給予轉(zhuǎn)化組織外植體利用某種碳源(優(yōu)選木糖)的能力，并且可以il捧。，'，'''，。土。、'、'現(xiàn)有技術(shù)描述了一種使用分離自熱硫基因熱氣細(xì)菌(Thermoaerobacteriumthermosulfurogenes)或分離自餘霉鏈霉菌(Streptomycesrubiginosus)的木糖異構(gòu)酶基因(xylA)作為選擇標(biāo)記基因開(kāi)發(fā)出來(lái)的正選擇方法(Haldrup等人，1998a)。在含木糖培養(yǎng)基中成功選擇出了馬鈴薯、煙草和番茄的轉(zhuǎn)基因植物。此處公開(kāi)的選擇方法顯著區(qū)別于引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)。我們的發(fā)明專(zhuān)門(mén)針對(duì)屬于芥菜物種的轉(zhuǎn)化植物外植體的正選擇方法。選擇性標(biāo)記基因分離自有機(jī)體裂殖壺菌(Schizochytrium)，并經(jīng)適當(dāng)修飾用于其在成功轉(zhuǎn)化后在宿主植物中的表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)我們以前提交的申請(qǐng)描述了一種轉(zhuǎn)化向日葵外植體并基于其利用木糖作為唯一碳源的能力選擇遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化向日葵外植體的方法。題目為"MannoseorXylosepositiveselection"的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)5,767,378涉及了從真核細(xì)胞群體中鑒定或選擇具有作為被轉(zhuǎn)化結(jié)果的代謝優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞的方法，所述真核細(xì)胞群體是在含有至少一種化合物的培養(yǎng)基上或該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。這個(gè)發(fā)明為特異性地選擇轉(zhuǎn)化的甜菜或馬鈴薯細(xì)胞提供了基礎(chǔ)。上面提到的現(xiàn)有技術(shù)具體地要求保護(hù)所述的在甜菜和馬鈴薯細(xì)胞中進(jìn)行的正選擇操作方案，與此相對(duì)，我們的發(fā)明涉及芥菜(Brassicajuncea)本身的正選擇。對(duì)于每種植物物種，轉(zhuǎn)化的操作方案都是獨(dú)特的。此外，和引用的現(xiàn)有技術(shù)相比，在提交的發(fā)明中所描述的轉(zhuǎn)化方法學(xué)是完全不同的。而且，所引用的文獻(xiàn)都沒(méi)有描述基于芥菜(Brassicajuncea)的正選擇的轉(zhuǎn)化方法。Haldrup等人(1998)已經(jīng)確定，使用D-木糖作為選擇試劑，來(lái)自于有機(jī)體熱硫基因熱空氣細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶基因能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的選擇(PlantMolecularBiology(1998)，37(2)，287-296)。通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，木糖異構(gòu)酶基因被轉(zhuǎn)移到目標(biāo)植物中。未優(yōu)化的選擇實(shí)驗(yàn)顯示，在馬鈴薯和番茄中木糖異構(gòu)酶選擇比卡那霉素抗性選擇更有效，而在煙草植物中觀察到相反的效果。此處揭示的方法明顯區(qū)別于引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)。描述的是一種改進(jìn)的、產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蕓苜的方法，所述方法采用了一種不使用任何熟知的抗生素或除草劑抗性基因的選擇方法。還描述了選擇并再生芥菜物種(Brassicajuncea)轉(zhuǎn)化體的方法，具體示例說(shuō)明了一種陽(yáng)性選擇方法，該陽(yáng)性選擇方法涉及給予轉(zhuǎn)化組織外植體利用替代碳源(優(yōu)選木糖)的能力?？梢院?jiǎn)單地用含有所述選擇性試劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的外植體來(lái)對(duì)其進(jìn)行選擇。在發(fā)明中使用的選擇性標(biāo)記基因分離自海洋有機(jī)體裂殖壺菌，并且為了該基因在宿主植物中的表達(dá)，對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。相對(duì)于常用的基于hpt潮霉素的選擇方法，使用木糖異構(gòu)酶XI后再生小植林的數(shù)量增加了3-4倍。使用上述正選題，并且得到穩(wěn)定的35-40%的轉(zhuǎn)化效率。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的轉(zhuǎn)化植物物種芥菜(Brassicajuncea)的方法，并用使用木糖的正選擇法選擇轉(zhuǎn)化體。根據(jù)發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種分離總RNA以及從mRNA合成cDNA的方法。從初始cDNA庫(kù)中隨機(jī)挑取EST克隆，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，籍此鑒定出1.5kb的cDNA克隆，該克隆編碼全長(zhǎng)的木糖異構(gòu)酶(jt/力。cDNA具有1481bp的0RF。再進(jìn)一步，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及了編碼具有木糖異構(gòu)酶生物活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子。具體的，該方面涉及了SEQID3所代表的多核苷酸。還代表了提交的發(fā)明的多核苷酸分子所編碼的多肽。本發(fā)明的一個(gè)具體方面描述了獲自于裂殖壺菌的木糖異構(gòu)酶和獲自于擬南芥的木糖異構(gòu)酶之間的同源性，以及將其克隆到pGEM-TEasy中。根據(jù)進(jìn)一步的一個(gè)方面，通過(guò)對(duì)木糖異構(gòu)酶序列克隆進(jìn)行多位點(diǎn)定向突變，置換了9個(gè)核苷酸，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并且該基因成功地在宿主植物中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，將密碼子優(yōu)化的基因克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并進(jìn)行功能檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)木糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯。