專(zhuān)利名稱(chēng)：富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的骨髓組分的分離及其促進(jìn)結(jié)締組織形成的用途的制作方法
本申請(qǐng)要求2003年7月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利序列號(hào)60/485,445的權(quán)益，以整體納入本文作為參考。該申請(qǐng)也涉及2002年4月4日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/116,729(2002年12月5日公布為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)2002/0182664)，以整體納入本文作為參考。
本申請(qǐng)總地涉及促進(jìn)組織生長(zhǎng)的組合物和方法，具體涉及富含一種或多種結(jié)締組織(如骨)生長(zhǎng)促進(jìn)成分的骨髓分離物，形成該分離物的方法以及用該分離物促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)的方法。
近年來(lái)，當(dāng)在骨移植步驟中采用骨髓時(shí)，一般從髂嵴中抽取骨髓，并且不對(duì)該骨髓進(jìn)行任何次級(jí)加工就直接用作骨移植物。該骨髓抽取物的大部分是促進(jìn)骨生成作用最小的血液。而且，血液中大量的血小板釋放出不良的生長(zhǎng)因子，如PDGF(血小板衍生生長(zhǎng)因子)、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)和FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，在一些情況下它們顯示具有抑制骨形成的作用。
因此，需要分離骨髓的諸成分，具體是促進(jìn)結(jié)締組織形成的成分，和將該分離成分用于結(jié)締組織修復(fù)，如骨移植和軟骨修復(fù)改進(jìn)或替代技術(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種獲得骨髓組分的方法。該方法包括離心含有全血和骨髓的生物樣品，根據(jù)密度對(duì)樣品的諸成分進(jìn)行分離。該分離提供了以下密度降低順序的組分(1)富含血細(xì)胞的組分；(2)暗黃層組分；(3)富含血小板的組分和(4)血小板含量很少的組分。分離單獨(dú)的或者與全部或部分富含血小板組分混合的暗黃層組分，制備富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種治療病人的方法。該方法包括分離得到包含促進(jìn)結(jié)締組織形成成分的骨髓組分，并將該骨髓組分植入病人的組織缺損部位。根據(jù)本發(fā)明，在植入手術(shù)中進(jìn)行該骨髓組分的分離。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療病人的方法，包括獲得病人的骨髓樣品，離心該樣品根據(jù)密度將樣品分成不同組分，這些組分包括富含組織促進(jìn)成分的組分。分離得到富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分將其植入病人中。根據(jù)本發(fā)明，在植入手術(shù)中進(jìn)行所述獲得、離心、分離步驟。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了獲得富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的骨髓組分的方法。該方法包括離心含有骨髓的生物樣品，根據(jù)密度將該樣品分成(不同)組分，這些組分包括富含生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。然后分離得到富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。
從本說(shuō)明書(shū)中可以明白本發(fā)明的其它實(shí)施方式，以及特征和優(yōu)點(diǎn)。


圖1-6顯示從6名不同供者抽取的含有全血和骨髓的生物樣品中分開(kāi)和分離富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分的測(cè)試結(jié)果，其中圖1顯示編號(hào)30500供者的測(cè)試結(jié)果，圖2顯示編號(hào)30501供者的測(cè)試結(jié)果，圖3顯示編號(hào)30506供者的測(cè)試結(jié)果，圖4顯示編號(hào)30526供者的測(cè)試結(jié)果，圖5顯示編號(hào)30527供者的測(cè)試結(jié)果，圖6顯示編號(hào)30561供者的測(cè)試結(jié)果。
為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明原理的理解，將參考本發(fā)明的某些實(shí)施方式，用具體化的語(yǔ)言對(duì)其進(jìn)行描述。然而應(yīng)理解，它們不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍，應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常能夠?qū)κ纠灾踩胛镞M(jìn)行改變和改進(jìn)，以及對(duì)本文所述原理進(jìn)行進(jìn)一步應(yīng)用。
如上所述，本發(fā)明提供富含衍生自骨髓的一種或多種結(jié)締組織(如骨)生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物，制備該分離物的方法和用該分離物促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)的方法。
全血包含以下成分血漿、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。全血的液體部分稱(chēng)為血漿，是一種蛋白質(zhì)-鹽溶液，其中懸浮著紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。血漿的90％是水，它占血液總體積的55％。血漿含有清蛋白(主要蛋白成分)、纖維蛋白原(部分負(fù)責(zé)凝血)，球蛋白(包括抗體)和其它凝血蛋白。血漿起著各種功能，從維持合適血壓到提供一定量的凝血和免疫力所必需的蛋白質(zhì)。通過(guò)將液體部分與懸浮于血液的細(xì)胞分開(kāi)而獲得血漿。紅細(xì)胞(紅血球)所含的血紅蛋白是一種在整個(gè)機(jī)體中攜帶氧氣并賦予血液紅色的含鐵蛋白。紅細(xì)胞占血液體積的百分?jǐn)?shù)稱(chēng)為“血細(xì)胞比容”。白細(xì)胞(白血球)負(fù)責(zé)保護(hù)機(jī)體免受外界物質(zhì)如細(xì)菌、真菌和病毒的侵襲。用于此目的的白細(xì)胞有以下幾種類(lèi)型，如保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境感染并破壞侵入的細(xì)菌和病毒的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，和有助于免疫防御的淋巴細(xì)胞。血小板(凝血細(xì)胞)是血液的小細(xì)胞成分，它通過(guò)粘結(jié)于血管內(nèi)壁幫助凝血過(guò)程。血小板防止外傷和血管滲漏引起的大量失血。
如果收集全血并通過(guò)加入合適的抗凝劑防止凝血，可將血液離心成各成分部分。離心將導(dǎo)致密度最高的紅細(xì)胞壓積到旋轉(zhuǎn)容器的最外側(cè)部分，而密度最低的血漿遷入旋轉(zhuǎn)容器的內(nèi)側(cè)部分。將血漿和紅細(xì)胞分開(kāi)的是一層薄的白色或淡灰色層，稱(chēng)為暗黃層。暗黃層包含白細(xì)胞和血小板，它們共約占血液總體積的1％。
