專(zhuān)利名稱(chēng)：新的腸球菌和鏈球菌菌株及細(xì)菌素的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及通過(guò)使用新的產(chǎn)細(xì)菌素的腸球菌和鏈球菌菌株和/或由這些菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素控制動(dòng)物、特別是家禽中的疾病。本發(fā)明還涉及新細(xì)菌素，所述新細(xì)菌素的氨基酸序列，以及涉及生產(chǎn)所述新細(xì)菌素的腸球菌或鏈球菌，并涉及乳球菌屬的誘導(dǎo)者菌株。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及含有所述新細(xì)菌素和/或生產(chǎn)它們的腸球菌或鏈球菌的治療組合物，以及所述治療組合物的應(yīng)用。
相關(guān)領(lǐng)域描述
食用未正確處理的家禽產(chǎn)品已經(jīng)導(dǎo)致人的腸疾病。早已認(rèn)識(shí)到沙門(mén)氏菌(Salmonella spp.)是這類(lèi)疾病的致病菌，最近認(rèn)識(shí)到彎曲桿菌(Campylobacter spp.)，特別是空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)也被牽連其中。這兩種微生物都可以定植于家禽的胃腸道中，而對(duì)這些鳥(niǎo)類(lèi)沒(méi)有任何有害效果，雖然一些已被定植的鳥(niǎo)類(lèi)可以被檢測(cè)到，但無(wú)癥狀的帶菌者可以在生產(chǎn)和處理過(guò)程中自由傳播這些微生物，導(dǎo)致進(jìn)一步感染活的鳥(niǎo)類(lèi)和尸體。家禽在食物供應(yīng)中作為沙門(mén)氏菌和彎曲桿菌的原始貯主(Jones等，Journalof Food Protection(食品保護(hù)雜志)，第54卷，No.7，502-507，1991年7月)。在養(yǎng)成生產(chǎn)期間預(yù)防在活家禽中的定植可以消除家禽污染的問(wèn)題。

許多因素促成細(xì)菌在動(dòng)物消化道內(nèi)的定植和繼續(xù)存在。這些因素已被Savage(Progress in Food and Nutrition Science(食品和營(yíng)養(yǎng)科學(xué)進(jìn)展)，第7卷，65-74，1983)詳盡地評(píng)述。在這些因素中所包括的是(1)胃酸度(Gilliland，Journal of Food Production(食品生產(chǎn)雜志)，第42卷，164-167，1979)；(2)膽汁鹽(Sharpe和Mattick，Milchwissenschaft，第12卷，348-349，1967；Floch等，American Journal of Clinical Nutrition(美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)，第25卷，1418-1426，1972；Lewis和Gorbach，Archives of InternalMedicine(內(nèi)科學(xué)檔案)，第130卷，545-549，1972；Gilliland和Speck，Journal of FoodProtection(食品保護(hù)雜志)，第40卷，820-823，1977)；Hugdahl等，Infection and Immunity(感染和免疫)，第56卷，1560-1566，1988)；(3)蠕動(dòng)；(4)消化酶(Marmur，Journalof Molecular Biology(分子生物學(xué)雜志)，第3卷，208-218，1961)；(5)免疫響應(yīng)；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它們生產(chǎn)的抗菌化合物。前四種因素取決于宿主的表現(xiàn)型，可能不是實(shí)際上可控的變量。胃腸(GI)道的免疫響應(yīng)不易調(diào)節(jié)。涉及本源微生物及其代謝物的因素取決于GI道的正常菌群。

控制彎曲桿菌和/或沙門(mén)氏菌的定植的一種可能的方法是通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)性排斥(CE)。Nurmi和Rantala(Nature(自然)，第241卷，210-211，1973)證明通過(guò)將來(lái)自健康家禽腸內(nèi)物質(zhì)的細(xì)菌管飼給微生物群落還沒(méi)有建成的年幼的雛雞(chick)抵抗沙門(mén)氏菌定植，有效控制沙門(mén)氏菌的感染。給雛雞施用不確定的CE制備物加速新孵出鳥(niǎo)類(lèi)的消化道菌群的成熟，并提供由成年雌禽向其后代傳送微生物群落的自然過(guò)程的替代者。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)地調(diào)查的結(jié)果提供通過(guò)給雛雞施用正常微生物群落控制彎曲桿菌的優(yōu)點(diǎn)的證據(jù)；降低的鳥(niǎo)群受彎曲桿菌感染的頻率(Mulder和Bolder，INColonization Control of human bacterialenteropathogens in poultry(家禽中人細(xì)菌性腸道病原體的定植控制)；L.C.Blankenship(編)，Academic Press，加利福尼亞圣地亞哥，359-363，1991)以及降低的被定植的鳥(niǎo)類(lèi)的糞便中空腸彎曲桿菌(C.jejuni)水平已有報(bào)道(Stern，Poultry Science(家禽科學(xué))，第73卷，402-407，1994)。

Schoeni和Wong(Appl.Environ.Microbiol.，第60卷，1191-1197，1994)報(bào)道了通過(guò)一起應(yīng)用碳水化合物添加劑和三種已被識(shí)別的拮抗劑(差異檸檬酸桿菌(Citrobacterdiversus)22，克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)23和大腸桿菌(Escherichia coli)25)顯著減少了肉仔雞(broiler)中空腸彎曲桿菌的定植。也有在用嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)和屎鏈球菌(Streptococcus faecium)的家禽分離培養(yǎng)物治療以后，感染肉仔雞的腸內(nèi)樣品中空腸彎曲桿菌顯著減少的證據(jù)(Morishita等，Avian Diseases(禽類(lèi)疾病)，第41卷，850-855，1997)。

Snoeyenbos等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,335,107，1982年6月)通過(guò)凍干糞便并厭氧培養(yǎng)這種制備物開(kāi)發(fā)了預(yù)防沙門(mén)氏菌定植的競(jìng)爭(zhēng)性排斥(CE)微生物群落技術(shù)。Mikola等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,657,762，1987年4月)用腸道糞便和盲腸內(nèi)容物作為CE微生物群落源用于預(yù)防沙門(mén)氏菌定植。Stern等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,451,400，1995年9月和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,241,335，2001年4月)公開(kāi)一種粘膜CE組合物以保護(hù)家禽和家畜抵抗沙門(mén)氏菌和彎曲桿菌的定植，其中預(yù)先洗滌的盲腸的粘蛋白層被刮下，被刮下的刮屑保持在無(wú)氧環(huán)境中，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。Nisbet等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,478,557，1996年12月)公開(kāi)了一種確定的益生菌，其可以得自各種家養(yǎng)動(dòng)物，是通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)直接由成年目標(biāo)動(dòng)物的糞便、盲腸和/或大腸內(nèi)容物產(chǎn)生的分批培養(yǎng)物獲得的。

微生物生產(chǎn)多種證明有抗細(xì)菌性質(zhì)的化合物。一類(lèi)這樣的化合物，細(xì)菌素，由殺菌蛋白組成，其作用機(jī)制類(lèi)似于離子載體抗生素。細(xì)菌素通常具有抵抗與其生產(chǎn)者密切相關(guān)的菌種的活性。它們?cè)谟蓮?fù)雜微生物種群，例如腸道，口腔或其他上皮表面分離出的細(xì)菌菌種中的廣泛存在表明細(xì)菌素可能在細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的種群動(dòng)態(tài)方面具有調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌素被定義為由細(xì)菌生產(chǎn)的具有生物活性蛋白部分和殺菌作用的化合物(Tagg等，Bacteriological Reviews(細(xì)菌學(xué)評(píng)論)，第40卷，722-256，1976)。其他特性可以包括；(1)窄譜抑制活性，集中于密切相關(guān)的菌種；(2)與特定的細(xì)胞受體結(jié)合；以及(3)質(zhì)粒攜帶細(xì)菌素生產(chǎn)和宿主細(xì)胞細(xì)菌素免疫性的遺傳決定簇。不完全確定的拮抗性物質(zhì)被稱(chēng)為“細(xì)菌素樣物質(zhì)”。一些有效對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌、相反不對(duì)抗革蘭氏陰性菌的細(xì)菌素，具有較廣譜的活性。已有建議術(shù)語(yǔ)細(xì)菌素，當(dāng)用于描述由革蘭氏陽(yáng)性菌生產(chǎn)的抑制劑時(shí)，應(yīng)滿(mǎn)足(1)是一種肽和(2)具有殺菌活性的最低標(biāo)準(zhǔn)(Tagg等，同上)。