隨后將木糖異構(gòu)酶基因克隆到pCAMBIA中，來(lái)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到宿主植物芥菜中。根據(jù)本發(fā)明的高度優(yōu)選的方面，描述了構(gòu)建的包含選擇性標(biāo)記基因的載體利用土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，在適合感染的條件下進(jìn)入到宿主植物外植體中，因此誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞出現(xiàn)正效果，當(dāng)共同培養(yǎng)到合適的含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上時(shí)，使該細(xì)胞具有了相對(duì)于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的方面，此處描述的是一種選擇系統(tǒng)，用于從培養(yǎng)基中從細(xì)胞群體中選擇至少一種遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中至少一種遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被轉(zhuǎn)化有編碼能轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的一種組分或前體的表達(dá)產(chǎn)物的核苷酸序列。更具體的，在發(fā)明中提到的選擇性組分是木糖。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"意指任何類(lèi)型的細(xì)胞，可以使用發(fā)明的方法從其雜燴鑒別并分離出個(gè)別的遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。據(jù)報(bào)，揭示的轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率為34-40%，并且再生效率比已知的基于潮霉素(hygromycin)的方法高3-4倍。圖l.在SC-1去飽和酶的1.5kb序列中的完整的木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域圖2.SC-1的基序和木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的同源性圖3.pGEX-XI圖鐠。在pGEX的BamHI和Xhol處克隆木糖異構(gòu)酶基因。圖4.在大腸桿菌中誘導(dǎo)木糖異構(gòu)酶。使用XI引物對(duì)轉(zhuǎn)化的SEA外植體進(jìn)行的擴(kuò)增。泳道I:誘導(dǎo)的；U:未誘導(dǎo)的；1，2，3:攜帶有木糖異構(gòu)酶基因的不同克??；M:MW標(biāo)記。圖5.A.從木糖異構(gòu)酶克隆中擴(kuò)增0RF。B:用Xhol限制性酶切pCAMBIA-XI。注意hpt基因從Xhol位點(diǎn)的釋放。圖6.在pCAMBIA-CO-XI中用XI置換hpt。圖7.芥菜子葉葉柄外植體A)在蔗糖(35gm/l)中培養(yǎng)B)在D-木糖(3Qgm/1)中培養(yǎng)C)在不含任何碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖8，用pCAMBIA-CO-XI和pCAMBIA1380轉(zhuǎn)化并分別培養(yǎng)于木糖(25g/l)+蔗糖(5gra/l)和潮霉素(25mg/1)的子葉葉柄外植體的出芽比較，A)3周選擇后；B)6周選擇后。圖9.在轉(zhuǎn)化有pCAMBIA+XI構(gòu)建體的外植體中使用正選擇對(duì)轉(zhuǎn)基因嫩枝的選擇和再生。圖10.用XI引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的子葉葉柄外植體。使用XI引物對(duì)選擇的、攜帶有pCAMBIA1301-XI的小植物的100ng基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,泳道1:d15質(zhì)粒DNA;泳道2-6和8-13:從不同外植體得到的DNA樣品；M:1kb梯度標(biāo)記。圖11.芥菜變種"Varuna"木糖異構(gòu)酶陽(yáng)性植物。圖12.XI陽(yáng)性T。植物的L種子的基因組DNA的擴(kuò)增。從L種子中分離出100ng基因組DNA，使用XI引物進(jìn)行擴(kuò)增，泳道1:標(biāo)志物(1Kb)，泳道2-7:來(lái)自于6個(gè)不同豆莢的種子的XI基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(1.32kb)，泳道8:陽(yáng)性對(duì)照，泳道9:標(biāo)志物。序列說(shuō)明.SEQIDNO1:SCI的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)序列。SEQIDNO2:SCI的木糖異構(gòu)酶的序列轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。SEQIDNO3:進(jìn)行在植物中的表達(dá)優(yōu)化之后的木糖異構(gòu)酶的序列。SEQIDNO4:全長(zhǎng)序列編碼優(yōu)化的pCAMBIA載體在框閱讀的SCI的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記基因"指的是和感興趣的基因一起優(yōu)選地、共同引入的、任意的核苷酸序列，其中賦予了用所述選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇優(yōu)勢(shì)。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記化合物"或"選擇性試劑"是只有成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠代謝的化合物或營(yíng)養(yǎng)，因此，由于選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中被選擇出來(lái)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"選擇優(yōu)勢(shì)"包括術(shù)語(yǔ)選擇的、代謝的和生理優(yōu)勢(shì)，并且意指和劣勢(shì)的(未轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞相比轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠更快地生長(zhǎng)，或者能優(yōu)勢(shì)地利用劣勢(shì)細(xì)胞所不能利用的底物(例如營(yíng)養(yǎng)前體，等)。