適的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外 源蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。本發(fā)明提供了可供外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子組合， 包括 SpADHP-SpCYClT、SpXYLP-SpCYClT、SpADH P-SpXYLT、SpXYLP-SpXYLT、SpTEFl P-SpCYClT、、 SpXYLP-SpXYLT。
[0034] 所述啟動(dòng)子根據(jù)以下方法預(yù)測(cè)獲得：
[0035] (1)根據(jù)Spathaspora passalidarum基因組序列，選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟 動(dòng)子所屬基因與上一個(gè)基因的開放閱讀框之間的所有核苷酸片段；
[0036] (2)采用啟動(dòng)子在線測(cè)評(píng)軟件，對(duì)可能的啟動(dòng)子序列進(jìn)行在線預(yù)測(cè)；
[0037] (3)根據(jù)高評(píng)分值的潛在啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得待測(cè)啟動(dòng)子序列。
[0038] 所述終止子根據(jù)以下方法獲得：
[0039] (1)根據(jù)Spathaspora passalidarum基因組序列，選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的終 止子所屬基因的開放閱讀框后約300bp作為待測(cè)終止子序列。
[0040] (2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得所述待測(cè)終止子。
[0041] 所述外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子組合用于外源基因的功能表達(dá)。在實(shí)施 例中，gfp基因插入所述外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間。
[0042] 所述的基因表達(dá)載體整合于所述Candida jeffriesii宿主菌的基因組中。
[0043] 所述Candida jeffriesii宿主菌是（但不限于）來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研宄菌種保藏中 心的細(xì)胞株NRRL Y-27738。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述Candida jeffriesii宿主菌為來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研宄 菌種保藏中心的 Candida jeffriesii NRRL Y-27738。
[0045] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方 法，包括以下步驟：
[0046] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建：
[0047] 根據(jù)酵母 Spathaspora passalidarum 全基因組序列，調(diào)取 Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作為同源重組位點(diǎn)。以Spathaspora passalidarum基因 組DNA為模板，以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得18s rDNA同源重組序列，同時(shí)在片段上 游引入酶切位點(diǎn)EcoR I，下游引入酶切位點(diǎn)Bgl II、BamH I和Kpn I。將PCR產(chǎn)物純化后 克隆至質(zhì)粒pMD19-Tsimple，獲得重組質(zhì)粒pMD-18srDNA。
[0048] 以PMD-hphm質(zhì)粒DNA為模板，以引物P21和P22進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得片段 hph^-ScCYCh，同時(shí)在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I。將純化的PCR產(chǎn)物和重 組質(zhì)粒pMD-18s rDNA分別用BamH I和Kpn I雙酶切，酶切產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì)粒PR-hphm。
[0049] 以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，以引物P23和P24進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得SpTEFlp啟動(dòng)子，同時(shí)在片段兩端引入酶切位點(diǎn)BamH I和Pst I。將純化的PCR產(chǎn) 物和重組質(zhì)粒PR-hphm分別用BamH I和Pst I雙酶切，酶切產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì)粒PRTH。
[0050] 以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，以引物P25和P26進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得SpADHp啟動(dòng)子；以引物P27和P28進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpXYL p啟動(dòng)子；同時(shí)在片段的 上游引入酶切位點(diǎn)Bgl II，下游引入酶切位點(diǎn)Sal I和BamH I。將純化的PCR產(chǎn)物和重組 質(zhì)粒PRTH分別用Bgl II和Sal I雙酶切，將酶切的重組質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì) 粒 PRATH 和 PRXTH。
[0051] 以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，以引物P29和P30進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得SpCYClj#止子；以引物P31和P32進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpXYL τ終止子。在片段上游 引入酶切位點(diǎn)Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位點(diǎn)BamH I。將純化的PCR產(chǎn)物和重 組質(zhì)粒PRATH與PRXTH分別用Sal I和BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物連接獲得PR系列重組質(zhì) 粒 PRACTH、PRAXTH、PRXCTH 和 PRXXTH。
[0052] 所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示。
[0053] 所述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO. 33-44所示。
[0054] 宿主菌Candida jeffriesii的活化與培養(yǎng)。
[0055] PR系列重組質(zhì)粒在宿主菌Candida jeffriesii中的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0056] 宿主菌Candida jeffriesii陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選。
[0057] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述表達(dá)載體是重組 質(zhì)粒PRACTH，其中外源基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子和終止子分別為SpADH p和SpCYCl τ。
