專利名稱：用于骨形成的源自骨髓的有核細(xì)胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于骨形成的源自骨髓的有核細(xì)胞的分離方法，更具體
地，涉及一種能夠快速且方便地分離源自骨髓的有核細(xì)胞的方法，該有核細(xì)
胞能夠被移植到需要形成骨的部位或者需要進(jìn)行骨缺損治療的部位。根據(jù)本
發(fā)明的方法，可以通過(guò)以方便且快速的方式分離用于在手術(shù)部位形成骨的有
核細(xì)胞并將分離的細(xì)胞注射到患者體內(nèi)，在急診患者或經(jīng)歷反復(fù)外科手術(shù)的 患者體內(nèi)有效地形成骨。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報(bào)道，超過(guò)50%的年齡在65歲或者更高 的老年人在經(jīng)受著慢性骨骼疾病的折磨，并且由骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折的比例 在過(guò)去十年間增加了兩倍多。多于約40%的年齡在50歲或者更高的女性群 體均符合這樣的規(guī)律。在美國(guó)，每年大約有5600000人遭受骨折，其中的 3100000人經(jīng)歷了外科手術(shù)。根據(jù)國(guó)際醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)(MDI)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，實(shí)施 過(guò)約426000例骨移植。每年全世界用于骨移植的花費(fèi)大約為8億美元，在 1995年，自體移植、同種異體移植和合成材料移植實(shí)施的比率約為58%: 34%: 8%。
通常，僅使用鑄模幾周，單純性骨折就會(huì)完全痊愈，但是，如果是嚴(yán)重 的骨折或者是骨缺損，就需要進(jìn)行骨移植手術(shù)。但是，自體移植會(huì)導(dǎo)致被移 植部位的劇烈疼痛，需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的恢復(fù)期，并且很難確定骨移植的供體 部位。由于滅菌、免疫排斥反應(yīng)、再吸收和再骨折引起的骨強(qiáng)度的減弱，同 種異體移植在應(yīng)用上受到很大限制，并且同種異體移植具有致命的缺點(diǎn)，就 是可能引起感染，例如肝炎或AIDS。由于這個(gè)原因，在1993年下半年食品與藥品管理局(Food & Drug Administration)對(duì)骨組織庫(kù)感染的規(guī)定嚴(yán)格化 以后，移植術(shù)的應(yīng)用減少。
在另一種骨移植技術(shù)中，例如，整形外科手術(shù)中將涂覆有生物活性物質(zhì) 的金屬或惰性陶瓷用作支撐物。但是，由于一些問(wèn)題，例如金屬的腐蝕、陶 瓷-金屬的表面磨損以及骨和移植物表面的大量纖維組織的形成，將金屬用 作骨移植材料存在很多困難。
關(guān)于骨成形的因素，自從1952年Urist和Mclean提出骨成形蛋白的骨 形態(tài)形成后研究了各種因素。但是，這些因素在常規(guī)的臨床應(yīng)用中具有局限 性，因?yàn)槭褂脧?fù)雜且昂貴的方法只能形成小部分因素，因而效率很低。
骨髓注射是基于Huggins (1931 )、 Friedenstein (1973)和Ashton (1980) 等人的報(bào)道，這些報(bào)道指出骨髓中的骨母細(xì)胞(osteoprogenitor cells)能夠 誘導(dǎo)和促進(jìn)骨形成。骨髓注射主要用于單獨(dú)的骨折治療或者與骨移植結(jié)合使 用。不同于其它的骨移植技術(shù)，骨髓注射不在供體位置實(shí)施皮膚切口，因而 不會(huì)產(chǎn)生與供體位置相關(guān)的問(wèn)題。另外，骨髓注射沒(méi)有并發(fā)癥或副作用。
其后，盡管也報(bào)道過(guò)骨髓注射的臨床應(yīng)用的好的結(jié)果，但是，結(jié)果的重 要部分不是不變的。由于骨髓的量的問(wèn)題，這些結(jié)果的理論基礎(chǔ)也不是很清 楚，因?yàn)榭梢詮囊粋€(gè)部位抽取的骨髓的量是有限的，而且骨髓中含有的骨母 細(xì)胞的量是很有限的。