術(shù)語(yǔ)"選擇"指的是使用本發(fā)明的方法從非遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中鑒定并且/或者分離出遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"遺傳轉(zhuǎn)化的"包括使用重組DNA技術(shù)的轉(zhuǎn)化。術(shù)語(yǔ)"載體"包括表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化載體。實(shí)施例1從破嚢壺菌(Thraustochytrid)菌林SC-1中克隆木糖異構(gòu)酶從培養(yǎng)3天的破嚢壺菌SC-1(—種分離自Goa的滯水的破嚢壺菌)培養(yǎng)物中分離總RNA。使用超級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)從mRNA合成cDM。將cDNA克隆進(jìn)入到pSPORTl載體的WW/-5^//位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中。原代cDNA庫(kù)含有2x106個(gè)克隆，而擴(kuò)增的庫(kù)的滴度為2x10'°克隆/ml。隨機(jī)挑取EST克隆并用SP6和T7引物插入擴(kuò)增。隨機(jī)選擇2000個(gè)cDNA克隆的5'末端并用T7引物測(cè)序。根據(jù)SC-1的cDNA庫(kù)進(jìn)行克隆的5'末端測(cè)序，鑒定出1.5kb的cDNA克隆，該cDM克隆編碼1511bp的全長(zhǎng)木糖異構(gòu)酶(i/L4)cDNA，并具有158bp的5'UTR和30bp的3'UTR。其具有1481bp的0RF。SEQIDl給出了CDS的序列。它是SC-1全長(zhǎng)木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄子的序列。該序列翻譯為440個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該翻譯蛋白的氨基酸序列顯示于SEQID2。該序列顯示出和擬南芥木糖異構(gòu)酶的74%的同源性。其具有完整的木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域，并且被指定為SC-1木糖異構(gòu)酶。圖1顯示，在SC-1去飽和酶的1.5kb的序列中存在完整的木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域。圖2圖示了來(lái)自于SC-1的基序和木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的同源性。實(shí)施例2木糖異構(gòu)酶的密碼子優(yōu)化SC-1的木糖異構(gòu)酶序列使用在植物中相對(duì)很少使用的密碼子；SC-1主要使用CGC編碼精氨酸，而只有9%的植物用CGC編碼精氨酸。因此，用更常使用的精氨酸密碼子代替CGC編碼子。在引入到植物之前，對(duì)克隆進(jìn)行兩輪的多位點(diǎn)定向突變，置換9個(gè)核苷酸。優(yōu)化的序列顯示于SEQID3。實(shí)施例3將木糖異構(gòu)酶克隆到pGEX表達(dá)載體中為了確證密碼子優(yōu)化的基因確實(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯，用含有BamHI位點(diǎn)的正向引物(5'GCGCGGATCCATGGGTGAATTCTTTC30和含有Xhol位點(diǎn)的反向引物(S'GAAACTCGAGCnGTCGATTAAGAAATGTATTGGHT)擴(kuò)增pSPORTl的密碼子優(yōu)化的SC-1JyW基因。用BamHI和Xhol消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(1323)。pGEX-4T-3是一種表達(dá)載體，用于將蛋白作為和26-kDa的谷光苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白，在tac啟動(dòng)子的調(diào)控之下進(jìn)行表達(dá)。用BamHI和Xhol消化pGEX-4T-3，并將PCR產(chǎn)物(用BamHI和Xhol限制性消化)定向克隆到兩個(gè)位點(diǎn)之間，得到的克隆被稱為pGEX-XI。圖3圖示了pGEX-XI的圖鐠。木糖異構(gòu)酶融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將攜帶有木糖異構(gòu)酶基因的pGEX-XI轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。在含有100jag/ml的氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。隨機(jī)挑取克隆，并在含有100|ug/ral的氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。將1%的這種過(guò)夜培養(yǎng)物用作起始培養(yǎng)物接種于5ml的含有100mg/ml的氨卡青霉素的LB液體培養(yǎng)基中。孵育培養(yǎng)物直到O.D.600達(dá)到大約0.6-0.7。用lmMIPTG誘導(dǎo)2ml的每種培養(yǎng)物3小時(shí)。同時(shí)，沉淀2ml的培養(yǎng)物作為未誘導(dǎo)的對(duì)照。細(xì)胞沉淀重懸于lOOu1樣品緩沖液中，并取50ul上樣到10%SDS-PAGE凝膠中。誘導(dǎo)顯示于圖4中。在克隆1和2的誘導(dǎo)細(xì)胞中觀察到了76KDa的蛋白(GST-木糖異構(gòu)酶融合蛋白的預(yù)計(jì)大小)，而在未誘導(dǎo)細(xì)胞中沒(méi)有。因此，密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶具有正確的閱讀框，并且能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯。大腸桿菌中木糖異構(gòu)酶基因功能的證明大腸桿菌菌林AB477(proA2，his-4，aroCl，thi-l，lacYl，galK2xy卜5，mtl-l，lambda—supE44)是木糖異構(gòu)酶(J/A4)缺陷的(Haldrup等人，1998&2001)。在突變體中木糖異構(gòu)酶基因的互補(bǔ)作用使該菌林能夠利用并生長(zhǎng)，因此證明了其功能。大腸桿菌菌株AB477獲自于美國(guó)大腸桿菌基因庫(kù)中心(E.coliGeneticStockCenter)。