一種選擇標(biāo)記可循環(huán)的釀酒酵母整合型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到基因工程和代謝工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及到一種選擇標(biāo)記 可循環(huán)利用的釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法，可以廣泛應(yīng)用到釀酒酵母中較長(zhǎng)途徑多基因 的整合.
【背景技術(shù)】
[0002] 由于釀酒酵母在生理生化，高密度發(fā)酵，和遺傳操作上的諸多優(yōu)良特性，許多研宄 都選擇釀酒酵母作為宿主菌，將外源的代謝途徑導(dǎo)入到釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行高附加值化合 物的生物合成。但是在釀酒酵母中組建能進(jìn)行穩(wěn)定遺傳的多基因代謝途徑仍然是代謝工程 中的一大挑戰(zhàn)。
[0003] 目前，在釀酒酵母中進(jìn)行基因的過(guò)表達(dá)主要采用的是傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記型載 體。其中包括含2 μ復(fù)制原點(diǎn)的高拷貝和CEN/ARS單拷貝的自主復(fù)制型載體，以及缺少?gòu)?fù) 制原點(diǎn)，攜帶釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記的釀酒酵母整合型載體（yeast integrated plasmid， ?Ρ)。
[0004] 上述載體曾經(jīng)在酵母基因功能驗(yàn)證工作中發(fā)揮了很大作用，但將其用于代謝途 徑，特別是含有多個(gè)基因的長(zhǎng)代謝途徑的構(gòu)建將存在以下問(wèn)題：一方面，代謝途徑所選擇的 目標(biāo)菌株必須是有著多個(gè)營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記點(diǎn)位點(diǎn)突變的菌株，當(dāng)工業(yè)發(fā)酵菌株用作宿主菌株 進(jìn)行改造時(shí)，該方法將不適應(yīng)。另一方面，上述載體一般進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化只能整合進(jìn)一個(gè)基 因，構(gòu)建長(zhǎng)代謝途徑時(shí)操作步驟將較為繁瑣。此外，基于附著型載體構(gòu)建代謝途徑的方法存 在遺傳不穩(wěn)定的弊端。質(zhì)粒在酵母中的傳代復(fù)制需要相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基，質(zhì)粒之間存 在相互干擾和不可預(yù)期的重組，并且，多個(gè)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)共存也會(huì)對(duì)細(xì)胞的生產(chǎn)造成負(fù)擔(dān)； 而通過(guò)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記位點(diǎn)整合的YIP型載體在構(gòu)建代謝途徑的過(guò)程中由于是采用多次的染色 單交換，存在大量的長(zhǎng)的重復(fù)片段，會(huì)對(duì)所構(gòu)建菌株的穩(wěn)定性造成不良影響，多次傳代后， 一些位點(diǎn)的片段會(huì)出現(xiàn)丟失。
[0005] KanMX在釀酒酵母中表達(dá)可賦予其對(duì)遺傳霉素（G418)的抗性，該標(biāo)記的使 用可避免營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記的使用。通過(guò)將KanMX與loxp/Cre重組系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建的 loxp-kanMX-loxp結(jié)構(gòu)可反復(fù)用釀酒酵母的基因敲除。目前該表達(dá)盒也被作為選擇標(biāo)記用 于外源基因的整合。其基本過(guò)程為：將含有l(wèi)oxp-kanMX-loxp的片段與目標(biāo)基因表達(dá)合及 基因組整合位點(diǎn)的上下游進(jìn)DNA片段進(jìn)行重疊延伸PCR ;得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化釀酒酵母并 篩選出陽(yáng)性克隆后，再在釀酒酵母中轉(zhuǎn)入一個(gè)能表達(dá)Cre重組蛋白的質(zhì)粒，誘導(dǎo)Ioxp位點(diǎn) 間的重組；通過(guò)平板影印法篩選到KanMX丟失的菌株；再通過(guò)釀酒酵母的連續(xù)傳代培養(yǎng)，得 到Cre質(zhì)粒丟失的菌株，以進(jìn)行下一輪的整合。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)使用同一個(gè)選 擇標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行回收，以實(shí)現(xiàn)選擇標(biāo)記的重復(fù)利用。但該方法最大的缺點(diǎn)在于：整個(gè)過(guò) 程繁瑣復(fù)雜，且多次PCR容易引入突變，后續(xù)的Cre蛋白誘導(dǎo)的Ioxp位點(diǎn)重組可能會(huì)導(dǎo)致 染色體上已存在的Ioxp位點(diǎn)的錯(cuò)位重組，造成染色體重排。因此，該策略也并不適合用于 釀酒酵母的多基因代謝途徑的整合。
[0006] 釀酒酵母中URA3基因編碼一個(gè)乳清酸-5-磷酸脫羧酶，可以將5-氟乳清酸轉(zhuǎn)變 成5-氟尿嘧啶，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。利用URA3該特性，通過(guò)在其基因兩 側(cè)加入正向重復(fù)序列后可利用URA3進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選并利用其特殊的化學(xué)反應(yīng)對(duì)其進(jìn) 行去除，從而實(shí)現(xiàn)釀酒酵母中多個(gè)基因的逐步敲除。但它依賴于營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選，無(wú)法應(yīng)用于 全基因酵母工程菌。另外，與loxp-kanMX-loxp類似，同樣存在需要復(fù)雜多步驟的PCR過(guò)程 及每次引入基因的數(shù)目有限等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服目前的釀酒酵母表達(dá)載體在多基因代謝途徑組裝上存在 的遺傳不穩(wěn)定，表達(dá)效率不高，途徑構(gòu)建復(fù)雜，依賴營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記等缺點(diǎn)，提供一種選擇 標(biāo)記可循環(huán)的釀酒酵母整合型表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的是結(jié)合KanMX篩選 的優(yōu)點(diǎn)和URA3在選擇標(biāo)記回收上的便捷性，提供一套操作簡(jiǎn)單，遺傳穩(wěn)定，表達(dá)效率高的 pUMRI載體，并將其應(yīng)用于釀酒酵母代謝工程及合成生物學(xué)研宄。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0009] 一種選擇標(biāo)記可循環(huán)的釀酒酵母整合型表達(dá)載體，包括