因此，應(yīng)用一種新的骨移植方法對(duì)于骨形成來(lái)說(shuō)是非常有效的，該方法 包括將骨母細(xì)胞擴(kuò)增和培養(yǎng)成足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞，并且將培養(yǎng)得到的成骨 細(xì)胞注射到骨形成部位。盡管與現(xiàn)有的自體移植、同種異體移植和骨髓注射 技術(shù)相比，這種方法有很多優(yōu)點(diǎn)和效果，但是仍然存在問(wèn)題，成骨細(xì)胞的增 殖需要3-4周的培養(yǎng)周期，這很難應(yīng)用于急診患者或者需要反復(fù)外科手術(shù)的 患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)生的上述問(wèn)題。本發(fā)明的第一個(gè)目 的是提供一種用于骨形成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，該方法改進(jìn)了植 入術(shù)、骨移植、移植培養(yǎng)得到的成骨細(xì)胞等中的問(wèn)題。本發(fā)明的第二個(gè)目的 是提供一種用于骨形成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，通過(guò)抽取少量用于 骨形成的骨髓并只從骨髓中分離用于骨形成的有核細(xì)胞以及注射分離的細(xì) 胞，該方法消除了臨床排斥反應(yīng)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于骨形 成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，該方法可以通過(guò)以方便且快速的方式分 離用于在手術(shù)部位形成骨的有核細(xì)胞并將分離的細(xì)胞注射到患者體內(nèi)，在急 診患者或經(jīng)歷反復(fù)外科手術(shù)的患者體內(nèi)有效地形成骨。本發(fā)明的第四個(gè)目的 是提供一種用于骨形成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，該方法通過(guò)根據(jù)本 發(fā)明的方法從抽取的骨髓中分離有核細(xì)胞并將分離的細(xì)胞注射到骨形成部 位，能夠有效地誘導(dǎo)骨形成。另外，本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種用于骨 形成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，該方法極大地增加了細(xì)胞分離的可靠 性，因而消費(fèi)者可以對(duì)細(xì)胞分離有好的印象。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于骨形成的源自骨的有核細(xì)胞
的分離方法，該方法包括如下步驟清洗骨髓；溶解該骨髓中的血紅細(xì)胞； 對(duì)骨髓溶胞產(chǎn)物進(jìn)行中和；從中和的骨髓中提純有核細(xì)胞；并將該有核細(xì)胞 與用于骨形成的維持緩沖液混合。
具體實(shí)施例方式
下面，將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。 本發(fā)明的用于骨形成的源自骨髓的有核細(xì)胞的分離方法的組成如下。 在下面的描述中，當(dāng)可能使本發(fā)明的主題不清晰的時(shí)候，將會(huì)省略對(duì)此 處包括的已知功能和組成的詳細(xì)描述。此外，下面描述的術(shù)語(yǔ)是考慮本發(fā)明的功能而定義的。由于術(shù)語(yǔ)可能根 據(jù)制造商的意圖或?qū)嶋H而改變，但是術(shù)語(yǔ)的含義應(yīng)該基于本說(shuō)明書(shū)的整篇內(nèi) 容而定義。
本發(fā)明的方法包括如下步驟清洗骨髓；溶解骨髓中的血紅細(xì)胞；對(duì)骨 髓溶胞產(chǎn)物進(jìn)行中和；從中和的骨髓中提純有核細(xì)胞；并將該有核細(xì)胞與用 于骨形成的維持緩沖液混合，該方法的技術(shù)組成如下。
所述清洗骨髓的步驟包括如下子步驟從患者體內(nèi)抽取2-5毫升骨髓， 將抽取的骨髓保存在清洗緩沖液中；搖動(dòng)該骨髓清洗緩沖液，以充分地將雜 質(zhì)或脂質(zhì)成分從骨髓中除去，并將搖動(dòng)后的清洗緩沖液以1600rpm離心分離 4-5分鐘；除去上清液，將剩余的骨髓成分轉(zhuǎn)移到另一個(gè)清洗容器中，搖動(dòng) 該容納有骨髓的容器，以實(shí)現(xiàn)充分地混合，然后將搖動(dòng)后的溶液以1600rpm 離心分離4-5分鐘；并從離心后的溶液中除去上清液。
同樣，所述溶解血紅細(xì)胞的步驟包括如下子步驟向該骨髓中加入10 倍量的裂解緩沖液；并用注射器將裂解緩沖液與骨髓混合若干次，然后將該 溶液靜置幾十秒(10-20秒)。