將pGEX-4T-3中的木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌林AB477的感受態(tài)細(xì)胞中，并鋪板于含有l(wèi)%(w/v)D-木糖和氨卡青霉素(100jag/ml)的麥康凱(MacConkey)瓊脂平板上。包含基因的轉(zhuǎn)化子能夠發(fā)酵D木糖并且在含有木糖的(MacConkey)瓊脂平板上顯紅色。將AB477宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化有pGEX4T-3的細(xì)胞和轉(zhuǎn)化有pGEX-XI的細(xì)胞分別鋪板于含有氨卡青霉素(100mg/ml)的MacConkey's培養(yǎng)基上和含有木糖(1%w/v)與氨卡青霉素(100yg/ml)的MacConkey's培養(yǎng)基上。在含有木糖的培養(yǎng)基中得到紅色的含有pGEX-XI的克隆，而宿主細(xì)胞和攜帶有pGEX4-T3的AB477不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此，獲自于SC-1的密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶基因得到了翻譯并且是具有功能的。實(shí)施例4將木糖異構(gòu)酶克隆到pCAMBIA中pCAMBIA-1301衍生自pPZP載體。該載體含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因，該基因受CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控，并由CaMV35SpolyA信號(hào)終止。該基因提供了對(duì)潮霉素的抗性，因此在含有潮霉素的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。使用正向引物(5'CTCTCTCGAGCAACCATGGGTGAATTCTTTCC3')和反向引物(5'GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT30擴(kuò)增pSPORT中的密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶0>7力基因的0RF，每種引物都含有Xhol位點(diǎn)。用Xhol限制性酶切擴(kuò)增的片段。同時(shí)用Xhol限制性酶切pCAMBIA1301來(lái)釋放出hpt基因，將從瓊脂糖中純化出的栽體和擴(kuò)增片段連接。圖5圖示了木糖異構(gòu)酶克隆的ORF擴(kuò)增和用Xhol對(duì)pCAMBIA-XI進(jìn)行的限制性酶切。將連接混合物轉(zhuǎn)移到DH10B中。挑取轉(zhuǎn)化的克隆，并用XI引物擴(kuò)增從這些克隆中分離出的質(zhì)粒，并對(duì)其測(cè)序。因此確認(rèn)了攜帶有具有正確方向和閱讀框的XI基因的構(gòu)建體。SEQID.4給出了以正確閱讀框克隆的基因序列。圖6圖示了SC-1的全長(zhǎng)的密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄子在pC細(xì)IA載體中的閱讀框的序列，以及在pCAMBIA-C0-XI中用XI對(duì)hpt進(jìn)行的置換。用密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶置換了克隆于pCAMBIA1301栽體的Xho-1位點(diǎn)之間的編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的hpt基因，來(lái)代替潮霉素，所得到的構(gòu)建體被稱為pCAMBIA-XI。實(shí)施例5用木糖異構(gòu)酶作為正選擇標(biāo)記的芥菜轉(zhuǎn)化已知在通過(guò)轉(zhuǎn)化將遺傳物質(zhì)引入到一群細(xì)胞中時(shí)，只有一定數(shù)量的細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)化。按慣例，使用負(fù)選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和選擇，其中轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有某種它們能夠降解的試劑的培養(yǎng)基中存活，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在該培養(yǎng)基中被殺死。潮霉素是最常用的抗生素，在所使用的用于轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體中，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)為在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供了抗性?？敲顾睾统輨?草丁膦，phosphinothricin)抗性是用于芥菜轉(zhuǎn)化體選擇的其它標(biāo)記。這些負(fù)選擇方法具有一些缺點(diǎn)。因?yàn)樵谏L(zhǎng)培養(yǎng)基中存在抗生素，所以非轉(zhuǎn)化細(xì)胞有可能會(huì)死亡，它們向培養(yǎng)基中釋放毒素，這些毒素對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是抑制性的和有毒的。并且，在飲食攝入的植物和微生物中存在抗生素抗性基因是環(huán)境組織和政府當(dāng)局關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。此選擇過(guò)程進(jìn)行精確計(jì)時(shí)。二k在解毒基因表達(dá)之前;者在產(chǎn)生足夠的解毒基因產(chǎn)物來(lái)改變有毒化合物的作用之前用有毒化合物處理轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因基本都將被殺死。如果推遲進(jìn)行選擇，可能會(huì)因?yàn)槔鐝姆寝D(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織形成枝條或愈傷組織(它們形成了一道阻礙用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物滲透的障礙)而妨礙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織的選擇。通過(guò)正選擇法很大程度上克服了上述缺點(diǎn)，該方法能選擇性地使群體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)，而不損傷或殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且不引入抗生素或除草劑抗性基因。許多植物物種沒(méi)有先天的代謝木糖的能力，因此不能在木糖是唯一碳源的培養(yǎng)基上旺盛生長(zhǎng)。