骨髓是一種復(fù)雜的組織，它包含造血干細(xì)胞、紅白細(xì)胞及其前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞和形成稱(chēng)為“基質(zhì)”的結(jié)締組織網(wǎng)絡(luò)的一組細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。來(lái)自基質(zhì)的細(xì)胞通過(guò)直接與細(xì)胞表面蛋白相互作用和分泌生長(zhǎng)因子在形態(tài)上調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化，并參與骨結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)和支持。動(dòng)物模型研究說(shuō)明含有“基質(zhì)前”體細(xì)胞的骨髓具有分化為軟骨、骨和其它結(jié)締組織細(xì)胞的能力。Beresford“骨和骨髓的成骨干細(xì)胞和基質(zhì)系統(tǒng)”(Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow)，Clin.Orthop.，240270，1989。近年來(lái)的證據(jù)顯示，這些稱(chēng)為多能間充質(zhì)干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞在激活后能夠產(chǎn)生幾種不同類(lèi)型的細(xì)胞系(即骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等)。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中與各種其它細(xì)胞(即紅細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等)在一起，其存在量非常少，并與年齡呈逆相關(guān)，受許多生物活化因子的影響，它們能夠分化成各種結(jié)締組織。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，將含有骨髓的生物樣品離心，根據(jù)密度將樣品的成分分成各種組分，包括富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分如間充質(zhì)干細(xì)胞。然后分離得到富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。所得的分離物可含有一種或多種結(jié)締組織生長(zhǎng)成分，其濃度高于初始樣品的濃度?？蓪⑺玫姆蛛x物直接施加于骨或其它組織缺損部位?；蛘?，可將該分離物與運(yùn)載體組合，將得到的植入物施加于骨或其它組織缺損部位。在這個(gè)方面，在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，可將含有細(xì)胞的分離物組分單獨(dú)或與運(yùn)載體或其它物質(zhì)(例如另一治療物質(zhì))組合施加于組織缺損部位，對(duì)該分離物無(wú)需任何離體擴(kuò)增或其它培養(yǎng)。在這種應(yīng)用中，如果需要，可將該分離組分裝入合適的遞送設(shè)備，如注射器、導(dǎo)管等中，無(wú)需擴(kuò)增或其它培養(yǎng)。在施加于骨或其它組織缺損部位或用于其它應(yīng)用之前，也可修飾(例如用編碼骨形成多肽的核酸轉(zhuǎn)染)該分離物。該分離物基本上由骨髓(例如，骨髓抽取物)組成。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，骨髓抽取物可以是該分離物中唯一的含細(xì)胞成分。
同時(shí)，經(jīng)離心的生物樣品可不含細(xì)胞培養(yǎng)基物質(zhì)，在本發(fā)明的某些形式中，經(jīng)離心的生物樣品可基本上由來(lái)自準(zhǔn)備植入得到的分離物組分的病人的組織材料(如任選地與血液或其它組織材料組合的骨髓材料)組成，任選地含有一種或多種抗凝劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，離心含有全血(如外周血)和骨髓的生物樣品，根據(jù)密度分離樣品各成分。分離樣品導(dǎo)致產(chǎn)生密度降低順序的以下組分富含紅細(xì)胞的組分；富含白細(xì)胞的組分或暗黃層組分；富含血小板的組分和血小板含量很少的組分。然后，可分離暗黃層組分，可能還有與暗黃層組分相鄰的全部或部分富含血小板的組分，制備富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物，得到的分離物可含有一種或多種結(jié)締組織生長(zhǎng)成分，其濃度高于初始樣品的濃度。結(jié)締組織生長(zhǎng)成分包括但不限于單核細(xì)胞如造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。該結(jié)締組織生長(zhǎng)成分可包含例如，結(jié)締組織的祖細(xì)胞。
在制備待離心加工的生物樣品過(guò)程中，除了用全血與骨髓材料形成混合物以外，或作為其替代方式，可將全血的某一組分與骨髓材料混合。根據(jù)本發(fā)明的說(shuō)明，在待加工生物樣品中可以采用全血的含有紅細(xì)胞的組分或血漿組分。
在本發(fā)明待加工生物樣品的制備中采用的全血或其組分可以是，例如人組織材料。當(dāng)用于產(chǎn)生供植入病人中的材料時(shí)，全血或全血組分可以是病人自體的、同種異體的或異種的。在同種異體的情況下，全血或組分可以配型，采用與病人HLA相匹配的血液。
富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的生物樣品和/或分離物也可含有抗凝劑。合適的抗凝劑包括但不限于肝素、檸檬酸鈉和EDTA。
而且，富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物可以與一種溶液(如無(wú)菌等滲溶液)組合。合適的等滲溶液包括但不限于磷酸緩沖鹽水和組織培養(yǎng)基如最低必需培養(yǎng)基。
如上所述，可用離心法將含有骨髓的生物樣品分成各種組分，包括富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。然后可分離富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分，再將得到的分離物用于骨移植步驟。例如，可將該分離物置于自體骨移植物上和/或骨移植替代物上或與其結(jié)合，提高它們的骨形成潛能和移植物的融合速率。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，可通過(guò)從含有骨髓的生物樣品中選擇性分離促進(jìn)骨形成的成分或通過(guò)降低該樣品中抑制骨形成的成分的濃度來(lái)優(yōu)化骨形成效果。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可在手術(shù)室中用手提式離心機(jī)，如Medtronic，Inc制造的MagllanTM離心機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行這種優(yōu)化。然后，將得到的富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的骨髓分離物直接使用或與運(yùn)載體如自體骨移植物或骨移植替代物組合使用?？稍谝粋€(gè)步驟中(即手術(shù)中)制備該分離物(即可獲得含有骨髓的生物樣品，將其分成(不同)組分，和分離富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分)并施加于組織缺損部位。所述組織缺損部位可以是骨缺損部位。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，可在不同的步驟中制備該分離物并施加于病人的組織缺損部位。例如，在第一個(gè)步驟中，獲得病人的骨髓樣品?？筛鶕?jù)本發(fā)明加工如此獲得的骨髓樣品，以獲得富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物。該加工可包括與在第一步驟中獲得病人的全血如外周血的樣品相結(jié)合的加工。在第二步驟中，可將獲得的含有組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物植入病人的組織缺損部位，如骨缺損部位。