乳酸細(xì)菌是最重要的益生菌微生物之一。它們是革蘭氏陽(yáng)性的，不產(chǎn)生孢子的，過(guò)氧化氫酶陰性的缺乏細(xì)胞色素的生物。它們是厭氧但耐氧的、有復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)要求的、耐酸的以及嚴(yán)格可發(fā)酵的，并以乳酸作為糖發(fā)酵的主要終產(chǎn)物。產(chǎn)乳酸細(xì)菌包括乳酸桿菌(Lactobacillus)菌種，雙歧桿菌(Bifidobacterium)菌種，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，嗜酸芽孢乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等。這些菌種在其中廣泛存在細(xì)菌素方面是受到特別關(guān)注的，也廣泛應(yīng)用于發(fā)酵奶、食品和肉加工工業(yè)中。它們?cè)谑称返谋４婧惋L(fēng)味特征中的作用已有詳盡記載。大部分由這些菌種生產(chǎn)的細(xì)菌素僅僅具有抵抗其他乳酸細(xì)菌的活性，但有幾種顯示出對(duì)較大種系差異的革蘭氏陽(yáng)性菌以及，在特定條件下，對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性。

乳酸桿菌已被廣泛研究其拮抗劑的生產(chǎn)。其中包括充分定性的細(xì)菌素(DeKlerk，Nature(自然)，第214卷，609，1967；Upreti和Hinsdill，Anticmicrob.Agents Chemother.第七卷，139-145，1975；Barefoot和Klaenhammer，Anticmicrob.Agents Chemother.第45卷，1808-1815，1983；Joerger和Klaenhammer，Journal of Bacteriology(細(xì)菌學(xué)雜志)，第167卷，439-446，1986)；可能的細(xì)菌素樣物質(zhì)(Vincent等，Journal of Bacterioll(細(xì)菌雜志)，第78卷，479，1959)，和其他與細(xì)菌素不必然相關(guān)的拮抗劑(Vakil和Shahani，Bacteriology(細(xì)菌學(xué))，Proc.9，1965；Hamdan和Mikolajcik，Journal of Antibiotics(抗生素雜志)，第8卷，631-636，1974；Mikolajcik和Hamdan，Cultured Dairy Products(發(fā)酵乳制品)，1975，第10頁(yè)；以及Shahni等，Cultured Dairy Products Journal(發(fā)酵乳制品雜志)，第11卷，14-17，1976)。

Klaenhammer(FEMS，Microbiol.Rev.(微生物學(xué)綜述)，第12卷，39-86，1993)將當(dāng)時(shí)所知的乳酸細(xì)菌細(xì)菌素分為四個(gè)主要類(lèi)別 第I類(lèi)——羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是<5kDa的小肽，含有不常見(jiàn)的氨基酸羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。它們受到特別關(guān)注是因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)于其他細(xì)菌素而言非常廣譜的活性。實(shí)例包括乳酸鏈球菌素(Nisin)、乳酸鏈球菌素Z、串珠菌素(carnocin)U149、產(chǎn)乳桿菌素(lacticin)481、和產(chǎn)乳桿菌素5。
第II類(lèi)——小的不含羊毛硫氨酸的肽一類(lèi)非均質(zhì)的<10kDa的小肽。這一類(lèi)包括具有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。
第III類(lèi)——大的熱不穩(wěn)定的>30kDa的蛋白質(zhì)。實(shí)例是Helveticin。
第IV類(lèi)——含有額外部分例如脂類(lèi)和碳水化合物的復(fù)雜細(xì)菌素-蛋白質(zhì)。

Raczek(2002年11月28日公布的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2002/0176910)公開(kāi)了使用含有活著或死亡的分泌細(xì)菌素的微生物、或者細(xì)菌素自身或其組合形式的組合物以與農(nóng)業(yè)牲畜的飼料一起使用。

在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域里描述了各種產(chǎn)細(xì)菌素的腸球菌和鏈球菌屬以及其細(xì)菌素。然而，本發(fā)明提供新的組合物，其含有至少一種新的腸球菌和鏈球菌和或至少一種由所述新菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素；一種使用所述的菌株和/或細(xì)菌素的方法、所述新菌株、所述新細(xì)菌素的氨基酸序列以及其使用方法，所有這些與相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的菌株、細(xì)菌素以及使用方法是不相同的。
發(fā)明簡(jiǎn)述
因此本發(fā)明的目的是提供至少一種產(chǎn)新細(xì)菌素的新的腸球菌和鏈球菌菌株。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供具有NRRL B-30745識(shí)別特征的新的倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)。

本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有NRRL B-30746識(shí)別特征的新的倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)菌株。

本發(fā)明的另一目的是提供由新的腸球菌和鏈球菌的菌株生產(chǎn)的新的細(xì)菌素。

本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素50-52。

本發(fā)明再進(jìn)一步的目的是提供具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素760。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供通過(guò)向動(dòng)物施用治療組合物而至少降低由至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，所述組合物包括至少一種產(chǎn)新細(xì)菌素的新的腸球菌和鏈球菌的菌株、至少一種由新的腸球菌和鏈球菌的菌株生產(chǎn)的新細(xì)菌素或所述新菌株和/或所述新細(xì)菌素的組合。

本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是通過(guò)向動(dòng)物施用治療組合物而至少降低由至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有NRRL保藏號(hào)B-30746的識(shí)別特征的新的腸球菌的菌株、具有NRRL保藏號(hào)B-30745的識(shí)別特征的新的鏈球菌的菌株及其混合物。

本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供通過(guò)向動(dòng)物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有如在SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素50-52。

本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供通過(guò)向動(dòng)物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，所述組合物包括具有如在SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的新細(xì)菌素760。

本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)向動(dòng)物施用治療組合物而至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，所述組合物包括由具有識(shí)別特征NRRL B-30746的新的腸球菌的菌株、具有識(shí)別特征NRRL B-30745的新的鏈球菌的菌株及其混合物生產(chǎn)的細(xì)菌素。

本發(fā)明的另一目的是提供乳球菌屬(Lactococcus)誘導(dǎo)者菌株，所述誘導(dǎo)者菌株通過(guò)提高生產(chǎn)者菌株的細(xì)菌素的產(chǎn)量。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供具有識(shí)別特征NRRL B-30744的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的誘導(dǎo)者菌株。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供通過(guò)生產(chǎn)者菌株提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，其中所述生產(chǎn)者菌株與乳球菌誘導(dǎo)者菌株共培養(yǎng)。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供通過(guò)生產(chǎn)者菌株提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，其中所述生產(chǎn)者菌株與具有NRRL B-30744的識(shí)別特征的乳球菌菌株共培養(yǎng)。

本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供用于純化細(xì)菌素的方法，所述方法包括收獲培養(yǎng)液以及細(xì)胞作為分開(kāi)的樣本，通過(guò)用含有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫來(lái)分離已經(jīng)吸附到生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者菌株兩者的細(xì)胞表面上的細(xì)菌素，接著通過(guò)用疏水作用色譜一步離子交換色譜分離培養(yǎng)液中的細(xì)菌素。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)將從以下說(shuō)明中變得明顯。
微生物的保藏
倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)，標(biāo)明為NRRL B-30745(菌株760)；屎腸球菌(Enterococcus faecium)標(biāo)明為NRRL B-30746(菌株50-52)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)標(biāo)明為NRRL B-30744(菌株320)已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2004年5月3日保藏于美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心專(zhuān)利培養(yǎng)物保藏中心(國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research，1815 N.University Street，Peoria，Illinois 61604)。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1A和1B是顯示SDS-PAGE(1A)和等電聚焦(1B)后對(duì)細(xì)菌素760直接檢測(cè)的照片。