用攜帶有木糖異構(gòu)酶的構(gòu)建體作為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化這些物種，能給予轉(zhuǎn)化細(xì)胞利用木糖作為碳源的能力。在芥茱中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和選擇植物材料對(duì)于我們的研究，我們已經(jīng)使用了芥菜變種、aruna'(Brassicajunceavar.'varuna')—在瓦拉納西(Varanasi)地區(qū)的選種，植物高度為145-155cm，垂直并且粗壯，具有中度分枝。其葉子大小中等，深綠色，在下表面具有稀少的毛，在葉基處有紫色色素。Varuna對(duì)赤枯病(Alternariablight)和蚜蟲(chóng)有中度抗性。它是一種中度耐久變種(135-140天)，含油量43%(21%亞麻仁油酸)，產(chǎn)量為20-22qtls/ha。將芥菜變種、aruna'的種子在70°/。乙醇中2分鐘并在0.1%氯化汞中5分鐘進(jìn)行滅菌。用無(wú)菌水劇烈清洗滅菌的種子4-5次，隨后吸干。隨后在組織培養(yǎng)瓶中讓這些種子在無(wú)激素的、0.8%瓊脂固化的MS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中發(fā)芽(30-40個(gè)種子/瓶)。苗在B0D中在25。C下以黑暗2天光下3天的光周期生長(zhǎng)(16h光8h黑暗)，直到胎盤(pán)母面絨毛小葉完全伸展開(kāi)，并且下胚軸4到5cm長(zhǎng)。檢測(cè)不同外植體的再生效率。其中，發(fā)現(xiàn)有子葉的葉柄外植體具有最大的再生潛力，因此用于轉(zhuǎn)化。子葉的葉柄外植體的分離收集5天齡的健康苗，切除苗的底部。在下胚軸和葉柄莖的附著點(diǎn)處、剛好在分生組織的上方(來(lái)避免包含葉子原基組織)進(jìn)行切割來(lái)分離有子葉的葉柄。重要的是，手術(shù)刀片是銳利的，因?yàn)閹в蟹浅?干凈"的切割表面(即，當(dāng)組織不是撕裂的)的分離的葉柄的反應(yīng)是最好的。從每個(gè)苗獲得兩個(gè)外植體，每個(gè)外植體具有長(zhǎng)度為3-5mm的葉柄長(zhǎng)度。收集外植體并將葉柄浸于培養(yǎng)基中來(lái)儲(chǔ)存于共培養(yǎng)基中，用于以后的應(yīng)用。實(shí)施例6篩選利用木糖作為碳源的能力為了檢測(cè)芥菜是否能夠使用木糖作為碳源，分別在含有蔗糖和木糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體。分離100個(gè)子葉柄外植體并在含有MS鹽、0.2mg/lNAA、2mg/1BAP和8g/1Agar、其中碳源是a)3.5%蔗糖；b)3%木糖；c)無(wú)碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。在3周結(jié)束后觀察碳源對(duì)外植體的影響。見(jiàn)圖7。在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體在2-3周內(nèi)褪色或變?yōu)楹稚⑶宜劳觥Ｔ谌狈μ荚吹呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體看起來(lái)是蒼白的和不健康的，并且不產(chǎn)生愈傷組織，而在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體是健康的，并且發(fā)育良好。因此表明芥菜子葉柄外植體不能使用木糖作為碳源。實(shí)施例7使用pCAMBIA-XI轉(zhuǎn)化芥菜用土壤桿菌轉(zhuǎn)染如早先所述從5天齡的幼苗中分離子葉柄外植體。使用含有二元栽體pCAMBIA1301(攜帶有hpt基因(負(fù)選擇))的根癌土壤桿菌(々r幽"er/咖f畫(huà)/^c/e/7"菌林GV3101和攜帶有pCAMBIA-XI栽體(正選擇)的菌林進(jìn)行比較。細(xì)菌活化攜帶有各自載體的土壤桿菌GV3101細(xì)胞在含有氯化鈉10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母抽提物5g/1、利福平(Rif詣picin)(10mg/ml)、慶大霉素(Gentamycin)(10mg/ml)和卡那霉素(Ka議ycin)(50jug/ml)的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，并在28。C中以200rpm進(jìn)行4-6小時(shí)的指數(shù)生長(zhǎng)，達(dá)到0.D6。。=1.0。在4'C下以6000rpm離心細(xì)胞10分鐘，在含有MS鹽和30g/l蔗糖的MS液中清洗并重懸，調(diào)整細(xì)菌密度達(dá)到A6。。為0.3-0.5。感染挑取子葉外植體并將葉柄尖端浸入土壤桿菌懸液中并保持10-15秒，隨后立即轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，葉柄浸入培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)移回共培養(yǎng)培養(yǎng)基(對(duì)于盛放細(xì)菌懸液，2cm深培養(yǎng)皿是理想的)之前，子葉不要浸到懸液中。在黑暗中28。C下共培養(yǎng)外植體3天。將外植體移到選擇培養(yǎng)基時(shí)(培養(yǎng)72小時(shí)后)，葉柄應(yīng)該長(zhǎng)長(zhǎng)并且變厚。隨后應(yīng)該將葉柄植入到選擇培養(yǎng)基中，并使子葉片離開(kāi)培養(yǎng)基。實(shí)施例8選擇并再生jH逸蜂希存J^3天的共培養(yǎng)后，用含有MS鹽、30g/1蔗糖和250mg/1頭孢噻肟(Cefotaxime)的MS液完全清洗外植體15分鐘，3次。用無(wú)菌濾紙吸干，隨后轉(zhuǎn)移到含有MS鹽、0.2mg/lNAA、2mg/1BAP、25g/lD-木糖、5g/1蔗糖、250mg/l頭孢噻肟(Cefotaxime)、8g/1瓊脂，pH5.6的I選擇培養(yǎng)基中，在16小時(shí)亮和8小時(shí)暗的光周期條件下保持4周。隨后在含有MS鹽、0.1mg/1NAA、3mg/1BAP、29gD-木糖、lg/1蔗糖、250mg/l頭孢噻肟(Cefotaxime)、8g/1瓊脂，pH5.6的第II選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行次培養(yǎng)，繼續(xù)保存3周。在此期間，從愈合組織中發(fā)育出一些枝芽。在選擇期之后，將嫩枝次培養(yǎng)于含有半強(qiáng)度MS鹽、15g/l蔗糖、250mg/l頭孢噢將(cefotaxime)和8g/1瓊脂、pH5.6的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行延長(zhǎng)。