如上所述，從中分離得到富含結(jié)締組織生長(zhǎng)(成分)的組分的生物樣品可包含血液(例如外周血)和骨髓(例如骨髓抽取物)的混合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，該樣品可含有一份(體積)骨髓和兩份體積的血液(即骨髓和血液的體積比是1∶2)。也可采用骨髓與血液其它體積比的樣品。例如，骨髓與血液的體積比可以是1∶1、2∶1、1∶3、3∶1等。骨髓與血液的體積比可以在，例如1∶100至100∶1的范圍內(nèi)，更通常是1∶3至3∶1的范圍內(nèi)，可對(duì)其進(jìn)行調(diào)整以實(shí)現(xiàn)分離物的所需加工特征和用量。
骨髓可來(lái)自任何來(lái)源，包括例如來(lái)自網(wǎng)狀骨或松質(zhì)骨的小梁之間的空隙，來(lái)自長(zhǎng)骨的髓腔和/或來(lái)自哈弗斯骨管。骨髓可以是人或其它哺乳動(dòng)物來(lái)源，當(dāng)骨髓用于制備植入病人的材料時(shí)，該骨髓可以是病人自體、同種異體或異種的。例如，骨髓可以是抽取骨髓(例如抽取自髂嵴的骨髓)。血液和骨髓可以各自取自病人，混合成樣品，分離(例如通過(guò)離心)樣品中富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分，將富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物施加于組織缺損部位。該步驟包括制備此種分離物和將分離物施加于缺損部位，可在一次操作中(即手術(shù)中)進(jìn)行該步驟。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物的血小板產(chǎn)率(即分離物中的血小板濃度除以初始樣品中的血小板濃度)可以比初始樣品高2倍、3倍或4倍。富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物的血細(xì)胞比容也可低于50體積％、低于25體積％或低于12.5體積％。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物比初始樣品的血小板產(chǎn)率(即分離物中的血小板濃度除以初始樣品中的血小板濃度)高4倍，血細(xì)胞比容低于12.5體積％。
如上所述，可用離心機(jī)系統(tǒng)將含有骨髓的生物樣品分成各種組分包括富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分?？刹捎媚軐⑸飿悠?例如含有血液的樣品)分成(不同)組分的任何離心機(jī)系統(tǒng)。離心機(jī)的例子是Medtronic，Inc生產(chǎn)的MagellanTMAutologousPlatelet Separator(APS)系統(tǒng)。以下美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)了將血液分成各種組分的離心機(jī)系統(tǒng)和方法2001年4月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/832,517，2002年2月21日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20020022213；2001年4月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/832,463，2002年10月10日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20020147094；2001年4月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/833,234，2001年12月27日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20010055621；2001年9月24日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/961,793，2003年3月27日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20030060352；2002年4月4日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)10/116,729，2002年12月5日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20020182664；以及2001年4月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/833,230，2002年10月10日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20020147098。將這些申請(qǐng)各自以整體納入本文作為參考?？捎眠@些申請(qǐng)中公開(kāi)的方法和系統(tǒng)從含有骨髓的生物樣品中分離得到富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分。具體說(shuō)，可以離心含有血液和骨髓的樣品，可用上述申請(qǐng)中公開(kāi)的裝置和方法分離對(duì)應(yīng)于暗黃層的組分(即第二高密度的組分)和全部或部分富含血小板的血漿組分(即與暗黃層組分相鄰血漿層的密度較高的區(qū)域)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，該裝置可包含一個(gè)傳感器組件，用于根據(jù)液體密度的改變來(lái)鑒定樣品不同組分之間的界面。例如，可用上述申請(qǐng)中所述的傳感器組件鑒定富含紅細(xì)胞的區(qū)域和暗黃層組分或富含血小板的血漿組分之間的界面，以及富含血小板的血漿組分和血小板含量很少的血漿組分之間的界面?？衫脴悠凡煌M分之間界面位置的知識(shí)從樣品中分離所需組分。
從生物樣品中分離得到的富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分，可含從含有血液和骨髓的樣品分離產(chǎn)生的暗黃層組分(即第二高密度組分)和全部或部分富含血小板的血漿組分(即與暗黃層組分相鄰血漿層的密度較高的區(qū)域)。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，該分離物可包含高達(dá)50體積％的樣品。例如，該分離物可包含40體積％、30體積％或20體積％的樣品。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，從生物樣品中分離得到的富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分可包含5-17體積％的初始樣品。例如，對(duì)于60毫升樣品，分離物的體積可以為3-10毫升。根據(jù)其它實(shí)施方式，分離物可包含約10體積％的初始樣品(例如60毫升樣品為6毫升分離物)。雖然上面公開(kāi)了60毫升樣品體積，但也可采用較大或較小體積的生物樣品。例如，可以根據(jù)可利用的血液或骨髓的量和/或給定步驟所需分離物的量，選擇生物樣品的體積。例如，生物樣品的體積可以高達(dá)100毫升、75毫升、50毫升或25毫升。
以足以實(shí)現(xiàn)所需程度分離的時(shí)間和轉(zhuǎn)速離心樣品。例如，可以0-5,000rpm之間的轉(zhuǎn)速離心約60秒-10分鐘。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，離心17-20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，轉(zhuǎn)速越快通常分離生物樣品的時(shí)間越短。通常需要約60分鐘或更少時(shí)間實(shí)現(xiàn)分離。而且，當(dāng)從病人獲得骨髓材料來(lái)產(chǎn)生用于再植入的組分時(shí)，需要在獲得骨髓后馬上，例如在約2小時(shí)內(nèi)，宜1小時(shí)內(nèi)離心含有骨髓的生物樣品。同樣，可在得到本發(fā)明分離組分后馬上，例如在約2小時(shí)內(nèi)，宜1小時(shí)內(nèi)再植入該分離組分。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，獲得骨髓組分，離心得到該分離組分以及植入該分離組分都可在同一天，例如在不多于約3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。