同樣，所述中和骨髓溶液的步驟包括如下子步驟將骨髓溶液與等量的 中和緩沖液混合；并將所述溶液以1600rpm離心分離4-5分鐘，然后除去除 了用于骨形成的沉淀的有核細(xì)胞以外的上清液。
此外，提純有核細(xì)胞的步驟包括如下子步驟將4-5亳升維持緩沖液與 有核細(xì)胞在容器中混合；并將該溶液以1600rpm離心分離4-5分鐘，然后除 去上清液。
另外，將有核細(xì)胞與維持緩沖液混合的步驟包括如下子步驟根據(jù)病變， 向有核細(xì)胞中加入2-3毫升維持緩沖液，然后用注射器使容器底部的有核細(xì) 胞懸?。徊⒃撚泻思?xì)胞和維持緩沖液置于注射器中，然后將該注射器中的 物質(zhì)注射到骨缺損部位或者需要形成骨的部位。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以用快速且方便的方式在手術(shù)部位分離來(lái)自骨髓 的有核細(xì)胞，該有核細(xì)胞能夠被移植到需要形成骨的部位或者骨缺損治療的 部位。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例如下。
實(shí)施例
首先，準(zhǔn)備用于分離用于骨形成的來(lái)自骨髓的有核細(xì)胞的試劑盒，該試 劑盒具有如下組成
1) 用于對(duì)抽取的骨髓進(jìn)行保存和清洗的兩種溶液；
2) 用于血紅細(xì)胞的裂解緩沖液；
3) 中和緩沖液；
4) 用于骨形成的維持緩沖液；以及
5) 骨移植注射器。
可以使用上述試劑盒組成按照如下方式實(shí)施本發(fā)明的用于骨形成的源 自骨髓的有核細(xì)胞的分離方法
1) 從患者體內(nèi)抽取2-5毫升骨髓，將抽取的骨髓保存在清洗液中。在
從髂嵴抽取骨髓時(shí)，純骨髓的量約為2-5毫升，由于混有周圍的血液成分， 抽取的量超過(guò)所述量。因而，抽取2-5毫升的量的骨髓可以有效地抽取純骨髓。
2) 搖動(dòng)容納有置于清洗溶液中的骨髓的容器，以充分地將雜質(zhì)或脂質(zhì) 成分從骨髓中除去，然后將該溶液以1600rpm離心分離5分鐘。離心速度
(rpm)和時(shí)間是最小限度，在該條件下細(xì)胞可以不被損壞地沉淀下來(lái)。
3) 除去上清液后，將容器底部剩余的骨髓成分轉(zhuǎn)移到第二清洗溶液中， 并搖動(dòng)該容納有骨髓的容器，以將骨髓與第二清洗溶液充分地混合，然后將 該溶液以1600rpm離心分離4-5分鐘。
4) 除去上清液后，向剩余的骨髓溶液中加入IO倍量的用于血紅細(xì)胞的裂解緩沖液。該10倍量的裂解緩沖液用于利用滲透壓將骨髓溶液中的血紅 細(xì)胞溶解，同時(shí)將對(duì)有核細(xì)胞的損傷最小化。
5) 用注射器使裂解緩沖液與該骨髓溶液彼此混合若干次，然后將該溶 液靜置幾十秒(10-20秒)，以使血紅細(xì)胞裂解。
6) 向該骨髓中加入等量的中和緩沖液，然后小心地?fù)u動(dòng)使該中和緩沖 液與骨髓混合。此處所用的中和緩沖液是IO倍濃縮的緩沖液。
7) 將所述溶液以1600rpm離心分離5分鐘之后，除去除了用于骨形成 的沉淀的有核細(xì)胞以外的上清液。
8) 向容納有有核細(xì)胞的容器中加入用于骨形成的維持緩沖液，然后將 該容器搖動(dòng)若干次。
9) 將該溶液以1600rpm離心分離5分鐘，除去上清液。
10) 根據(jù)病變的尺寸，向細(xì)胞中加入適當(dāng)量的用于骨形成的維持緩沖液， 然后用注射器使容器底部的細(xì)胞懸浮。
11) 將該用于骨形成的有核細(xì)胞和用于骨形成的維持緩沖液置于注射器 中，然后將注射器中的物質(zhì)注射到骨缺損部位或者需要形成骨的部位。
根據(jù)上述方法，從由患者體內(nèi)抽取的骨髓中分離用于骨形成的有核細(xì) 胞，并注射到需要形成骨的部位，從而不會(huì)發(fā)生臨床排斥反應(yīng)。而且，由于 在骨髓抽取后，該用于骨形成的有核細(xì)胞在很短的時(shí)間內(nèi)被分離并移植，可 以有效快捷的方式誘導(dǎo)骨形成。
雖然本發(fā)明可以具有各種改變和選擇的形式，此處通過(guò)對(duì)附圖
中的實(shí)施 例進(jìn)行詳細(xì)描述的方式說(shuō)明了特定的實(shí)施方式。但是，應(yīng)該理解的是，本發(fā) 明不欲以公開(kāi)的特殊方式來(lái)限定。相反地，本發(fā)明包括由隨附的權(quán)利要求所 限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有改變、等價(jià)和選擇。