2周后，將延長(zhǎng)的嫩枝轉(zhuǎn)到含有半強(qiáng)度MS鹽、0.01mg/1IBA、30g/l蔗糖、150mg/l頭孢噻肟(cefotaxime)和8g/l瓊脂、pH5.6的根培養(yǎng)基中。在中水中2天使生根的植林變硬，隨后轉(zhuǎn)移到土壤和金精石(vermiculite)(1:2)混合物中。^逸舉和存^共培養(yǎng)3天后，用含有MS鹽、30g/1蔗糖和250rag/1頭孢噢肟(Cefotaxime)的液體培養(yǎng)基完全清洗外植體3次。將外植體轉(zhuǎn)移到含有MS鹽、0.1mg/1NAA、2mg/1BAP、25mg/l潮霉素(Hygromycin)、250mg/l頭孢瘞將(Cefotaxime)、30g/l蔗糖、8g/l瓊脂，pH5.6的選擇培養(yǎng)基中。選擇期后，將嫩枝次培養(yǎng)于含有半強(qiáng)度MS鹽、30g/1蔗糖、250mg/1頭孢漆將(cefotaxime)和8g/l瓊脂、pH5.6的1/2MS培養(yǎng)基中2周。將延長(zhǎng)的嫩枝轉(zhuǎn)到含有1/2強(qiáng)度MS鹽、30g/l蔗糖、150mg/l頭孢瘞將(cefotaxime)和8g/l瓊脂、pH5.6的才艮培養(yǎng)基中，隨后將生根的植抹轉(zhuǎn)移到土壤中。實(shí)施例9比較正和負(fù)選擇用pCAMBIA1301(帶有力/^)和pCAMBIA-XI(木糖異構(gòu)酶置換力pO轉(zhuǎn)化外植體，并在各自的分別含有不同濃度的潮霉素和木糖的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。將首次選擇中生存的外植體轉(zhuǎn)移，在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行為期21天的第二輪選擇。隨后將外植體轉(zhuǎn)移到延長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在第二輪選擇后，分別使用hpt和XI引物擴(kuò)增從小苗葉子中得到的100ngDNA，采用如下循環(huán)條件94°C1分鐘，55'C1分鐘,72T1.3分鐘，4Q個(gè)循環(huán)。觀察結(jié)果列于下表A)用pCAMBIA-1301轉(zhuǎn)化外植體。在含有潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1:用pCAMBIA-1301和pCAMBIA-XI轉(zhuǎn)化向日葵SEA外植體炎^差//浙#灰獲存的轉(zhuǎn)化控#的<于哞炎承的//W4迷/f尸(X4發(fā)證控參W脊差西炎,悉。和負(fù)選擇相比，如表所示，利用正選擇獲得的轉(zhuǎn)基因再生體的數(shù)量顯著不同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在含有潮霉素的培養(yǎng)基中對(duì)外植體的選擇壓力阻礙了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的發(fā)育。并且，觀察到在含有潮霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的外植體長(zhǎng)出的芽是矮小的并且是濕生的。它們不會(huì)生長(zhǎng)發(fā)育為小植物，并且只有很少能夠在延長(zhǎng)培養(yǎng)基中存活。即使在低濃度的潮霉素下再生效率也非常低。看起來(lái)，和潮霉素相比木糖對(duì)外植體具有較低的毒性效果。和潮霉素選擇相比，在含有不同濃度的木糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體表現(xiàn)出較高的發(fā)芽效率。在用木糖異構(gòu)酶進(jìn)行的選擇中獲得的轉(zhuǎn)基因植物的數(shù)量比用潮霉素選擇多3-4倍。優(yōu)化來(lái)增加再生效率Haldrup等人(2001)揭示，在一些作物的正選擇中，和木糖一起使用極少量的蔗糖或其它任意替代碳源能增加選擇和再生效率。為了增加轉(zhuǎn)化的外植體的再生效率，進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化，其中在選擇培養(yǎng)基中聯(lián)合使用了不同濃度的木糖和蔗糖，這樣蔗糖剛夠用于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生存，但是不夠用于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，而能夠利用木糖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將能夠在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和繁殖。用pCAMBIA1301-XI共感染100個(gè)外植體，并置于含有MS鹽、0.2mg/lNAA、2mg/lBAP、250mg/l頭孢噢將(cefotaxime)和瓊脂8g/l、pH5.6的、含有不同的蔗糖和木糖組合的選擇培養(yǎng)基中，在16h光8h暗的光室條件下，在25^C溫度和6()。/o濕度下生長(zhǎng)4周。隨后在含有MS鹽、0.2mg/lNAA、2mg/1BAP、29g/l木糖、lg/1蔗糖、250mg/l頭孢噻肟(cefotaxime)和瓊脂8g/l、pH5.6的第2選擇培養(yǎng)基中對(duì)這些外植體進(jìn)行次培養(yǎng)，生長(zhǎng)3周。將發(fā)育出的小苗轉(zhuǎn)移到含有半濃度的MS鹽、15g/l蔗糖、250mg/l頭孢噻肟和瓊脂8g/l、pH5.6的延長(zhǎng)培養(yǎng)基中。隨后將延長(zhǎng)的嫩枝轉(zhuǎn)到含有1/2MS鹽、0.Olmg/lIBA、30g/l蔗糖、150mg/l頭孢噻肟和8g/l瓊脂、pH5.6的根培養(yǎng)基中。從這些植物中收集葉子樣本，用于分子分析。觀察結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表觀察到的不同木糖和蔗糖組合下的再生炎^差西掙并遂f/參對(duì)灰獲謬W^^控^^^"f"W迷斤戶C^^確定控#時(shí)掙差西炎,悉。觀察到，在含有木糖和蔗糖組合的培養(yǎng)基中外植體再生并生長(zhǎng)良好。在含有5和10g/1蔗糖以及木糖(30g/l)的培養(yǎng)基中可獲得更多數(shù)量的小苗。但是，隨著蔗糖濃度的增加，通過(guò)PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到更多的逃逸。因此發(fā)現(xiàn)對(duì)于正選擇，在第一次選擇中使用25g/l木糖和5g/1蔗糖是最適的。圖8顯示了在木糖(25g/1)+蔗糖(58!11/1)和潮霉素(251^/1)上培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化的、有子葉的葉柄外植體中觀察到的出芽，A)3周選擇后；B)6周選擇后。因此，在芥菜、aruna'中，釆用下面的使用正選擇的芥菜轉(zhuǎn)化和再生操作流程可得到大約35%的轉(zhuǎn)化效率■在70y。