如上所述，在一種應(yīng)用模式中，本發(fā)明的分離組分可用于植入病人。同樣，本發(fā)明分離物可用作例如從該分離組分中回收分離的細(xì)胞和/或涉及其中成分的診斷或研究，如涉及分離組分中所含細(xì)胞的研究中，進(jìn)一步純化各組分的來(lái)源。
可植入本發(fā)明分離物，以治療各種疾病的組織缺損?？芍委煹慕M織缺損例子包括骨缺損、神經(jīng)缺損、肌肉缺損、肌腱缺損、真皮缺損和骨髓基質(zhì)組織缺損。通常在涉及骨囊腫的組織損傷修復(fù)中，可修飾骨組織的例子包括胸骨、顱骨、長(zhǎng)骨、脊椎部件如椎骨的骨組織?？尚迯?fù)神經(jīng)組織的例子包括中樞和外周神經(jīng)組織。也可用本發(fā)明植入物治療軟骨組織(缺損)，通常包括關(guān)節(jié)損傷的治療，提供對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療，或修復(fù)肌腱和韌帶。
在治療肌肉組織過(guò)程中，可將該植入物植入心血管或骨骼肌中。在修復(fù)或支撐椎間盤(pán)核組織中，可將本發(fā)明植入物植入椎間盤(pán)間隙中，該植入物也可用于牙科應(yīng)用，例如包括牙骨和/或齒齦組織。在這些和其它治療中，可以將本發(fā)明分離物與蛋白質(zhì)或其它治療物質(zhì)、基因或其它有益物質(zhì)一起引入。
在修復(fù)骨組織中，可任選地將本發(fā)明分離物與誘導(dǎo)或加速祖細(xì)胞或干細(xì)胞分化成成骨譜系細(xì)胞的至少一種生物活性因子相混合?？稍谥踩朐摲蛛x物之前、期間或之后使該分離物與所述生物活性物質(zhì)離體接觸，或?qū)⑵渥⑸淙肴睋p部位。所述生物活性物質(zhì)可以是包括各種組織生長(zhǎng)因子的TGF-ss超家族成員，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6和BMP-7。
在修復(fù)軟骨組織中，可植入本發(fā)明分離物以治療淺表軟骨缺損或全厚度軟骨缺損，以治療例如骨質(zhì)疏松癥患者的膝蓋骨或椎間盤(pán)軟骨，或再生關(guān)節(jié)軟骨?？捎帽景l(fā)明分離物治療的關(guān)節(jié)包括但不限于膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、跗和跖關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、脊椎關(guān)節(jié)、腕和掌關(guān)節(jié)以及暫時(shí)性(temporal)頜關(guān)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，可在修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物后再植入。例如，可用合適的基因和/或蛋白修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物中的細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)，以指導(dǎo)譜系特異性細(xì)胞擴(kuò)增和/或分化或多譜系細(xì)胞擴(kuò)增或分化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可用含有編碼成骨誘導(dǎo)蛋白或多肽的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染富含結(jié)締組織生長(zhǎng)因子成分中的細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)?？捎稍摵塑账嵝蛄芯幋a的成骨誘導(dǎo)蛋白的例子包括但不限于BMP、LMP或sMAD蛋白或其活性(即成骨誘導(dǎo))部分。編碼成骨誘導(dǎo)蛋白或多肽的核苷酸序列可操作性連接于一個(gè)啟動(dòng)子。例如，該核苷酸序列可以位于載體如表達(dá)載體(如腺病毒)中。
以下的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)了包含編碼LIM礦化蛋白(LMP)的核苷酸序列的核酸和載體以及用含有編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法1998年7月29日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/124,238，現(xiàn)在是美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,300,127；2000年4月28日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/959,578，待審中；2002年11月13日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/292,951，2003年9月25日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20030180266；以及2003年3月7日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/382,844，2003年12月4日公開(kāi)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告號(hào)20030225021。將這些申請(qǐng)各自以整體納入本文作為參考?？刹捎眠@些申請(qǐng)中公開(kāi)的任何材料和技術(shù)修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)因子成分中的細(xì)胞。
該核酸編碼的成骨誘導(dǎo)多肽可以是人LIM礦化蛋白(如hLMP-1或hLMP-3)的活性(即成骨誘導(dǎo))部分。例如，成骨誘導(dǎo)多肽可包含來(lái)自hLMP-1或hLMP-3序列的至少″n″個(gè)連續(xù)氨基酸，其中n是5、10、15或20。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，成骨誘導(dǎo)多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨誘導(dǎo)部分，包含以下氨基酸序列的至少″n″個(gè)連續(xù)氨基酸ASAPAADPPRYTFAPSVSLNKTARPFGAPPPADSAPQQNG(SEQ ID NO1)或以下氨基酸序列的至少″n″個(gè)連續(xù)氨基酸ASAPAADPPRYTFAPSVSLNKTARPFGAPPPADSAPQQN(SEQ ID NO2)其中n是5、10、15或20。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，成骨誘導(dǎo)多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨誘導(dǎo)部分，包含以下氨基酸序列的至少″n″個(gè)連續(xù)氨基酸PPPADSAPQ(SEQ ID NO3)，其中n是4、5、6、7或8。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，成骨誘導(dǎo)多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨誘導(dǎo)部分，包含序列PPPAD(SEQ ID NO4)。