圖2A和2B是顯示SDS-PAGE(2A)和等電聚焦(2B)后對(duì)細(xì)菌素50-52直接檢測(cè)的照片。
發(fā)明詳述
腸感染在人類(lèi)中的重要性已經(jīng)被日益充分地認(rèn)識(shí)到。家禽污染和人類(lèi)感染之間的關(guān)系也已有詳盡記載。通過(guò)干預(yù)家禽加工廠(chǎng)消除這種健康危險(xiǎn)的能力也是眾所周知的。在肉仔雞生產(chǎn)和加工過(guò)程中，含有病原體的糞便物被轉(zhuǎn)移到肉上，并繼續(xù)存在于加工食品的廚房中。

競(jìng)爭(zhēng)性生物的代謝物可能有助于控制例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和沙門(mén)氏菌的病原體。已經(jīng)從肉仔雞的盲腸和嗉囊粘膜表面分離出了新的拮抗菌株。鑒定的拮抗劑的天然組分是具有廣譜拮抗活性的低分子量肽，細(xì)菌素。

本發(fā)明提供新的腸球菌菌株、新的鏈球菌菌株、新的乳球菌菌株、新的細(xì)菌素，所述細(xì)菌素的氨基酸序列、含有所述新的細(xì)菌素和/或生產(chǎn)所述新的細(xì)菌素的菌株的治療組合物、以及使用這些新的治療組合物的方法。本發(fā)明還提供生產(chǎn)和純化所述新的細(xì)菌素的方法。

屎腸球菌，NRRL B-30746，是一種兼性需氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37℃生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37℃微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落直徑約2mm。

倉(cāng)鼠鏈球菌，NRRL B-30745，是一種兼性需氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37℃生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生規(guī)則形狀的邊緣。在約37℃微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落直徑約1mm。

分離的腸球菌和鏈球菌用于生產(chǎn)新菌素活性的篩選是在接種由不同的所關(guān)注的目標(biāo)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行的。其他試驗(yàn)菌株在約37℃需氧條件下培養(yǎng)約18-24小時(shí)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假結(jié)核耶爾森菌(Y.pseudotuberculosis)在約28℃需氧條件下培養(yǎng)約18-24小時(shí)。抵抗空腸彎曲桿菌的活性試驗(yàn)是在由空腸彎曲桿菌接種的含約5％細(xì)胞溶解血液(lysed blood)的彎曲桿菌瓊脂上進(jìn)行的。血的使用在本領(lǐng)域普通技術(shù)中是充分的并且包括例如羊、馬等。抵抗空腸彎曲桿菌的活性試驗(yàn)在約5％O2、約10％ CO2以及約85％ N2的微需氧條件下在約42℃進(jìn)行約24-48小時(shí)。約0.1ml的懸浮在生理鹽水中的所述拮抗細(xì)菌被涂布到MRS瓊脂上并溫育約24-48小時(shí)。約0.5cm3的MRS瓊脂立方體被切下并轉(zhuǎn)移到由細(xì)胞溶解血液、約10微克/毫升的利福平、約2.4U/ml的多粘菌素補(bǔ)充的、并由約107個(gè)空腸彎曲桿菌細(xì)胞接種的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上。平板在約42℃微需氧條件下溫育約24-48小時(shí)。通過(guò)測(cè)量生長(zhǎng)抑制的區(qū)域評(píng)價(jià)活性。

評(píng)價(jià)用于細(xì)菌素生產(chǎn)的發(fā)現(xiàn)為拮抗性的分離物。由硫酸銨從拮抗菌株的培養(yǎng)物中沉淀制備粗抗微生物制備物(CAPs)，所述拮抗菌株在約37℃需氧條件下在約10％的布氏肉湯和細(xì)菌素增強(qiáng)量的用作誘導(dǎo)者的乳酸乳球菌(菌株320；NRRL-30744)中生長(zhǎng)約14小時(shí)。細(xì)菌素增強(qiáng)量的誘導(dǎo)者定義為與沒(méi)有誘導(dǎo)者菌株時(shí)培養(yǎng)的生產(chǎn)者菌株相比至少提高了生產(chǎn)者菌株的細(xì)菌素生產(chǎn)所需的誘導(dǎo)者細(xì)菌的量。共培養(yǎng)物中誘導(dǎo)者對(duì)生產(chǎn)者菌株的濃度比的實(shí)施例是約10:1(誘導(dǎo)者生產(chǎn)者)。所述培養(yǎng)物然后在約2,500×g下離心約10分鐘。拮抗肽通過(guò)硫酸銨沉淀、用Superose 12 HR凝膠過(guò)濾、用Sepharose SP FF陽(yáng)離子交換色譜的組合從上清液中分離。分泌的細(xì)菌素可能與共培養(yǎng)物一起吸附到生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者細(xì)胞兩者的細(xì)胞表面上。為了獲取這些細(xì)菌素，由離心步驟所得的細(xì)胞小團(tuán)與具有約0.7％ NaCl，pH約8.0的磷酸鹽緩沖液構(gòu)成的洗脫緩沖液混合?；旌显搼腋∫翰赜s20分鐘，接著在約10,000g離心約15分鐘。經(jīng)在Superose SP FF上的離子交換色譜從上清液分離細(xì)菌素。由SDS-PAGE電泳確定所述肽的分子量。由等電聚焦確定所述肽的pIs。采用例如491 cLC自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，Inc.)由Edman降解確定氨基酸序列。

為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“肽”意為至少兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸類(lèi)似物可以通過(guò)肽鍵相連。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸可以通過(guò)其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結(jié)構(gòu)構(gòu)型，包括線(xiàn)性、分支，或環(huán)狀構(gòu)型。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體兩者，以及氨基酸類(lèi)似物。

本發(fā)明的肽衍生物和類(lèi)似物包括但不限于包含作為一級(jí)氨基酸序列的肽的全部或部分氨基酸序列的那些，所述肽的全部或部分氨基酸序列包括其中用功能等同的氨基酸殘基替換序列中的殘基從而導(dǎo)致保守氨基酸替換的改變的序列。

例如，所述序列中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基可以由具有相似極性的另外的氨基酸取代，所述氨基酸起功能等同物的作用，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸的替代物可以選自該氨基酸所屬類(lèi)別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門(mén)冬酰胺，和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴(lài)氨酸，和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這種改變不會(huì)顯著影響聚丙酰胺凝膠電泳確定的表觀(guān)分子量或等電點(diǎn)。非保守氨基酸替換也可以被引入以替換氨基酸，使之具有特別偏好的性質(zhì)。例如，Cys可以被引入到可能的位置以與另一個(gè)Cys形成二硫橋。Pro可以因其特別的平面結(jié)構(gòu)而被引入。

本發(fā)明的肽可以被化學(xué)合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽縮合(peptidecondensation)技術(shù)，或任何其組合制備，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原創(chuàng)的固相程序的標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)、中和、耦聯(lián)和洗滌方法(J.Am.Chem.Soc，第85卷，2149-2154，1963)的標(biāo)準(zhǔn)Boc(Nα-氨基保護(hù)的Nα-t-丁基氧羰基)氨基酸樹(shù)脂，或堿敏感的Nα-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino和Han，J.Org.Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他Nα-保護(hù)的基團(tuán)。固相肽合成可以用本領(lǐng)域的普通技術(shù)(參見(jiàn)例如Stewart和Young，Solid Phase Synthesis(固相合成)，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.，1984；Fields和Noble，Int.J.Pept.Protein Res.，第35卷，161-214，1990)或用自動(dòng)合成儀完成。