乙醇中滅菌種子2分鐘，隨后用0.1%氯化汞處理5分鐘?！鲇脽o(wú)菌水劇烈清洗滅菌的種子4-5次；吸干并置于半MS培養(yǎng)基中。使其在BOD中在25'C下生長(zhǎng)2天，并在光下生長(zhǎng)3天。■切割有子葉的葉柄，避免包含任何葉子原基組織?！鲈?5ml含有利福平(Rifampicin)(10ng/ml)、慶大霉素(Gentamycin)(10jag/ml)、卡夷卩霉素(50jlig/ml)的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2ml過(guò)夜生長(zhǎng)的土壤桿菌培養(yǎng)物GV3101(攜帶有pCAMBIA1301-XI),在28。C下在振蕩器中以200rpm進(jìn)行4-6小時(shí)的指數(shù)生長(zhǎng)，達(dá)到0.D6。。=1.0。在4'C下6000rpm離心細(xì)胞10分鐘，隨后清洗并重懸于含有MS鹽和30g/l蔗糖的液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)菌密度為A6。。0.3-0.5?！鰧⒆尤~柄外植體的葉柄浸入到土壤懸液中10-15秒進(jìn)行感染，并立即置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，葉柄部分插入培養(yǎng)基中?！鲈诤蠱S鹽、0.2mg/lNAA、2mg/1BAP、15g/l蔗糖、8g/1瓊脂、pH5.6的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3天?！龊蠱S鹽、30g/1蔗糖和250mg/1頭孢噻肟、pH5.6的清洗溶液清洗外植體15分鐘，并吸干?！鲈诤蠱S鹽、25g/1木糖、5g/1蔗糖、0.2mg/1NAA、2mg/1BAP、250mg/l頭孢噻肟、8g/l瓊脂，pH5.6的I選擇培養(yǎng)基上次培養(yǎng)4周，光室條件為16小時(shí)亮8小時(shí)暗，25匸、60%濕度?！龊蠱S鹽、29g/l木糖、lg/1蔗糖、0.1mg/1MA、3mg/1BAP、250mg/l頭孢噻肟、8g/1瓊脂，pH5.6的第II選擇培養(yǎng)基上次培養(yǎng)3周，光室條件為16小時(shí)亮8小時(shí)暗，25X:、60%濕度?！鲈诤邪霃?qiáng)度MS鹽、15g/l蔗糖、250mg/l頭孢噻肟、8g/1瓊脂、pH5.6的延長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行1周的次培養(yǎng)，光室條件為16小時(shí)亮8小時(shí)暗，25°C、60%濕度。翻在含有半強(qiáng)度MS鹽、0.01mg/lIBA、30g/l蔗糖、150mg/l頭孢瘞將和8g/l瓊脂、pH5.6的根培養(yǎng)基中次培養(yǎng)，光室條件為16小時(shí)亮8小時(shí)暗，25X:、60%濕度?！鲎詈?，將生根的植物從瓶子中移出，用水清洗根部。將這些植物置于盛有自來(lái)水的瓶子里2天使其變硬，隨后轉(zhuǎn)移到盛有紅土(20%)和金精石(80%)混合物的塑料杯子中，在光室條件下4天。將其轉(zhuǎn)移并保存于溫室中，直到它完全適應(yīng)新環(huán)境，再轉(zhuǎn)移到含有紅土和肥料的盆中。圖9顯示了，在用pCAMBIA+XI構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的外植體中，使用正選擇進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因嫩枝的選擇和再生。開(kāi)始有IOO個(gè)外植體，在用pCAMBIA-13Ql轉(zhuǎn)化后得到2-3林?jǐn)y帶有hpt基因的轉(zhuǎn)基因植物。但是，以相同數(shù)量的外植體開(kāi)始，80-85個(gè)外植體發(fā)芽；在延長(zhǎng)培養(yǎng)基中40個(gè)外植體發(fā)育為小枝，并且大約35林植物生存下來(lái)并生長(zhǎng)為植物，表現(xiàn)出正常的開(kāi)花和種組。完全生長(zhǎng)的T。轉(zhuǎn)基因植物是健康的，并且表現(xiàn)型和對(duì)照植物類(lèi)似。它們產(chǎn)生了相同數(shù)量的、健康的、和未轉(zhuǎn)化種子相同重量的種子(T。。實(shí)施例11控務(wù)^為、f為V^f分別利用1XI引物對(duì)選擇性標(biāo)記基因進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)轉(zhuǎn)化后獲得的T。植物的葉子進(jìn)行篩選。如圖ll所示。木糖異構(gòu)酶陽(yáng)性的芥菜植物的不同階段顯示于圖10。木糖異構(gòu)酶-正向引物5'CTCTCTCGAGCAACCATGGGTGAATTCTTTCC3,木糖異構(gòu)酶-反向引物5，GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT-3"表14.用于木糖異構(gòu)酶基因擴(kuò)增的引物。通過(guò)對(duì)T。轉(zhuǎn)基因植物的種子樣品的XI基因的擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，所有的轉(zhuǎn)基因植物都顯示XI基因整合到它們的基因組中。如圖12所示。因此，我們報(bào)告了使用木糖異構(gòu)酶作為選擇標(biāo)記對(duì)芥菜的成功轉(zhuǎn)化。采用使用木糖異構(gòu)酶(正選擇)的選擇系統(tǒng)得到大約35%的效率，而到目前為止全世界公布的使用除草劑和抗生素抗性基因(負(fù)選擇)的轉(zhuǎn)化效率為15-23%。因此，使用正選擇成功轉(zhuǎn)化了芥菜。使用SC1的木糖異構(gòu)酶進(jìn)行正選擇是一種有效的芥菜外植體轉(zhuǎn)化方法。和傳統(tǒng)的基于抗生素(卡那霉素、潮霉素)和除草劑(草丁膦)的系統(tǒng)相比，這種選擇系統(tǒng)更有效率，并且得到更多數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植物。最后，它還滿足了替代選擇性標(biāo)記的需求，并且避免了因在開(kāi)發(fā)遺傳修飾植物中使用抗生素抗性基因所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境問(wèn)題。培養(yǎng)基組成Murashige和Skoog(MS)鹽1.9g/l跳1.65g/lNH4N03370mg/lMgS04170mg/lKH2P04440mg/lCaCl2.2H2015mg/lMnSO"7H208.6mg/lZnS04.7H206.2nig/lH萬(wàn)0.025mg/lCuSO"5H200.025mg/lCoCl20.83mg/lKI0.025mg/lNa2Mo04.2H2036mg/1Na2EDTA28mg/lFeS04100mg/l肌醇0.1mg/1煙酸1.0mg/1鹽酸硫胺0.1mg/1鹽酸吡,醇MS液MS鹽30g/1蔗糖半MS培養(yǎng)基半MS鹽30g/1蔗糖8g/1瓊脂UriaBartani(LB液體培養(yǎng)基)10g/1胰蛋白胨5g/1酵母提取物10g/1NaCl擴(kuò)增芥菜基因組DNA的PCR條件。