[0058] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述表達(dá)載體是重組 質(zhì)粒PRAXTH，其中外源基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子和終止子分別為SpADH p和SpXYL τ。
[0059] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述表達(dá)載體是重組 質(zhì)粒PRXCTH，其中外源基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子和終止子分別為SpXYL p和SpCYCl τ。
[0060] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述表達(dá)載體是重組 質(zhì)粒PRXXTH，其中外源基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子和終止子分別為SpXYL p和SpXYL τ。
[0061 ] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法包 括PEG-LiAC轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是PEG-LiAC轉(zhuǎn)化法。
[0062] 所述Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述宿主菌Candida jeffriesii轉(zhuǎn)化子篩選方法為抗性平板篩選，對(duì)經(jīng)過(guò)初步篩選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR或基 因組PCR檢測(cè)，并最終通過(guò)檢測(cè)外源蛋白活性或代謝產(chǎn)物的方法確定轉(zhuǎn)化子。
[0063] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)外源基因的方法，包括如下步驟：
[0064] (1)提供所述的整合型Candida jeffriesii基因表達(dá)系統(tǒng)；
[0065] (2)將外源基因插入所述表達(dá)載體的外源基因插入酶切位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載 體；
[0066] (3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌Candida jeffriesii并在宿主菌中表達(dá)所 述外源基因。
[0067] 本發(fā)明還提供了一種代謝工程改造宿主菌Candida jeffriesii的方法，包括如下 步驟：
[0068] (1)提供權(quán)利要求1所述的整合型Candida jeffriesii表達(dá)系統(tǒng)；
[0069] (2)將目標(biāo)基因插入所述表達(dá)載體的外源基因插入酶切位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)載 體；
[0070] (3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌Candida jeffriesii并在宿主菌中表達(dá)所 述目標(biāo)基因；
[0071] (4)培養(yǎng)所述重組菌，檢測(cè)所述重組菌代謝產(chǎn)物。
[0072] 發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0073] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0074] 1、本發(fā)明所使用的酵母是一株新型利用木糖的酵母，具有高效的木糖利用能力和 較強(qiáng)的乙醇生產(chǎn)能力，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景和價(jià)值。然而該酵母屬于利用木糖類假絲 酵母，而該類酵母使用特殊的基因編碼系統(tǒng)，密碼子CUG編碼絲氨酸而非亮氨酸，因此市面 上應(yīng)用于釀酒酵母、畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體無(wú)法適用于該木糖利用酵母。鑒于此， 本發(fā)明人構(gòu)建了適用于該酵母自身的一系列新型表達(dá)載體，采用該系列表達(dá)載體，可方便 地對(duì)該酵母進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)和代謝工程改造。
[0075] 2、本發(fā)明提供了用其他DNA分子轉(zhuǎn)化Candida jeffriesii的方法，所述的DNA分 子可來(lái)自在上述載體啟動(dòng)子和終止子之間連接Candida jeffriesii基因組片段所構(gòu)成的 文庫(kù)中或合成的DNA分子。本發(fā)明從而可提供，能夠用于表達(dá)基因多樣性文庫(kù)，產(chǎn)生能夠從 中篩選新的生物活性物質(zhì)的產(chǎn)品的技術(shù)。
[0076] 3、本發(fā)明所述的整合型表達(dá)載體中，嘗試采用多個(gè)rDNA序列作為整合位點(diǎn)，但僅 有其中一個(gè)序列表現(xiàn)出整合效應(yīng)，該序列為18s rDNA的部分序列，且該位點(diǎn)表現(xiàn)出拷貝數(shù) 高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，使得該系列整合型表達(dá)載體成為能夠適用于Candida jeffriesii表 達(dá)外源蛋白及代謝工程改造的酵母多拷貝整合型表達(dá)載體。
[0077] 4、本發(fā)明所構(gòu)建的新型表達(dá)載體中，對(duì)所使用的潮霉素 B抗性基因、博來(lái)霉素抗 性基因等抗性基因開放閱讀框中多個(gè)CUG密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變?yōu)閁UG，對(duì)報(bào)告基因 gfp開放閱讀框中的CUG密碼子進(jìn)行了定點(diǎn)突變，突變?yōu)閁UG，從而實(shí)現(xiàn)了該系列新型表達(dá) 載體在酵母Candida jeffriesii中的有效轉(zhuǎn)化和功能性表達(dá)。
【附圖說(shuō)明】
[0078] 圖1為實(shí)施例1的定點(diǎn)突變后hph基因 CDS序列（IMJ表示定點(diǎn)突變位點(diǎn)）；
[0079] 圖2為實(shí)施例4的定點(diǎn)突變后gfp基因 CDS序列[Ml·表示定點(diǎn)突變位點(diǎn)）；
[0080] 圖3為實(shí)施例4的綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒PRACTH-gfpm的質(zhì)粒圖譜；
[0081] 圖4為實(shí)施例4的為菌綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證圖（M為Maker， 泳道1-9為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增結(jié)果，泳道10為陰性對(duì)照）；
[0082] 圖5為實(shí)施例4的綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒PRACTH-gfPni轉(zhuǎn)化Candida jeffriesii 及GFP熒光顯微鏡檢測(cè)（左圖為暗場(chǎng)，右圖為明場(chǎng)）。
【具體實(shí)施方式】
[0083] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用 于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本 發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均視為落入本發(fā)明的范圍。
[0084] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本都按照常用克隆手冊(cè)或制造商所 建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常 規(guī)產(chǎn)品。
[0085] 除非在本文中另作限