根據(jù)本發(fā)明，所述多肽和新的細(xì)菌菌株可以以治療可接受的載體形式局部地、腸道外地、經(jīng)粘膜地(例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸或經(jīng)皮)給藥。本發(fā)明的肽如果需要的話(huà)可以被修飾以增加所述肽穿過(guò)細(xì)胞膜的能力，所述修飾例如通過(guò)增加所述肽的疏水性質(zhì)、將所述肽作為載體的共軛物(例如針對(duì)某特定受體的配體)引入，等等。

本發(fā)明還提供將目標(biāo)分子綴合(conjugate)到本發(fā)明的肽上的操作。本發(fā)明目的的目標(biāo)分子意指當(dāng)體內(nèi)給藥時(shí)定位到期望的一個(gè)或多個(gè)位置的分子。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，所述的目標(biāo)分子可以是肽或蛋白、抗體、凝集素、碳水化合物，或類(lèi)固醇。目標(biāo)分子可以是目標(biāo)細(xì)胞上受體的肽配體或者抗體，例如單克隆抗體。為促進(jìn)交聯(lián)，所述抗體可以被簡(jiǎn)化為重和輕鏈雜合二聚物，或者F(ab′)2片段可以被簡(jiǎn)化，并通過(guò)還原的巰基交聯(lián)到所述的肽上。

本發(fā)明的另一方面涉及提供治療組合物。所述組合物可以是針對(duì)口、鼻、肺給藥、注射等等。所述治療組合物包括有效量的至少一種本發(fā)明的細(xì)菌素以及其衍生物和/或至少一種新的菌株以至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平，以及可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。稀釋劑可以包括例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽的緩沖液；添加劑例如可以包括去污劑和增溶試劑，例如吐溫80，聚山梨酯80等；抗氧化劑包括例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉等等；防腐劑可以包括，例如Thimersol、苯甲醇等等；以及增量物質(zhì)例如乳糖、甘露糖醇等等。

本發(fā)明的治療組合物可以被并入聚合化合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乳酸、聚羥基乙酸等)特殊制備物中，或并入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體包封包括各種聚合物的包封。多種高分子載體可以用來(lái)包含和/或遞送一種或更多種上面討論的治療劑，包括例如可生物降解和不可生物降解的組合物兩者。可生物降解的組合物的代表性實(shí)例包括白蛋白、膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、淀粉、纖維素(甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、醋酸琥珀酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素)、酪蛋白、右旋糖苷、多糖、纖維蛋白原，聚(D，L乳酸)、聚(D，L-乳酸-共聚-甘醇酸)、聚(乙交酯)、聚(羥基丁酸酯)、聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)、聚酯、聚(羥基戊酸)、聚二氧環(huán)己酮、聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚(蘋(píng)果酸)、聚(羥基丙二酸)、聚酸酐、聚磷腈、聚(氨基酸)及其共聚物(一般地，見(jiàn)Ilium，L.，Davids，S.S.(編輯)的“Polymers in Controlled Drug Delivery(受控藥物遞送中的聚合物)”，Wright，Bristol，1987；Arshady，J.Controlled Release(受控釋放雜志)171-22，1991；Pitt，Int.J.Phar.(國(guó)際藥物雜志)59173-196，1990；Holland等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)4155-0180，1986)。

不可降解的聚合物的代表性實(shí)施例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物、硅橡膠、丙烯酸聚合物(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcynoacrylate))、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(尼龍6，6)、聚氨酯、聚(酯聚氨酯)、聚(醚聚氨酯)、聚(酯-脲)、聚醚(聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧丙烷)、Pluronics和聚(四亞甲基二醇))、硅橡膠和如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醋酸鄰苯二甲酸乙烯酯的乙烯基聚合物等)。也可以開(kāi)發(fā)陰離子(如海藻酸鹽、角叉菜膠、羧甲基纖維素和聚(丙烯酸))或陽(yáng)離子(例如，殼聚糖、聚-L-賴(lài)氨酸、聚乙烯亞胺以及聚烯丙胺)(一般地，見(jiàn)Dunn等，J.Applied Polymer Sci.(應(yīng)用聚合物雜志)50353-365，1993；Cascone等人，J.Materials Sci.Materials in Medicine(材料科學(xué)醫(yī)藥材料)5770-774，1994；Shiraishi等，Biol.Pharm.Bull.(生物藥物快報(bào))16(11)1164-1168，1993；Thacharodi和Rao，Int’l J.Pharm.(國(guó)際藥物雜志)120115-118，1995；Miyazaki等，Int’l J.Pharm.(國(guó)際藥物雜志)118257-263，1995)。

聚合物載體可以塑造成具有期望的釋放特征和/或特定的期望性質(zhì)的各種形式。例如，聚合物載體可以制成一旦暴露給特定的觸發(fā)事件例如pH就釋放治療劑的形式(見(jiàn)，例如，在藥物中的聚合物III(Polymers in Medicine III)，Heller等“Chemically Self-RegulatedDrug Delivery Systems(以化學(xué)的方式自調(diào)節(jié)的藥物遞送系統(tǒng))”，Elsevier Science PublisherB.V.，阿姆斯特丹，1988，第175-188頁(yè)；Kang等人，J.Applied Polymer Sci.(應(yīng)用聚合物科學(xué)雜志)48343-354，1993；Dong等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)19171-178，1992；Dong和Hoffman，J.Controlled Release(受控釋放雜志)15141-152，1991；Kim等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)28143-152，1994；Cornejo-Bravo等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)33223-229，1995；Wu和Lee，Pharm.Res.(藥物研究)10(10)1544-1547，1993；Serres等人，Pharm.Res.(藥物研究)13(2)196-201，1996；在Gurny等人編輯的Pulsatile Drug Delivery(脈沖藥物遞送)中Peppas的“Fundamentals ofpH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems(pH敏感和溫度敏感的遞送系統(tǒng)基礎(chǔ))”，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft GmbH，斯圖加特，1993，第41-55頁(yè)；在Peppas和Langer編輯的Biopolymers I(生物聚合物I)中Doelker的“Cellulose Derivatives(纖維素衍生物)”1993，Springer-Verlag，柏林)。代表性的pH敏感聚合物的實(shí)施例包括聚丙烯酸以及其衍生物(包括，舉例來(lái)說(shuō)，均聚物，例如聚氨基羧酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸，這些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和例如以上討論的丙烯酰類(lèi)單體(acrylmonomer)的共聚物)。其他pH敏感的聚合物包括多糖例如醋酸鄰苯二甲酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素、醋酸偏苯三酸(trimellilate)纖維素；以及殼聚糖。還有其他的pH敏感的聚合物包括pH敏感的聚合物和水溶性聚合物的任何混合物。