如上述的詳細(xì)描述，本發(fā)明的目的在于改進(jìn)植入術(shù)、骨移植、移植培養(yǎng) 的成骨細(xì)胞等中出現(xiàn)的問(wèn)題。特別地，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)抽取少量用于骨形成的骨髓，從該骨髓中只分離出用于骨形成的有核細(xì)胞，并注射分離的細(xì)胞， 消除了臨床排斥反應(yīng)。
而且，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)以快速且方便的方式分離用于在手術(shù)部位形成 骨的有核細(xì)胞并將分離的細(xì)胞注射到患者體內(nèi)，在急診患者或經(jīng)歷反復(fù)外科 手術(shù)的患者體內(nèi)有效地形成骨。
另外，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)用本發(fā)明的方法從骨髓中分離有核細(xì)胞并將分 離的細(xì)胞注射到骨形成部位，能夠有效地誘導(dǎo)骨形成。
結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明，極大地增加了細(xì)胞分離的可靠性，因而消費(fèi)者可以 對(duì)細(xì)胞分離有好的印象。
權(quán)利要求
1、一種用于骨形成的源自骨的有核細(xì)胞的分離方法，該方法包括如下步驟清洗骨髓；溶解該骨髓中的血紅細(xì)胞；對(duì)骨髓溶胞產(chǎn)物進(jìn)行中和；從中和的骨髓中提純有核細(xì)胞；并將該有核細(xì)胞與用于骨形成的維持緩沖液混合。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述清洗骨髓的步驟包括如下 子步驟.-從患者體內(nèi)抽取2-5毫升骨髓，并將抽取的骨髓保存在骨髓清洗緩沖液中；將該骨髓清洗緩沖液搖動(dòng)40-50次，以充分地將雜質(zhì)或脂質(zhì)成分從骨髓 中除去，并將搖動(dòng)后的清洗緩沖液以1600rpm離心分離4-5分鐘；除去上清液，將剩余的骨髓成分轉(zhuǎn)移到另一個(gè)清洗容器中，將該容納有 骨髓的容器搖動(dòng)40-50次，然后將搖動(dòng)后的溶液以1600rpm離心分離4-5分 鐘；從離心后的溶液中除去上清液； 向骨髓中加入IO倍量的裂解緩沖液；和用注射器將所述裂解緩沖液與骨髓混合若干次，然后將該溶液靜置幾十 秒(10-20秒)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)骨髓溶液進(jìn)行中和的步驟包括如下子步驟將骨髓溶液與等量的中和緩沖液混合；以及將所述溶液以1600rpm離心分離4-5分鐘，然后除去除了用于骨形成的 沉淀的有核細(xì)胞以外的上清液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述提純有核細(xì)胞的步驟包括如下子步驟將4-5亳升維持緩沖液與有核細(xì)胞在容器中混合；以及 將所述溶液以1600rpm離心分離4-5分鐘，然后除去上清液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述將有核細(xì)胞與維持緩沖液 混合的步驟包括如下子步驟根據(jù)病變，向所述有核細(xì)胞中加入2-3毫升所述維持緩沖液，然后用注 射器使容器底部的有核細(xì)胞懸??；以及將所述有核細(xì)胞和維持緩沖液置于注射器中，然后將該注射器中的物質(zhì) 注射到骨缺損部位或者需要形成骨的部位。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于骨形成的源自骨髓的有核細(xì)胞的分離方法。該方法包括如下步驟清洗骨髓；溶解該骨髓中的血紅細(xì)胞；對(duì)骨髓溶胞產(chǎn)物進(jìn)行中和；從中和的骨髓中提純有核細(xì)胞；并將該有核細(xì)胞與用于骨形成的維持緩沖液混合。根據(jù)本發(fā)明，可以用快速且方便的方式分離源自骨髓的有核細(xì)胞，該有核細(xì)胞能夠被移植到需要形成骨的部位或者需要進(jìn)行骨缺損治療的部位。結(jié)果，可以通過(guò)以方便且快速的方式分離用于在手術(shù)部位形成骨的有核細(xì)胞并將分離的細(xì)胞注射到患者體內(nèi)，在急診患者或經(jīng)歷反復(fù)外科手術(shù)的患者體內(nèi)有效地形成了骨。
文檔編號(hào)C12N5/077GK101432421SQ200680054424
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者張?jiān)诘? 張晶皓, 樸炫信, 李賽博 申請(qǐng)人:世元世龍技術(shù)株式會(huì)社