成骨誘導(dǎo)多肽(例如hLMP-1或hLMP-3蛋白的成骨誘導(dǎo)部分)可包含多達(dá)15個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方式，成骨誘導(dǎo)多肽(例如hLMP-1或hLMP-3蛋白的成骨誘導(dǎo)部分)可包含多達(dá)20、25、30、35、40、45或50個(gè)氨基酸殘基。
成骨誘導(dǎo)多肽可以是合成的多肽。例如，成骨誘導(dǎo)多肽可以是含有與hLMP-1或hLMP-3的成骨誘導(dǎo)部分對(duì)應(yīng)序列的合成多肽。
也可用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)與成骨誘導(dǎo)蛋白的偶聯(lián)物或編碼成骨誘導(dǎo)蛋白的核酸修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物。例如，可使富含結(jié)締組織生長(zhǎng)因子成分中的細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)與成骨誘導(dǎo)多肽的偶聯(lián)物或編碼成骨誘導(dǎo)蛋白的核酸接觸。成骨誘導(dǎo)多肽可以是BMP、LMP、sMAD蛋白或成骨誘導(dǎo)蛋白的活性(即成骨誘導(dǎo))部分。2003年3月24日提交的臨時(shí)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)60/456,551中公開(kāi)了PTD和成骨誘導(dǎo)蛋白的偶聯(lián)物，以整體納入本文作為參考?？蓪⒃撋暾?qǐng)中公開(kāi)的任何偶聯(lián)物和技術(shù)用于修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)因子成分中的細(xì)胞。也可將如上所述PTD與人LIM礦化蛋白(如hLMP-1或hLMP-3)活性(即成骨誘導(dǎo))部分的偶聯(lián)物用于修飾富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分分離物中的細(xì)胞。
也可使富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分分離物中的細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)與成骨誘導(dǎo)多肽接觸。例如，可將分離物與成骨誘導(dǎo)蛋白(例如BMP-2)混合。然后將修飾的分離物置于運(yùn)載體上植入病人。
在這個(gè)方面，可用于本發(fā)明分離材料的運(yùn)載體可以是空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的(例如糊或泥)運(yùn)載體。
運(yùn)載體可以是，例如可吸收性多孔基質(zhì)。在這個(gè)方面，可吸收性多孔基質(zhì)在某些實(shí)施方式中是成膠性基質(zhì)。各種膠原物質(zhì)都適用于該可吸附性基質(zhì)?？筛鶕?jù)氨基酸序列、碳水化合物含量和是否存在二硫鍵交聯(lián)將天然存在的膠原細(xì)分為幾種不同類(lèi)型。I型和III型膠原是膠原的兩種最常見(jiàn)亞型。I型膠原存在于皮膚、肌腱和骨中，而III型膠原主要見(jiàn)于皮膚中?？蓮钠つw、骨、肌腱或軟骨的基質(zhì)中得到膠原，并通過(guò)本領(lǐng)域公知方法純化?；蛘?，可購(gòu)得膠原。該多孔基質(zhì)組合物宜包括I型牛膠原。
運(yùn)載體基質(zhì)的膠原還可以是非端肽(atelopeptide)膠原和/或端肽(telopeptide)膠原。而且，可采用非纖維和/或纖維膠原。非纖維膠原是經(jīng)溶解不能被重建為其天然纖維形式的膠原。
除了膠原或膠原的替代物外，也可用其它有機(jī)材料如天然或合成聚合材料制備合適的可吸收性運(yùn)載體基質(zhì)材料。例如，可吸收運(yùn)載體可包括明膠(如發(fā)泡明膠)，或可吸收性合成聚合物如聚乳酸聚合物、聚乙醇酸聚合物或它們的共聚合物。已知其它天然和合成聚合物也可用于制備生物相容性可吸收基質(zhì)材料，可用于本發(fā)明。
運(yùn)載體也可以是或包括天然和/或合成礦物成分。例如，可通過(guò)顆粒性礦物質(zhì)，包括粉末形式或較大的顆粒礦物質(zhì)提供該礦物成分。在某些實(shí)施方式中，隨著可吸收基質(zhì)材料被吸收，顆粒性礦物成分能為生長(zhǎng)中的骨提供有效支架。礦物質(zhì)可以是，例如骨尤其是皮質(zhì)骨礦物質(zhì)，或合成的生物陶瓷如生物相容性磷酸鈣陶瓷。陶瓷的例子包括磷酸三鈣、羥基磷灰石和兩相磷酸鈣。可以購(gòu)得或通過(guò)本領(lǐng)域已知方法獲得或合成這些礦物成分。
如上所述，在本發(fā)明中可采用兩相磷酸鈣提供含礦物質(zhì)的運(yùn)載體。這種兩相磷酸鈣所含的磷酸三鈣∶羥基磷灰石的重量比宜為約50∶50-95∶5，優(yōu)選約70∶30-95∶5，更優(yōu)選約80∶20-90∶10，最優(yōu)選約85∶15。
運(yùn)載體可包括提供支架的礦物質(zhì)量，該支架能在病人需要骨生長(zhǎng)的空隙中有效保留足夠長(zhǎng)的時(shí)間以形成骨。一般地，這個(gè)時(shí)間約為8-12周，但是在具體情況下也可能更長(zhǎng)或更短。為這些目的必須在運(yùn)載體中提供最低水平的礦物質(zhì)，這也取決于該分離物中的組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的活性水平，和其它物質(zhì)如BMP或其它成骨蛋白是否與該分離物的組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分組合一起加入到運(yùn)載體中。
在本發(fā)明的某些形式中，運(yùn)載體可包括包裹在用膠原、明膠或可吸收性合成聚合物等物質(zhì)制備的多孔有機(jī)基質(zhì)中的顆粒性礦物成分。在這個(gè)方面，第一個(gè)植入材料中的顆粒性礦物質(zhì)∶可吸收性多孔基質(zhì)的重量比可為至少約4∶1，更通常約為10∶1。在高度礦化的運(yùn)載體中，顆粒礦物質(zhì)將占第一個(gè)植入材料的至少95重量％。例如，可提供含有約97-99重量％的顆粒性礦物質(zhì)和約1-3％的膠原或其它基質(zhì)形成材料的運(yùn)載體材料。而且，該礦物成分的平均粒度，例如，至少約為0.5毫米，更優(yōu)選約0.5-5毫米，最優(yōu)選約1-3毫米。
用于與該分離物組合的運(yùn)載體可以是空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的，例如是可流動(dòng)或有韌性的物質(zhì)，如糊或泥。這種運(yùn)載體的例子可包括植入后能保持在組織缺損部位的生物可吸收性、空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性材料。這種運(yùn)載體可包括可吸收性有機(jī)材料如生物或合成來(lái)源的大分子，例如明膠、透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、膠原、肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖等?？膳c摻入了本文上述顆粒性礦物成分一起或不與其一起使用這種材料。在某種形式中，可將可吸收性運(yùn)載體配制成組合物，以使組合物在高于待植入該材料的病人體溫時(shí)可流動(dòng)，但在等于或略高于體溫時(shí)轉(zhuǎn)變成不易流動(dòng)?？蓪⒖晌招赃\(yùn)載體配制到該植入組合物中，使其可流動(dòng)狀態(tài)是液體或可流動(dòng)的凝膠，而不可流動(dòng)狀態(tài)是固化凝膠或固體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可吸收性運(yùn)載體可包括明膠，和/或可摻入顆粒性礦物質(zhì)，其含量約占運(yùn)載體組合物的20-80體積％，更常約占40-80體積％。