相似地，聚合物載體可以被制成溫度敏感的形式(見(jiàn)，例如，Chen等人在受控釋放生物活性材料國(guó)際會(huì)議論文集22167-168中的“Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal DrugDelivery(用于陰道藥物遞送的接枝到生物黏附的聚丙烯酸骨架上的新型溫敏普朗尼克水凝膠)”，Controlled Release Society，Inc.，1995；Okano在受控釋放生物活性材料國(guó)際會(huì)議論文集22111-112中的”Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for TemporalControlled Drug Delivery(用于時(shí)間控制藥物釋放的刺激相應(yīng)水凝膠的分子設(shè)計(jì))”Controlled Release Society，Inc.，1995；Johnston等人Pharm.Res.(藥物研究)9(3)425-433，1992；Tung，Int′l J.Pharm.(國(guó)際藥物雜志)10785-90，1994；Harsh和Gehrke，J.ControlledRelease(受控釋放雜志)17175-186，1991；Bae等人，Pharm.Res.(藥物研究)8(4)531-537，1991；Dinarvand和D′Emanuele，J.Controlled Release(受控釋放雜志)36221-227，1995；Yu和Grainger，＂Novel Thermo-sensitive Amphiphilic GelsPolyN-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis andPhysicochemical Characterization(新型熱敏型兩親性凝膠聚N-異丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸鈉-共聚-n-N-烷基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)合成和物理化學(xué)表征)”，Oregon Graduate Institute ofScience & Technology化學(xué)和生物科學(xué)系，，俄勒岡州，比弗頓，第820-821頁(yè)；Zhou和Smid，“Physical Hydrogels of Associative Star Polymers(締合型星狀聚合物的物理水凝膠)”，紐約州立大學(xué)環(huán)境科學(xué)和林業(yè)學(xué)院化學(xué)系聚合物研究所，紐約州錫拉丘茲(Syracuse)，第822-823頁(yè)；Hoffman等人，“Characterizing Pore Sizes and Water’Structure‘inStimuli-Responsive Hydrogels(刺激響應(yīng)性水凝膠中孔徑和水’結(jié)構(gòu)’的表征)”，華盛頓大學(xué)生物工程中心，華盛頓州西雅圖，第828頁(yè)；Yu和Grainger，“Thermo-sensitive SwellingBehavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide NetworksCationic，Anionic and AmpholyticHydrogels(交聯(lián)N-異丙基丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)中的熱敏膨脹行為陽(yáng)離子、陰離子和兩性水凝膠)”，Oregon Graduate Institute of Science & Technology化學(xué)和生物科學(xué)系，俄勒岡州比弗頓，第829-830頁(yè)；Kim等人，Pharm.Res.(藥物研究)9(3)283-290，1992；Bae等人，Pharm.Res.(藥物研究)，8(5)624-628，1991；Kono等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)3069-75，1994；Yoshida等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)3297-102，1994；Okano等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)36125-133，1995；Chun和Kim，J.ControlledRelease(受控釋放雜志)3839-47，1996；D′Emanuele和Dinarvand，Int′l J.Pharm.(國(guó)際藥物雜志)118237-242，1995；Katono等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)16215-228，1991；在Migliaresi等人編輯的“Polymers in Medicine(醫(yī)藥中的聚合物)III”中Hoffman的“Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species(含生物活性物種的熱可逆水凝膠)”，Elsevier Science Publisher B.V.，阿姆斯特丹，1988，第161-167頁(yè)；在第三屆藥物遞送系統(tǒng)新進(jìn)展國(guó)際研討會(huì)，猶他州鹽湖城，1987年2月24-27日，第297-305頁(yè)，Hoffman的“Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeuticsand Diagnostics(在治療學(xué)和診斷學(xué)中熱可逆聚合物和水凝膠的應(yīng)用)”；Gutowska等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)2295-104，1992；Palasis和Gehrke，J.Controlled Release(受控釋放雜志)181-12，1992；Paavola等人，Pharm.Res.(藥物研究)12(12)1997-2002，1995)。

熱膠凝聚合物的代表性實(shí)施例以及其凝膠溫度(LCST(攝氏度))包括均聚物，例如聚(N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19.8；聚(N-n-丙基丙烯酰胺)，21.5；聚(N-甲基-N-異丙基丙烯酰胺)，22.3；聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)，28.0；聚(N-異丙基丙烯酰胺)，30.9；聚(N，n-二乙基丙烯酰胺)，32.0；聚(N-異丙基甲基丙烯酰胺)，44.0；聚(N-環(huán)丙基丙烯酰胺)，45.5；聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50.0；聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰胺)，56.0；聚(N-環(huán)丙基甲基丙烯酰胺)，59.0；聚(N-乙基丙烯酰胺)，72.0。此外，熱膠凝聚合物可以由制備以上兩種(多種)單體之間的共聚物而制得，或者通過(guò)組合這些均聚物和其他的水溶性聚合物而制備，所述水溶性聚合物例如丙烯酰類(lèi)單體(例如，丙烯酸及其衍生物，例如甲基丙烯酸、丙烯酸酯和其衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺，以及N-n-丁基丙烯酰胺)。其他熱膠凝聚合物的代表性實(shí)施例包括纖維素醚衍生物，例如羥丙基纖維素，41攝氏度；甲基纖維素，55攝氏度；羥丙基甲基纖維素，66攝氏度；以及乙基羥乙基纖維素和普朗尼克類(lèi)，如F-127，10-15攝氏度；L-122，19攝氏度；L-92，26攝氏度；L-81，2O攝氏度；以及L-61，24攝氏度。

可以通過(guò)本發(fā)明的聚合物載體制成各種形式，包括例如棒形的設(shè)備、小丸、厚片或膠囊(見(jiàn)，例如，Goodell等人，Am.J.Hosp.Pharm.(美國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志)431454-1461，1986；在Biomedical Polymer，Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use(生物醫(yī)學(xué)聚合物，生物醫(yī)學(xué)用途的聚合物材料和藥物)中的Langer等人，“Controlledrelease of macromolecules from polymers(從聚合物受控釋放大分子)”，Goldberg，E.P.，Nakagim，A.編輯，Academic Press，第113-137頁(yè)，1980；Rhine等人，J.Pharm.Sci.(藥物科學(xué)雜志)69265-270，1980；Brown等人，J.Pharm.Sci.(藥物科學(xué)雜志)721181-1185，1983；以及Bawa等人，J.Controlled Release(受控釋放雜志)1259-267，1985)。

治療劑可以通過(guò)包藏(occlusion)在聚合物基質(zhì)中，通過(guò)共價(jià)連接而束縛，或者包封在微膠囊里而被連接。在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療組合物以非膠囊配方形式提供，所述非膠囊配方形式例如微球(尺寸從納米到微米)，各種尺寸的糊劑和細(xì)絲(thread)、膜和噴霧。

本發(fā)明的另一方面是提供治療組合物和動(dòng)物飼料。本發(fā)明的治療組合物如上所述可以用聚合物載體包覆并隨后通過(guò)任何已知的將其施用于飼料的方法添加至飼料，所述的已知方法例如通過(guò)機(jī)械混合、噴霧等等。所述治療組合物包括，一用量的至少一種細(xì)菌素，所述的用量對(duì)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平是有效的，例如約0.5克的一種或多種細(xì)菌素/100克，約1.25克的聚合物載體(例如聚乙烯基吡咯烷酮)/100克，以及約8.6％的稀釋劑(例如水/100克)，與可消化的任意顆粒狀組分混合，所述可消化的顆粒狀物包括，碾磨玉米籽粒、研磨谷粒(例如燕麥、小麥、蕎麥)、研磨水果(例如梨)等。然后所述治療組合物以對(duì)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平有效的量被添加到任意種類(lèi)的動(dòng)物飼料中，所述的有效的量例如，舉例來(lái)說(shuō)細(xì)菌素對(duì)飼料的比例約110到約1100。為了本發(fā)明的目的，動(dòng)物飼料的實(shí)例包括青飼料、青貯飼料、干青飼料、根、塊莖、肉質(zhì)果、谷粒、種子、啤酒糟(brewer’s grain)、果渣、啤酒酵母、蒸餾殘?jiān)?、碾磨副產(chǎn)品、生產(chǎn)糖、淀粉或油的副產(chǎn)品，以及各種食物廢料。該產(chǎn)品可以添加到用于牛、家禽、兔、豬、或羊飼養(yǎng)等的動(dòng)物食料中?？梢耘c其他飼料添加劑混合用于這些家畜。

下述實(shí)施例僅僅是為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，并非要限制由權(quán)利要求確定的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
從約1.0克肉仔雞的盲腸的粘膜表面分離出的兩種新的拮抗菌株，屎腸球菌菌株50-52(NRRL B-30746)以及倉(cāng)鼠鏈球菌菌株760(NRRL B-30745)，被懸浮在約10ml滅菌的0.85％(w/v)的鹽溶液(生理鹽水)中并加熱到約80℃約15分鐘。約0.10ml的約150以及12500的懸浮液被鋪展涂布到平板計(jì)數(shù)瓊脂或MRS瓊脂上。平板在微需氧條件下在約37℃溫育約24小時(shí)。具有不同形態(tài)的菌落在MRS瓊脂上劃線(xiàn)。這些培養(yǎng)物在微需氧條件下在約37℃溫育約24小時(shí)。

