一株能夠利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種能夠利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，20世紀(jì)70年代 出現(xiàn)了基因工程技術(shù)。該技術(shù)通過體外將核酸分子插入質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物 質(zhì)的新組合，并在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在新的遺傳背景下得到穩(wěn)定擴(kuò)增和表達(dá)。功能基因的表 達(dá)對研宄其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能及其實(shí)際應(yīng)用十分重要，其可置于不同表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行 表達(dá)。目前，已構(gòu)建了多種用于基因功能研宄、蛋白表達(dá)等的表達(dá)系統(tǒng)，包括大腸桿菌表達(dá) 系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。而能否使目的基因表達(dá)成功，取決于合適 的表達(dá)系統(tǒng)的選擇。酵母是一種低等的單細(xì)胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖 快、便于基因工程操作等特點(diǎn)，同時(shí)又具有真核生物蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等功能。 因此，酵母現(xiàn)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研宄最重要的工具和模型，特別適合表達(dá)真核生物基 因和制備有功能的蛋白質(zhì)。
[0003] 木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源之一，可轉(zhuǎn)化為清潔燃料乙醇、丁醇、大 宗化學(xué)品乳酸、高附加值產(chǎn)品木糖醇、有機(jī)酸類以及微生物菌體蛋白等多種生物基產(chǎn)品，甚 至可用于生產(chǎn)纖維素酶等多種工業(yè)用酶。其有效利用能夠解決社會發(fā)展過程中所遇到的資 源缺乏問題，因而受到人們的廣泛關(guān)注。木糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖 的一種單糖，其高效率生物轉(zhuǎn)化與利用是影響木質(zhì)纖維素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。
[0004] 目前，已發(fā)現(xiàn)多種酵母能夠利用甚至發(fā)酵木糖，其中研宄較多的有樹干畢赤酵母、 休哈塔假絲酵母、嗜鞣管囊酵母等。經(jīng)過多年的研宄，酵母利用木糖的代謝機(jī)制逐漸清晰， 相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也在不斷完善，使得基于基因表達(dá)、基因敲除等手段的基因工程技術(shù)在 該類酵母中的應(yīng)用成為可能。一方面可通過構(gòu)建工程菌提高底物如木糖的轉(zhuǎn)化效率，增加 目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；另一方面可通過構(gòu)建工程菌使其能夠以纖維質(zhì)原料為底物生產(chǎn)重要 生物基產(chǎn)品如氨基酸、酶等。
[0005] Candida jeffriesii是新分離的能夠利用木糖的酵母，系統(tǒng)發(fā)育分析表 明該酵母和另一株能夠高效利用木糖的酵母Spathaspora passalidarum互成姐妹 群（NGUYEN N H，SUH S 0,MARSHALL C J，et al. Morphological and ecological similarities:wood-boring beetles associated with novel xylose-fermenting yeasts, Spathaspora passalidarum gen.sp. nov. and Candida jeffriesii sp.nov. Mycol Res, 2006, 110 (Pt 10) :1232-1241)。目前 Candida jeffriesii 基因水平上的研 宄尚處于起步階段，急需一個(gè)可適用的遺傳表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行更深入的研宄。盡管市面 上有多種應(yīng)用于釀酒酵母、畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體，但該酵母屬于利用木糖類 酵母，使用特殊的基因編碼系統(tǒng)，密碼子CUG編碼絲氨酸而非亮氨酸（Wohlbach DJ, Kuo A,Sato TK,Potts KM, Salamov AA, Labutti KM, Sun H, Clum A, Pangilinan JL, Lindquist EA, Lucas S,Lapidus A, Jin M,Gunawan C, Balan V, Dale BE, Jeffries Tff, Zinkel R, Barry Kff, Grigoriev IV, Gasch AP. Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108 (32) :13212-13217.),因此上述常規(guī)表達(dá)載體很 難通過修飾來適用于該酵母表達(dá)系統(tǒng)中。
[0006] 因此，有必要構(gòu)建適用于Candida jeffriesii自身的基因表達(dá)系統(tǒng)，在此基礎(chǔ)上， 可采用該基因表達(dá)系統(tǒng)對Candida jeffriesii進(jìn)行基因工程改造或在該表達(dá)系統(tǒng)基礎(chǔ)上 挖掘Candida jeffriesii的優(yōu)良基因信息，為構(gòu)建新型酵母基因工程菌和篩選新型優(yōu)良基 因，如纖維二糖酶基因等，奠定基礎(chǔ)，同時(shí)通過基因工程手段使Candida jeffriesii利用木 糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人類有用產(chǎn)品，建立可再生資源循環(huán)利用的生物加工工藝成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一株能夠利用木糖的酵母 Candida jeffriesii的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)在Candida jeffriesii中的 整合型穩(wěn)定表達(dá)，對木糖利用酵母Candida jeffriesii的基礎(chǔ)理論研宄及產(chǎn)品開發(fā)具有重 要的意義。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明一方面涉及一株能夠利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表達(dá)系統(tǒng)，包 括一種新型表達(dá)載體，其為環(huán)狀，從5' -3'依次可操作性地連接有以下元件：
[0010] pMD19-Tsimple質(zhì)粒骨架、rDNA同源重組序列、外源基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因 表達(dá)盒；