在本發(fā)明的某些形式中，運(yùn)載體可以是提供生物惰性表面的成骨誘導(dǎo)基質(zhì)，該表面可接受宿主新骨的生長(zhǎng)。例如，運(yùn)載體可以是膠原海綿或上述具有這些特征的另一空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定或不穩(wěn)定的運(yùn)載體。
運(yùn)載體可包含可調(diào)節(jié)其它細(xì)胞生長(zhǎng)或分化的生長(zhǎng)因子?？刹捎玫纳L(zhǎng)因子包括但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白、sMAD蛋白和LIM礦化蛋白。運(yùn)載體中也可包括脫礦物的骨基質(zhì)。例如，可將的脫礦物骨基質(zhì)的粉末或顆粒摻入運(yùn)載體中。
也可將該分離物與同種異體移植骨和/或自體移植骨混合。例如，可將該分離物與同種異體移植骨和/或自體移植骨混合，將得到的植入物植入宿主。同樣，在植入之前或之后，可將本發(fā)明分離物與一種或多種血小板激活物質(zhì)，如凝血酶混合，以激活該分離物中所含的血小板，和/或與涉及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的其它物質(zhì)如纖維蛋白原混合。
該分離物或含有該分離物的植入物可通過(guò)一種或多種機(jī)制，如骨發(fā)生、骨傳導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)而增強(qiáng)或加速新骨組織的生長(zhǎng)。例如，該分離物或含有該分離物的植入物在植入宿主時(shí)可具有骨誘導(dǎo)性能。因此，該分離物或含有該分離物的植入物可聚集具有修復(fù)骨組織潛能的宿主細(xì)胞。
富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物或含有該分離物的植入物可用于骨修復(fù)。例如，可將該分離物或含有該分離物的植入物施加于骨修復(fù)部位，例如損傷部位，手術(shù)、感染、惡化或進(jìn)行性畸形所造成的缺損部位。該分離物或含有該分離物的植入物可用于各種整形外科、牙周、神經(jīng)外科以及口腔和上頜面手術(shù)方法中，包括但不限于修復(fù)單純性和復(fù)合性骨折和骨不連接；外部和內(nèi)部固定；關(guān)節(jié)重建如關(guān)節(jié)固定術(shù)；普通關(guān)節(jié)成形術(shù)；髖關(guān)節(jié)凹關(guān)節(jié)成形術(shù)；股骨和肱骨頭置換；股骨頭表面置換和全關(guān)節(jié)置換；脊柱修復(fù)包括脊柱融合術(shù)和內(nèi)固定；腫瘤外科如缺陷填充；discectomy；椎板切除術(shù)；髓核腫瘤的切除；前頸椎和胸部手術(shù)；脊椎損傷的修復(fù)；脊柱側(cè)凸、脊柱前彎和脊柱后凸的治療；骨折的頜間固定；頦成形術(shù)；顳下頜關(guān)節(jié)置換；牙槽嵴增高和重建；鑲嵌骨植入物；放置和修正植入物；竇升高；化妝增效等?？捎迷摲蛛x物或含有該分離物的植入物修復(fù)或置換的具體骨包括但不限于篩骨；額骨；鼻骨；枕骨；頂骨；顳骨；下顎骨；上頜骨；顴骨；頸椎；胸椎；腰椎；骶骨；肋骨；胸骨；鎖骨；肩胛骨；肱骨；橈骨；尺骨；腕骨；掌骨；指趾骨；髂骨；坐骨；恥骨；股骨；脛骨；腓骨；膝蓋骨；跟骨；跗骨和跖骨。
富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物或含有該分離物的植入物也可用于軟骨修復(fù)。例如，可將該分離物或含有該分離物的植入物施加于軟骨缺損部位。例如，可將該分離物用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的部位。
富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物或含有該分離物的植入物也可用于軟組織修復(fù)。
骨髓可以是抽取的骨髓。骨髓可以是從待治療組織缺損的病人抽取的自體骨髓?？捎霉募夹g(shù)獲得骨髓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可用Jamshedi針(如從髂嵴中)抽取骨髓。
本文所述分離富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分所用方法有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，該方法不需要使用分離介質(zhì)，如密度梯度介質(zhì)，但是應(yīng)理解，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可包括使用這種分離介質(zhì)。因?yàn)椴荒軐⑦@些分離介質(zhì)引入人體中。因此，當(dāng)采用了不能引入病人中的分離介質(zhì)時(shí)，需要一系列洗滌步驟從分離的細(xì)胞群體中去除該分離介質(zhì)。可用本文所述的優(yōu)選方法分離所需細(xì)胞，無(wú)需使用這種分離介質(zhì)，因此不需要單獨(dú)的洗滌步驟。因此，可將本發(fā)明的待植入分離物裝在遞送裝置，如注射器、導(dǎo)管等中，而無(wú)需任何洗滌步驟。本文所述的優(yōu)選方法也可在手術(shù)中進(jìn)行分離和將分離物用于組織修復(fù)。而且，本文所述優(yōu)選方法所用的樣品量較少(例如60毫升或更少)。
為了促進(jìn)進(jìn)一步理解本發(fā)明，提供了以下實(shí)驗(yàn)。應(yīng)理解，這些實(shí)驗(yàn)是闡述性的，不限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)I以下非限制性實(shí)施例旨在說(shuō)明從含有全血和骨髓的生物樣品中制備富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物的方法。
用MagellanTMAPS系統(tǒng)加工含有20毫升抗凝骨髓和40毫升抗凝血液的混合物的生物樣品。然后分離各輪的富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。評(píng)價(jià)所得分離物的血小板產(chǎn)率(即分離物中的血小板濃度除以初始樣品中的血小板濃度)和血細(xì)胞比容。各輪分離物的體積約為6毫升，包括樣品的暗黃層組分和一部分相鄰的富含血小板的組分。
圖1-6中列出了各輪的測(cè)試結(jié)果，其中圖1顯示了編號(hào)30500供者的測(cè)試結(jié)果，圖2顯示了編號(hào)30501供者的測(cè)試結(jié)果，圖3顯示了編號(hào)30506供者的測(cè)試結(jié)果，圖4顯示了編號(hào)30526供者的測(cè)試結(jié)果，圖5顯示了編號(hào)30527供者的測(cè)試結(jié)果，圖6顯示了編號(hào)30561供者的測(cè)試結(jié)果。在圖1-6中，富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分稱(chēng)為“PRP”。生物樣品的其它組分中，血小板含量很少的血漿稱(chēng)為“PPP”(即密度最低的組分)，含有紅細(xì)胞的組分稱(chēng)為“PRBC”(即密度最高的組分)。從分析中排除被認(rèn)為是不可接受的輪次。將可接受的分離輪次定義為其中沒(méi)有遇到不利事件的輪次。這些不利事件包括但不限于由操作者失誤引起的失敗；未能以可靠方式進(jìn)行CBC計(jì)數(shù)，和；在靜脈穿刺或運(yùn)輸期間有過(guò)多血小板被激活，其表現(xiàn)為在分離過(guò)程期間或之后即刻有過(guò)多血小板凝集。
所用裝置/固定/計(jì)量MagellanTMAPS設(shè)備，s/n MAG1000185(裝有軟件v.2.3)Cell Dyn 1700細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Medtronic Equipment#133506。
所用材料/樣品MagellanTM一次性使用的試劑盒，無(wú)菌Poietics人骨髓-產(chǎn)品編號(hào)1M-125。批號(hào)030500、030501、030506、030526、030527、030561。Poietics Normal。