菌株760在約37℃在MRS瓊脂上生長(zhǎng)約24小時(shí)。所述菌株是兼性需氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，可以在約37℃和45℃間生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)，在約37℃需氧溫育約24小時(shí)后產(chǎn)生規(guī)則圓形、低凸起、略灰色的菌落，具有波狀邊緣，直徑約為2mm。菌株760的生物化學(xué)性質(zhì)由APJ 50 CLH系統(tǒng)確定(Bio-Merieux，法國(guó))。所述菌落分解乳糖、甘露醇、核糖、水楊苷、山梨糖醇、海藻糖、阿拉伯糖和蜜二糖。它略微水解棉子糖和菊糖(inulin)，不水解精氨酸和七葉苷。其不能α和β溶血。其在約6.5％氯化鈉存在下不生長(zhǎng)。該菌株是過(guò)氧化氫酶陰性的。

菌株50-52在約37℃在MRS瓊脂上培育約24小時(shí)。所述菌株是兼性需氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，能夠在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)，在約37℃需氧溫育約24小時(shí)后產(chǎn)生不規(guī)則圓形、低凸起、略灰色的菌落，具有波狀邊緣，直徑約為1mm。菌株50-52的生物化學(xué)性質(zhì)由EN-Coccus試驗(yàn)確定。所述菌株分解精氨酸、阿拉伯糖和甘露醇；不水解山梨糖、山梨糖醇、蜜二糖、棉子糖和meticitose。其在約6.5％氯化鈉存在下生長(zhǎng)。

用于評(píng)價(jià)菌株50-52和760拮抗活性的目標(biāo)細(xì)菌包括空腸彎曲桿菌(C.jejuni)NCTC 11168，腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)以及大腸桿菌(E.coli)0157H7的分離物。在約5％ O2、約10％ CO2以及約85％ N2的微需氧條件下，將空腸彎曲桿菌的培養(yǎng)物在含約5％的部分細(xì)胞溶解血液的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上在約42℃下生長(zhǎng)約24-48小時(shí)。其他的菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上在約37℃下培育約24小時(shí)。評(píng)價(jià)分離物對(duì)彎曲桿菌的拮抗活性。將約0.2ml生理鹽水的懸浮液涂布到MRS瓊脂上并在約37℃溫育約24小時(shí)。切下約0.5cm3的MRS瓊脂立方塊并轉(zhuǎn)移到每塊板用約5％-10％的部分細(xì)胞溶液血液、約10mg/ml的利福平和約2.5u/ml的多粘菌素補(bǔ)充的、用約107個(gè)細(xì)胞的空腸彎曲桿菌接種的布氏瓊脂或彎曲桿菌瓊脂上。平板在如上面所描述的微需氧條件下在約42℃下溫育約24-48小時(shí)。通過(guò)測(cè)量空腸彎曲桿菌抑制區(qū)域的直徑的大小來(lái)評(píng)價(jià)拮抗活性。
實(shí)施例2
由兩種拮抗菌株腸球菌50-52和鏈球菌760的培養(yǎng)物提取粗抗微生物制備物。在37℃下將拮抗物在約250ml的10％的布氏肉湯中與誘導(dǎo)者菌株乳酸乳球菌菌株320(NRRL B-30744，如上)一起在需氧條件下培育約14小時(shí)。生產(chǎn)者菌株的濃度是約106CFU/mL而誘導(dǎo)者菌株是約107CFU/mL。所得的培養(yǎng)物在約2,500×g離心約10分鐘，去掉大部分活細(xì)胞。傾析掉的上清液與約60％的飽和硫酸銨混合并在約4℃溫育約24小時(shí)以沉淀細(xì)菌素化合物。在以約10,000×g離心約20分鐘后，沉降物被重新懸浮在約1.5ml約10mM pH約7.0的磷酸鈉緩沖液中，并對(duì)約2.5L相同的緩沖液滲析過(guò)夜。所得溶液被稱(chēng)為粗抗微生物制備物(CAP)。所述制備物的樣本通過(guò)經(jīng)過(guò)0.22微米孔徑的濾膜(Millipore，馬薩諸塞州貝德福德，USDA)滅菌。表1顯示使用和不使用誘導(dǎo)者菌株的細(xì)菌素生產(chǎn)。
表1使用和不使用誘導(dǎo)者菌株乳酸乳球菌菌株320的細(xì)菌素生產(chǎn)
實(shí)施例3
采用斑點(diǎn)試驗(yàn)確定所述CAPs的抗微生物性譜。將約1ml在上面實(shí)施例2中獲得的滅菌粗抗微生物制備物(CAP)用約1ml磷酸鹽-鈉鹽緩沖液(pH約7.0)稀釋并如實(shí)施例2中滅菌。每種樣品約10微升被涂布到預(yù)先用目標(biāo)細(xì)菌的細(xì)胞接種的血補(bǔ)充的彎曲桿菌瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂(MPA或Meta蛋白胨瓊脂)上。約42℃下在微需氧條件下生長(zhǎng)含有空腸彎曲桿菌的平板，在約28℃下需氧培養(yǎng)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)和假結(jié)核耶爾森菌(Y.pseudotuberculosis)，其他細(xì)菌菌株在約37℃下需氧溫育約24或48小時(shí)。識(shí)別基于目標(biāo)細(xì)菌所產(chǎn)生的抑制區(qū)域。CAP的活性以在培養(yǎng)物生長(zhǎng)抑制的可見(jiàn)區(qū)域出現(xiàn)時(shí)的任意單位(AU)每毫升制備物表示(Henderson等人，Archives of Biochemistryand Biophysics(生物化學(xué)和生物物理檔案)，第295卷，5-12，1992，通過(guò)參考并入本文)。所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行兩次。見(jiàn)下面實(shí)施例4中的表2。
實(shí)施例4
CAPs和細(xì)菌素在三甘氨酸緩沖液中在約15％的瓊脂糖凝膠重量，約1％SDS(9×12cm)中電泳。在約100mA電泳約4小時(shí)后，凝膠用含有約15％乙醇和約1％醋酸的溶液固定。然后用蒸餾水洗滌所述凝膠約4小時(shí)。為了確定蛋白級(jí)份的分子量，所述凝膠用含有約0.21％的考馬斯蘭G-250、約40％的乙醇以及約7％的醋酸染色。洗滌過(guò)的凝膠通過(guò)Bhunia等的方法對(duì)三種目標(biāo)細(xì)菌空腸彎曲桿菌NCTC 11168、大腸桿菌0157H7904以及腸炎沙門(mén)氏菌204進(jìn)行試驗(yàn)(Journal of Industrial Microbiology(工業(yè)微生物雜志)，第2卷，319-322，1987；通過(guò)參考并入本文)。所述凝膠放置在細(xì)菌培養(yǎng)皿(Petri Dishes)中，用5％血-半固態(tài)彎曲桿菌瓊脂(約0.75％)或半固態(tài)MPA覆蓋，并用試驗(yàn)菌株的細(xì)胞接種。含空腸彎曲桿菌的平板在微需氧條件下在約42℃溫育約48小時(shí)，大腸桿菌0157H7以及腸炎沙門(mén)氏菌在約37℃溫育約24小時(shí)。評(píng)定基于存在細(xì)菌素時(shí)試驗(yàn)細(xì)菌抑制生長(zhǎng)的可見(jiàn)區(qū)域。

等電聚焦識(shí)別兩種等電點(diǎn)上不同的迥異級(jí)份(pICAP760，含有具有pI＝約9，2和約9，5的級(jí)份。CAP 50-52含有具有pI＝約7.7和8.4的級(jí)份。在制備物760中具有pI＝約9.5的級(jí)份中觀(guān)察到對(duì)空腸彎曲桿菌的拮抗活性，而在制備物50-52中，此抑制在pI＝約8.4的級(jí)份中被觀(guān)察到(圖1A-B和2A-B，下表1)。