[0010] loxp-KanMX-URA-PBR322 復(fù)制子-Loxp (SEQ ID NO :1)，
[0011] 酵母基本表達(dá)盒，為任意酵母啟動(dòng)子-多克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止子，
[0012] 同源臂可插入?yún)^(qū)段。
[0013] 進(jìn)一步，所述同源臂可插入?yún)^(qū)段具有至少一個(gè)罕見酶切位點(diǎn)。
[0014] 優(yōu)選的，所述罕見酶切位點(diǎn)為sfil。
[0015] 進(jìn)一步，罕見酶切位點(diǎn)可插入任意對(duì)菌體生長(zhǎng)、代謝沒有顯著影響的可敲除序列 或其他未發(fā)現(xiàn)序列。
[0016] 進(jìn)一步，所述表達(dá)載體的模式質(zhì)粒包括loxp-KanMX-URA-PBR322復(fù)制 子-Loxp(SEQ ID N0:1)，TCYC1-MCS2-PGAL1-PGAL10-MCS1-TADH1(SEQ ID N0:4)〇
[0017] 進(jìn)一步，所述模式質(zhì)粒的核苷酸序列為SEQ ID NO :5。
[0018] 進(jìn)一步，所述模式質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0019] 步驟一，設(shè)計(jì)合成 loxp-KanMX-URA-PBR322 復(fù)制子-Loxp(SEQ ID NO :1);
[0020] 步驟二，運(yùn)用PCR的方法擴(kuò)增出雙表達(dá)盒區(qū)段TCYC1-MCS2-PGAL1-PGAL10-MCS1-T ADHl(SEQIDN0 :4)，將其拼接到loxp-KanMX-URA-Loxp-PBR322復(fù)制子-2μ復(fù)制子基因片 段上，形成環(huán)狀質(zhì)粒，得到核苷酸序列為SEQ ID NO :5的模式質(zhì)粒。
[0021] 優(yōu)選的，步驟二所用引物為序列分別為SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3。
[0022] 本發(fā)明還提供一種一種上述的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0023] 步驟a :將需要整合的基因克隆到載體的表達(dá)多克隆區(qū)段；
[0024] 步驟b :將需要敲除的基因片段或者整合位點(diǎn)片段克隆到同源臂插入?yún)^(qū)段；
[0025] 步驟c :將目的載體線性化；
[0026] 步驟d :線性化載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母宿主菌，在含有G418抗性的YH)平板上篩選陽(yáng) 性克??；
[0027] 步驟e :挑取陽(yáng)性克隆菌株接種于YH)試管，培養(yǎng)12-24小時(shí)后，取部分菌液涂布 于含有五氟尿嘧啶的SD平板上，進(jìn)行篩選；
[0028] 步驟f :含有氟尿嘧啶的SD平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌株為整合了目的基因，并將選擇性 標(biāo)記去除了的菌株，可直接用于下一步的整合。
[0029] 此外本發(fā)明還提供上述表達(dá)載體作為穿梭質(zhì)粒的作用，實(shí)現(xiàn)目的基因在大腸桿菌 中的克隆和釀酒酵母中的快速整合。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的表達(dá)載體具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0031] 1)可作為穿梭質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)目的基因在大腸桿菌中的克隆和釀酒酵母中的快速整 合。
[0032] 2)可用于酵母酵母中多個(gè)基因的一次性整合。
[0033] 3)可實(shí)現(xiàn)G418抗性篩選標(biāo)記的重復(fù)多次利用。
[0034] 4)非營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，可用于全基因酵母工程菌中基因的整合。
[0035] 5)可用于較長(zhǎng)途徑多基因的快速整合，實(shí)現(xiàn)敲除式敲入的基因整合。
[0036] 該方法可廣泛應(yīng)用于任意全基因釀酒酵母或其他釀酒酵母菌株，具有很好的普適 性和創(chuàng)新性。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為PUMRI-21質(zhì)粒圖譜。
[0038] 圖2為Maker去除平板篩選驗(yàn)證圖。
[0039] 圖3為Maker去除前后菌落per基因型驗(yàn)證。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0041] 實(shí)施例I :PUMRI-21模式質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 1)利用DNA化學(xué)合成的方法，合成loxp-KanMX-URA-PBR322復(fù)制子-Loxp區(qū)段， 如SEQ ID NO :1所示。該序列中包含了優(yōu)化設(shè)計(jì)的2個(gè)loxp，G418抗性表達(dá)合，釀酒酵母 URA3表達(dá)盒，PBR322復(fù)制原點(diǎn)。
[0043] 2)利用引物 ADHUF2 和 CYCltR2 從商業(yè)化載體 PESC-URA (GenBank :AF〇63585· 2) 上擴(kuò)增出雙表達(dá)盒區(qū)段（共1351bp)并進(jìn)行凝膠回收。其引物序列如下：
[0044] ADHltF2 ：
[0045] CACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGGCCTTGTAGGCCTCTTCGCTATTACGCC(SEQ ID NO ：2)
[0046] CYCltR2 ：
[0047] GACTCACTATAGGGCGAATTGGGATCTTCGAGCGTCCCAA(SEQ ID NO ：3)
[0048] PCR 體系為：總體系 25ul，其中水 16·25μ1，buffer 5μ1，dNTPs 2μ1，基因組 0.5 μ 1，引物各 0