人外周血-產(chǎn)品編號(hào)1W-406。批號(hào)030500、030501、030506、030526、030527、03056。
結(jié)果和數(shù)據(jù)將各輪結(jié)果小結(jié)在下表中，該表顯示了從各樣品分離的富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物的血小板產(chǎn)率和以體積％表示的血細(xì)胞比容。血小板產(chǎn)率是分離物中的血小板濃度和初始樣品中的血小板濃度的比值。
結(jié)論從上述數(shù)據(jù)可以看出，用MagellanTMAPS系統(tǒng)進(jìn)行的所有(6)個(gè)分離輪次中，富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物(即PRP組分)中的血小板濃度均是初始樣品的4倍以上。此外，所有(6)個(gè)分離輪次中，也導(dǎo)致富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物(即PRP組分)的血細(xì)胞比容(HCT)均低于12.5％。
實(shí)驗(yàn)2分離含有血液和骨髓的樣品中富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分。然后用各種劑量的含hLMP-1的腺病毒載體(即AdVLMP)轉(zhuǎn)染分離物中包括間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞。然后采用無(wú)胸腺大鼠異位模型，將這些細(xì)胞植入大鼠中。
雖然上述說(shuō)明書(shū)介紹了本發(fā)明的原理，也提供了實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容，可進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的改變，而不背離本發(fā)明的真正范圍。
將上述說(shuō)明書(shū)中所引用的所有刊物以整體納入本文作為參考，如各自單獨(dú)納入作為參考并完整列明的那樣。
權(quán)利要求
1.一種獲得骨髓組分的方法，所述方法包括a)離心含有全血和骨髓的生物樣品以根據(jù)密度對(duì)該樣品的諸成分進(jìn)行分離，所述分離提供了密度降低順序的以下組分(i)富含血細(xì)胞的組分；(ii)暗黃層組分；(iii)富含血小板的組分；和(iv)血小板含量很少的組分；以及b)分離單獨(dú)的暗黃層組分或者與全部或部分富含血小板的組分混合的暗黃層組分以形成富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述全血和骨髓來(lái)自相同的哺乳動(dòng)物來(lái)源。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物來(lái)源是人。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括將所述富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物與運(yùn)載體組合。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物含有間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述全血是外周血。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在手術(shù)期間收獲病人的所述骨髓。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在所述手術(shù)期間進(jìn)行離心和分離。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣品基本上由骨髓和全血的抗凝混合物組成。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物質(zhì)時(shí)離心所述生物樣品。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述離心提供的血小板產(chǎn)率至少約為2。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物的血細(xì)胞比容低于50體積％。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的分離物的血小板濃度是所述生物樣品的4倍以上，血細(xì)胞比容低于約12.5體積％。
14.一種治療病人的方法，所述方法包括獲得包含骨髓組分的分離物，所述骨髓組分含有促進(jìn)結(jié)締組織形成的成分；和將所述分離物植入病人的組織缺損部位；其中，在所述植入手術(shù)中進(jìn)行所述獲得的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述骨髓組分是病人自體的。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述獲得的步驟包括離心含有骨髓的生物樣品。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述獲得的步驟包括收獲病人的骨髓，離心含有所述骨髓的生物樣品，和收集所述分離物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物樣品也包含全血。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述全血是病人的外周血。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述分離物的血小板濃度是所述生物樣品的約2倍以上。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述分離物的血細(xì)胞比容低于約12.5體積％。
22.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在骨缺損部位進(jìn)行所述植入。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，還包括在所述植入之前、期間或之后使所述分離物與成骨蛋白接觸。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述成骨蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2或BMP-7。
26.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在軟骨缺損部位進(jìn)行所述植入。
27.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物質(zhì)時(shí)離心所述生物樣品。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述生物樣品基本上由病人的骨髓和全血的抗凝混合物組成。