用空腸彎曲桿菌蓋覆的凝膠來(lái)確定哪個(gè)或哪些帶對(duì)應(yīng)抗微生物性、其分子量和等電點(diǎn)。針對(duì)細(xì)菌素760的圖1A和1B，顯示活性組分的分子量(1A)和活性組分的等電點(diǎn)(1B)。用空腸彎曲桿菌蓋覆凝膠以確定抗微生物活性、分子量和等電點(diǎn)。在圖1A中，道1顯示LMW范圍為14,400-94,000的分子量標(biāo)記物(Amersham Pharmacia Biotech)14,000、20,100、30,000、43,000、67,000以及94,000Da。道2中是胰島素，β鏈的分子量標(biāo)記物(Sigma，USA)3,500Da。道3顯示對(duì)應(yīng)抗微生物活性的純細(xì)菌素760，生長(zhǎng)抑制區(qū)域(箭頭)具有約5,500Da的質(zhì)量。圖1B，道1顯示pI標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白試驗(yàn)混合物，pI標(biāo)記物蛋白，Serva)。道2顯示的是對(duì)應(yīng)抗微生物活性的純細(xì)菌素760，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域(箭頭)具有約9.5的pI。其他帶不顯示抗微生物活性。

圖2A和2B顯示利用SDS-PAGE(2A)和等電聚焦(2B)直接檢測(cè)細(xì)菌素50-52。用空腸彎曲桿菌蓋覆凝膠以確定哪個(gè)或哪些帶對(duì)應(yīng)抗微生物活性以及分子量(如圖2A所示)。道1顯示LMW范圍為1,600-26,000的分子量標(biāo)記物(Amersham Pharmacia Biotech)1,600、3,500、6,500、14,200、17,000以及26,000Da。含有對(duì)應(yīng)抗微生物活性的純細(xì)菌素50-52的道2中的帶，生長(zhǎng)抑制區(qū)域具有約3,900Da的分子量。圖2B，道1含有pI標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白試驗(yàn)混合物，pI標(biāo)記物蛋白，Serva)。對(duì)應(yīng)抗微生物活性的道2中的帶(純細(xì)菌素50-52)，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域(箭頭)具有約8.4的pI。其他帶不顯示抗微生物活性。

細(xì)菌素標(biāo)本被放置在IEF凝膠上(pH約4.4-10.0)(Novex，加利福尼亞州圣迭哥)。在XCM IITM Mini-Cell(Novex)中使所述凝膠在約100V跑約1小時(shí)，200V跑約2小時(shí)，在500V跑約30分鐘。用蒸餾水洗滌凝膠約4小時(shí)而不固定，接著用考馬斯藍(lán)G-250染色以確定所述細(xì)菌素的等電點(diǎn)(Pi)以及它們抑制試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的能力，如在圖1和2中以及在表2中所示。
表2通過(guò)斑點(diǎn)試驗(yàn)、SDS-PAGE以及等電聚焦(IEF)的方法評(píng)價(jià)的細(xì)菌素粗抗微生物制備物的抗菌活性 實(shí)施例5
將生產(chǎn)腸球菌菌株50-52以及鏈球菌菌株760與誘導(dǎo)細(xì)菌菌株乳酸乳球菌(菌株320，如上)在布氏肉湯(Difco)里同時(shí)培養(yǎng)。約1.32×107的屎腸球菌或倉(cāng)鼠鏈球菌的細(xì)胞與約3.9×106的乳酸乳球菌細(xì)胞一起放在250ml的燒瓶中并培養(yǎng)約24小時(shí)。生產(chǎn)和誘導(dǎo)菌株的濃度和細(xì)菌素的比活每?jī)尚r(shí)確定一次以確定獲得可用的細(xì)菌素的量的最適宜時(shí)間。通過(guò)兩種方法分離和純化細(xì)菌素。第一是用硫酸銨沉淀細(xì)菌素接著是三階段的色譜在Superose 12HR上的凝膠過(guò)濾、Superose SPFF上的離子交換色譜以及辛基Sepharose 4FF上的疏水作用色譜。這是方法A。

對(duì)于方法B，在同時(shí)培養(yǎng)生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者菌株時(shí)，所生產(chǎn)的大部分細(xì)菌素都分泌到培養(yǎng)液中。部分的細(xì)菌素將吸附到誘導(dǎo)者和生產(chǎn)者菌株兩者上。為了避免吸附的細(xì)菌素的損失，從細(xì)胞上洗脫所述細(xì)菌素。方法B包括兩步(1)從培養(yǎng)液的上清液中分離細(xì)菌素；以及(2)從誘導(dǎo)和生產(chǎn)菌株兩者的細(xì)胞沉淀中分離細(xì)菌素。在步驟1中，獲取所述培養(yǎng)物并通過(guò)在約10,000g離心約15分鐘沉淀細(xì)胞而分離。上清液加至辛基Sepharose4FF柱上以回收細(xì)菌素。在步驟2中使用細(xì)胞沉淀。所述沉淀懸浮在具有約0.7％NaCl的磷酸鹽緩沖液中，pH(洗脫液)，混合懸浮液并溫育約20分鐘。溫育后，所述懸浮液在約10,000g離心約15分鐘。采用在Superose SP FF上離子交換色譜從上清液中分離細(xì)菌素。由兩種方法純化的產(chǎn)品對(duì)空腸彎曲桿菌分析其拮抗活性。進(jìn)行SDS-PAGE和等點(diǎn)聚焦(IEF)。結(jié)果總結(jié)于以下的表3和表4中。

發(fā)現(xiàn)由方法B純化的所述制備物的比活比由方法A獲得的相同產(chǎn)品的活性高4倍。相比于用方法A需要約52小時(shí)，生產(chǎn)方法B的制備物需要約12.5小時(shí)。方法B通過(guò)消除凝膠過(guò)濾和疏水作用色譜，而僅使用離子交換色譜而減少了需要用于從CAP純化細(xì)菌素的步驟。
表3用方法A和B分離的細(xì)菌素760和50-52比活的比較性數(shù)據(jù)
表4由斑點(diǎn)試驗(yàn)、SDS-PAGE以及等電聚焦確定的純化細(xì)菌素760和50-52的抗微生物活性
采用491 cLC自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，USA)用Edman降解確定純化的細(xì)菌素的氨基酸序列。細(xì)菌素在約6M的HCl中在真空下約110℃水解約72小時(shí)。細(xì)菌素50-52和760的分子量采用Voyager-DERP(Perkin-Elmer，USA)由質(zhì)譜確定。MALDI-TOF系統(tǒng)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間系統(tǒng)，與基質(zhì)2-氰基-羥基肉桂酸一起使用。氨基酸序列是 50-52TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWLCKLA SEQ ID NO 1 760NRWYCNSAAGGVGGAAVCGLAGYVGEAKENIAGEVRKGWGMAGGFTHNKA CKS SEQ ID 2 所述肽的計(jì)算分子量對(duì)于細(xì)菌素50-52是約3.9kDa，而對(duì)于細(xì)菌素760是約5.5kDa。用MALDI-TOF分析表明以下分子量對(duì)于細(xì)菌素50-52是約3,932Da，對(duì)于細(xì)菌素760是約5,362Da。
實(shí)施例6
確定酶、溫度和pH對(duì)于細(xì)菌素活性的影響。約10ml下列酶中的一種被轉(zhuǎn)移到含有約20ml細(xì)菌素的試管中β-胰凝乳蛋白酶-約100mg/ml、蛋白酶K-約200mg/ml、木瓜蛋白酶-約60mg/ml，溶菌酶-約750mg/ml以及脂肪酶-約100mg/ml(所有均來(lái)自Sigma-Aldrich Corp.，密蘇里州圣路易斯)。在約37℃溫育約3小時(shí)后，細(xì)菌素和酶的混合物采用如實(shí)施例3中的斑點(diǎn)試驗(yàn)分析抗微生物活性。未經(jīng)處理的細(xì)菌素起陽(yáng)性對(duì)照的作用。