[0011] 所述外源基因表達(dá)盒自上游至下游依次包括啟動子、外源基因插入酶切位點(diǎn)以及 轉(zhuǎn)錄終止子；
[0012] 所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括啟動子、抗生素抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止子。
[0013] 所述能夠利用木糖的酵母為Candida jeffriesii。
[0014] 所述的表達(dá)載體中的外源基因表達(dá)盒啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序列來自酵母 Spathaspora passalidarum，該酵母全基因組序列在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中的編號為ΝΖ_ΑΕΙΚ00000000,其中所述酵母可為來自美國農(nóng)業(yè)研宄菌種保藏中心 的細(xì)胞株NRRL Y-27907。
[0015] 優(yōu)選的，所述的rDNA同源重組序列為18s rDNA，序列如SEQ ID NO: 1所示。另一個(gè) 選擇是，所述的rDNA序列與SEQ ID N0:1的相似性不低于90%，優(yōu)選為95%，更優(yōu)為98%。
[0016] 所述外源基因表達(dá)盒中的啟動子包括SpADHP、SpXYLp;轉(zhuǎn)錄終止子包括SpCYCl τ、 SpXYLT。
[0017] 所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中的啟動子包括SpTEFlp;抗生素抗性基因可以是表達(dá) 載體中常用的，包括潮霉素抗性基因、博來霉素抗性基因、G418 ;轉(zhuǎn)錄終止子包括SpCYClT、 ScCYClT〇
[0018] 所述的SpADHp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的乙醇脫氫酶基因 ADHl 啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0019] 所述的SpXYLp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的木糖還原酶基因 XYL 啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
[0020] 所述的SpTEFlp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的轉(zhuǎn)錄起始因子基因 TEFl啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
[0021] 所述的SpCYClT終止子為Spathaspora passalidarum來源的細(xì)胞色素 C基因 CYCl 終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示；
[0022] 所述的SpXYLT終止子為Spathaspora passalidarum來源的木糖還原酶基因 XYL 終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID N0:6所示。
[0023] 所述的ScCYCI1JS止子為Saccharomyces cerevisiae來源的細(xì)胞色素 C基因 CYCl 終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0024] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和篩選標(biāo)記基因，所述外源基因插 入所述外源基因表達(dá)盒中啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述外源 基因?yàn)間fp基因，該基因的DNA序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0025] 所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中可包括一個(gè)以上的標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因可為潮 霉素 B抗性基因、博來霉素抗性基因和/或G418;在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基 因是潮霉素 B抗性基因。
[0026] 所述的潮霉素 B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
[0027] 所述的博來霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
[0028] 所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0029] 本發(fā)明所使用的酵母為一株能夠利用木糖的酵母Candida jeffriesii。具體的， 該酵母購自美國農(nóng)業(yè)研宄菌種保藏中心，保藏編號為NRRL Y-27738。
[0030] 具體而言，發(fā)明人按照下述技術(shù)方案制備得到了新型表達(dá)載體：
[0031] 以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得18s rDNA同源重組序列；以引物P23和P24進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpTEFlp啟動子；以 引物P25和P26進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpADHl p啟動子；以引物P27和P28進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 SpXYLp啟動子；以引物P29和P30進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpCYCl^止子；以引物P31和P32進(jìn) 行PCR擴(kuò)增獲得SpXYL t終止子。以PMD-hph m質(zhì)粒DNA為模板，以引物P21和P22進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得片段hphm-ScCYClT。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示，所 述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO. 33-44所示。
[0032] 以pMD19-Tsimple為骨架，將上述各片段連接，所述連接是在適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?位點(diǎn)上進(jìn)行的。具體連接方式為：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位點(diǎn)連接18s rDNA后，沿 著18s rDNA的方向依次連接外源基因表達(dá)盒啟動子、外源基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄終止子、SpTEFlp 啟動子、hph^-ScCYClp
[0033] 酵母基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，選擇合