29.如權(quán)利要求14所述的方法，還包括在所述植入之前將所述分離物與運(yùn)載體混合。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體是可再吸收的。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體包括空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多孔性基質(zhì)材料。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述多孔性基質(zhì)材料包含天然或合成聚合物。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述多孔性基質(zhì)材料包含選自膠原、明膠、透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素和合成聚合物的一種物質(zhì)。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述多孔性基質(zhì)材料包含膠原。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體包括包裹在所述多孔性基質(zhì)材料中的顆粒礦物質(zhì)。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體是空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的運(yùn)載體。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體是糊或泥。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體包含選自膠原、明膠、透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、蛋白聚糖、糖胺聚糖和合成聚合物的有機(jī)材料。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體包括膠原或明膠。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述運(yùn)載體包含與所述有機(jī)材料混合的顆粒礦物質(zhì)。
41.一種植入組合物，所述組合物包含與生物相容性運(yùn)載體組合的含有包含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的未經(jīng)培養(yǎng)骨髓組分的分離物材料。
42.如權(quán)利要求41所述的植入組合物，其特征在于，所述運(yùn)載體為組織生長(zhǎng)提供了可再吸收性支架。
43.如權(quán)利要求41所述的植入組合物，其特征在于，通過(guò)離心含有骨髓的生物樣品并收集所述含有組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的骨髓組分而獲得所述分離物材料。
44.如權(quán)利要求41所述的植入組合物，其特征在于，所述分離物還包含外周血成分。
45.如權(quán)利要求43所述的植入組合物，其特征在于，所述生物樣品還包括外周血。
46.如權(quán)利要求42所述的植入組合物，其特征在于，所述運(yùn)載體包含膠原。
47.如權(quán)利要求45所述的植入組合物，其特征在于，所述分離物材料的血細(xì)胞比容低于約12.5體積％。
48.如權(quán)利要求41所述的植入組合物，其特征在于，所述組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分包含間充質(zhì)干細(xì)胞。
49.一種治療病人的方法，所述方法包括提供含有病人骨髓來(lái)源組織的生物樣品，所述樣品包括組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分；離心該生物樣品根據(jù)密度將樣品分成不同組分，所述組分包括富含所述組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分；分離得到所述富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分；將所述富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分植入病人；和其中，在所述植入手術(shù)中進(jìn)行所述離心和分離。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，相對(duì)于所述生物樣品，所述離心和分離能在所述組分中有效富集所述生長(zhǎng)促進(jìn)成分。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)促進(jìn)成分包含細(xì)胞，所述方法也包括遺傳修飾所述細(xì)胞。
52.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述生物樣品還包含全血。
53.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述全血是外周血。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述組織是從所述骨髓來(lái)源抽取獲得的。
55.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述組織是從病人的髂嵴抽取的。
56.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物質(zhì)時(shí)離心所述生物樣品。
57.一種獲得含有組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的分離物材料的方法，所述方法包括收獲哺乳動(dòng)物骨髓來(lái)源的組織，所述組織含有組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分；通過(guò)將所述組織與該哺乳動(dòng)物的全血混合形成混合物；離心含有所述混合物的生物樣品以根據(jù)密度將該生物樣品分離成各種組分，所述組分包括富含所述組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分；和分離富含所述組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的所述組分。
58.一種獲得富含結(jié)締組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的骨髓組分的方法，所述方法包括離心含有骨髓的生物樣品以根據(jù)密度將樣品諸成分分成不同組分，所述組分包括富含組織促進(jìn)成分的組分；和分離所述富含組織生長(zhǎng)促進(jìn)成分的組分。
59.一種制備供遞送的醫(yī)用植入材料的方法，所述方法包括(a)在有效分離含有能促進(jìn)組織生長(zhǎng)骨髓成分的組分條件下離心含有骨髓材料的生物樣品；和(b)不洗滌該組分而將所述組分裝入將該組分遞送給病人的裝置。
60.一種制備供遞送的醫(yī)用植入材料的方法，所述方法包括(a)在有效分離含有能促進(jìn)組織生長(zhǎng)骨髓成分的組分條件下離心含有骨髓材料的生物樣品；和(b)不培養(yǎng)該組分而將所述組分裝入將該組分遞送給病人的裝置。
61.一種醫(yī)用組合，所述組合包含富含促進(jìn)組織生長(zhǎng)成分的分離的未經(jīng)培養(yǎng)的骨髓組分以及與其組合的用于將該材料遞送給病人的裝置。
62.按照權(quán)利要求1-13和58-59中任一項(xiàng)所述方法制備的分離物材料在制造用于治療病人組織缺損的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本說(shuō)明書(shū)描述了一種富含一種或多種結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的骨髓分離物，制備該分離物的方法，和用該分離物促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)的方法。離心含有骨髓的生物樣品，將該樣品分成不同組分，包括富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分。然后從分離的樣品中分離得到富含結(jié)締組織生長(zhǎng)成分的組分。可以直接使用該分離物或與運(yùn)載體混合，將其植入病人的組織(如骨)缺損部位。該生物樣品可包含骨髓和全血。可修飾(例如通過(guò)用編碼操作性連接于一啟動(dòng)子的成骨誘導(dǎo)多肽的核酸轉(zhuǎn)染)該分離物，然后施加于組織缺損部位?？梢栽谝粋€(gè)步驟中(即手術(shù)中)制備該分離物并將其施加于組織缺損部位。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101072572SQ200480023194
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者W·F·麥克凱, J·C·馬克斯 申請(qǐng)人:華沙整形外科股份有限公司