為了研究細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性，約2mg/ml的樣品在水浴中煮沸約15分鐘，冷卻并按其抗微生物活性評(píng)價(jià)。約2mg/ml的細(xì)菌素用于評(píng)價(jià)pH效應(yīng)。將約2ml的滅菌溶液，約10mM的NaOH或者約10mM的HCl加至樣品以試驗(yàn)從約3到約10的pH。樣品在約37℃溫育約2小時(shí)和24小時(shí)，并在約90℃溫育約20分鐘。通過(guò)添加約4mM滅菌的磷酸鹽緩沖液將樣品調(diào)節(jié)到約7.2的pH并用如上面的實(shí)施例3中的斑點(diǎn)試驗(yàn)分析其抗微生物活性。

在用β-胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理后，細(xì)菌素50-52和760喪失了其抗微生物活性，但當(dāng)其用溶菌酶、脂肪酶或加熱到約90℃處理時(shí)保持(表5)。在從約3.0到約9.0的不同pH時(shí)，它們是穩(wěn)定的，但在約pH10時(shí)變得沒(méi)有活性(表5和6)。
表5酶和溫度對(duì)細(xì)菌素抗菌活性的影響 * 活性由斑點(diǎn)試驗(yàn)確定，用空腸彎曲桿菌NCTC 11168作為指示菌株 在用酶或暴露于溫度處理后 + 存在活性 - 沒(méi)有活性 表6pH對(duì)細(xì)菌素活性的效應(yīng) + 存在活性 - 沒(méi)有活性 實(shí)施例7
彎曲桿菌屬對(duì)純化的細(xì)菌素760和E50-52制備物的易感性用如上面在實(shí)施例1中描述的由肉仔雞幼禽中分離的菌株確定。細(xì)菌素的拮抗活性基于最小抑制濃度(MICs)評(píng)定，所述最小抑制濃度由瓊脂擴(kuò)散確定。表7顯示細(xì)菌素針對(duì)所試驗(yàn)的菌株的MICs。所有所試驗(yàn)的細(xì)菌素對(duì)于彎曲桿菌屬菌株都是高度拮抗的。菌株760比其余的具有在約0.05到約0.1μg/ml的MICs的菌株要更有活性得多。
表7.對(duì)彎曲桿菌屬菌株的細(xì)菌素MIC
實(shí)施例8
革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌對(duì)于細(xì)菌素760和50-52的易感性采用如上面在實(shí)施例3中所描述的斑點(diǎn)試驗(yàn)確定。結(jié)果示于表8和9中。如從表8中可見(jiàn)，細(xì)菌素760具有廣譜并且高水平的拮抗活性。所述的細(xì)菌素抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌兩者的生長(zhǎng)。其對(duì)于試驗(yàn)菌株的MIC在約0.1μg/ml到約3.2μg/ml范圍內(nèi)變化。如從表9中可見(jiàn)，細(xì)菌素50-52具有廣譜并且高水平的拮抗活性。所述的細(xì)菌素抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌兩者的生長(zhǎng)。其對(duì)于試驗(yàn)菌株的MIC在約0.1μg/ml到約3.2μg/ml范圍內(nèi)變化。
表8.由斑點(diǎn)試驗(yàn)確定的細(xì)菌素760的抗菌活性 表9.由斑點(diǎn)試驗(yàn)確定的細(xì)菌素50-52的抗菌活性 實(shí)施例9
細(xì)菌素760和50-52以及甲氧西林的最小抑制濃度(MICs)由斑點(diǎn)試驗(yàn)確定。在10μl體積中的純化的細(xì)菌素的各濃度被加至金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌和幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)物中。對(duì)于除了幽門(mén)螺桿菌(在微需氧條件下)所有的培養(yǎng)物都在約37C需氧下溫育約24小時(shí)。結(jié)果在下面的表10中顯示。
表10細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、幽門(mén)螺桿菌的MIC

前述詳細(xì)描述是為了舉例說(shuō)明的目的。這些細(xì)節(jié)僅僅是為了該目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出變化而不會(huì)背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素，所述腸球菌或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746和NRRL B-30745組成的組的菌株的識(shí)別特征。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌素，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌素，具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
5.具有NRRL B-30746的識(shí)別特征的分離的屎腸球菌菌株。
6.具有NRRL B-30745的識(shí)別特征的分離的倉(cāng)鼠鏈球菌菌株。
7.一種治療組合物，包括
(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌定植水平的有效量的至少一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識(shí)別特征；以及
(b)合適的治療載體。
8.如權(quán)利要求7所述的治療組合物，其中所述細(xì)菌素具有選自由SEQ ID NO.1、SEQID NO 2或其混合物組成的組的氨基酸序列。
9.一種用于動(dòng)物的治療性飼料，包括
(a)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的至少一種由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的分離的細(xì)菌素，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識(shí)別特征，
(b)治療載體，以及
(c)動(dòng)物飼料。
10.如權(quán)利要求11所述的治療性飼料，其中所述至少一種細(xì)菌素具有選自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO 2及其混合物組成的組的氨基酸序列。
11.一種用于至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物中的定植水平的方法，包括
將至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌的定植水平的有效量的包括至少一種分離的由腸球菌菌株或鏈球菌菌株生產(chǎn)的細(xì)菌素以及治療載體的治療組合物施用給動(dòng)物，所述腸球菌菌株或鏈球菌菌株具有選自由NRRL B-30746、NRRL B-30745及其混合物組成的組的菌株的識(shí)別特征。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的細(xì)菌素具有選自由SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 2及其混合物組成的組的氨基酸序列。
13.具有NRRL B-30744的識(shí)別特征的乳酸乳球菌的分離菌株。
14.一種用于由細(xì)菌提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法，包括
(a)向產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌的培養(yǎng)物中添加細(xì)菌素提升量的乳酸乳球菌以形成共同培養(yǎng)物，所述乳酸乳球菌具有NRRL B-30744的識(shí)別特征，以及
(b)在大約37℃培養(yǎng)所述的共同培養(yǎng)物。
15.一種用于分離細(xì)菌素的方法，其包括
(a)共同培養(yǎng)產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌以在培養(yǎng)介質(zhì)中生產(chǎn)細(xì)菌素，
(b)通過(guò)離心收獲所述培養(yǎng)介質(zhì)和細(xì)胞以獲得上清液和細(xì)胞小團(tuán)，
(c)將所述含細(xì)菌素的上清液應(yīng)用于疏水作用色譜柱以獲得分離的細(xì)菌素制備物，
(d)在洗脫緩沖液中溫育所述來(lái)自步驟b的所述細(xì)胞小團(tuán)以形成第一混合物，
(e)通過(guò)離心從所述細(xì)胞小團(tuán)與所述緩沖液分離細(xì)胞，
(f)通過(guò)離子交換色譜從所述緩沖液分離細(xì)菌素。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述離子交換色譜使用Superose SP FF柱。
全文摘要
使用由新的腸球菌和鏈球菌菌株生產(chǎn)的新的腸球菌和鏈球菌細(xì)菌素來(lái)至少降低至少一種目標(biāo)細(xì)菌在動(dòng)物、尤其是禽類(lèi)中的定植水平。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101426515SQ200680054285
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者N·斯特恩, J·萊恩, E·斯韋托奇, B·葉魯斯拉諾夫, V·佩雷列金, E·米特西韋奇, I·米特西韋奇, V·列夫查克 申請(qǐng)人:由農(nóng)業(yè)部部長(zhǎng)代表的美利堅(jiān)合眾國(guó), 國(guó)家應(yīng)用微生物和生物技術(shù)研究中心