■lOOng紐P200|uM引物0.25juMMgCl2mM10X緩沖液2.5|j1Taq聚合酶1U總體積25jj1^增務(wù)斧如T。94°C-3分鐘94°C-1分鐘55°C-1分鐘72°C-1.3分鐘72°C-10分鐘(BangaloreGenei)40個(gè)循環(huán)權(quán)利要求1.一種新型的和改進(jìn)的、基于正選擇和再生方法的生成芥菜(Brassicajuncea)轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)構(gòu)建重組載體，所述載體導(dǎo)入了可分離地與調(diào)節(jié)序列連接的編碼代謝選擇試劑木糖所需要的木糖異構(gòu)酶的核酸序列；(b)土壤桿菌介導(dǎo)的、在優(yōu)化的感染條件下使所述載體進(jìn)入植物細(xì)胞或植物組織的轉(zhuǎn)化方法；(c)在含有步驟(a)的選擇試劑的MS培養(yǎng)基中，從遺傳未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物組織群體中，選擇推測(cè)的轉(zhuǎn)化體的步驟；(d)再生選擇的植物細(xì)胞或組織的步驟。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中使用的植物屬于芥菜物種。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼木糖異構(gòu)酶的核酸序列分離自有機(jī)體裂殖壺菌(Schizochytrium)，并顯示于SEQIDl中。4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸序列，其中至少一種核苷酸序列被修飾，以使在宿主植物外植體中發(fā)生修飾DNA的表達(dá)。5.根據(jù)權(quán)利要求4的核酸序列，其中修飾的序列顯示于SEQID3中。6.表達(dá)的蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列顯示于SEQID2中。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中接受轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織獲自于MS培養(yǎng)基中宿主植物的種子的萌芽后子葉葉柄。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中植物細(xì)胞/組織在用載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化前不能利用木糖作為唯一碳源。9.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化方法，其中用包含編碼木糖代謝所需的酶木糖異構(gòu)酶的核酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化的芥屬植物，其特征在于在轉(zhuǎn)化步驟中使用外植體的分段式共培養(yǎng)，包括(a)通過(guò)切割子葉葉柄來(lái)避免包含任何原基組織來(lái)制備外植體的步驟；(b)用攜帶有所述載體構(gòu)建體的土壤桿菌感染所述外植體10秒，并隨后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的步驟；(c)在28'C、黑暗條件下共培養(yǎng)所述外植體3天的步驟；(d)用含有選擇試劑的選擇培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移外植體的步驟；(e)隨后的將選擇的外植體轉(zhuǎn)移到選擇和延長(zhǎng)培養(yǎng)基中的步驟；(f)進(jìn)一步包括選擇的轉(zhuǎn)化體的再生的步驟。10.根據(jù)上述權(quán)利要求的方法，其特征如下使用已知的篩選分子技術(shù)完成對(duì)再生的小植物中所述選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的驗(yàn)證。11.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中遺傳轉(zhuǎn)化的植物外植體攜帶有包含權(quán)利要求3的核苷酸序列的栽體，其表達(dá)賦予轉(zhuǎn)化的外植體相對(duì)于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝優(yōu)勢(shì)。12.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中根據(jù)通過(guò)權(quán)利要求3的核酸的酶的表達(dá)所產(chǎn)生的利用選擇試劑木糖作為碳源的竟?fàn)幋x優(yōu)勢(shì)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于35%。14.根椐權(quán)利要求l的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于30%。15.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于25%。全文摘要本發(fā)明描述了一種改進(jìn)的產(chǎn)生蕓苔轉(zhuǎn)化體的方法，所述方法是在根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化的芥菜(Brassicajuncea)外植體利用木糖作為唯一碳源的能力對(duì)其進(jìn)行選擇的方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。所述發(fā)明包括了用構(gòu)建的載體對(duì)目標(biāo)宿主植物進(jìn)行土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)酶木糖異構(gòu)酶。還公開(kāi)的是在用所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)獲得木糖作為碳源的代謝優(yōu)勢(shì)之后，選擇推定的轉(zhuǎn)化體的方法。提交的發(fā)明緩解了負(fù)選擇方法的缺點(diǎn)。據(jù)報(bào)，使用木糖異構(gòu)酶進(jìn)行選擇具有穩(wěn)定的34-40％的轉(zhuǎn)化效率。文檔編號(hào)C12N9/90GK101400797SQ200680053937公開(kāi)日2009年4月1日申請(qǐng)日期2006年2月9日優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日發(fā)明者K·R·拉伊亞什里,V·M·帕特爾申請(qǐng)人:阿維沙基因有限公司