專利名稱：一種通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，尤其是一種通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
臍血分離技術(shù)是建立臍血庫(kù)和進(jìn)行臍血移植研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接關(guān)系到臍血樣本凍存的終體積、造血干/祖細(xì)胞分離率、細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的干細(xì)胞回收率、細(xì)胞的有效活性維持以及下一步研究的成敗。臍血分離的目的主要是去除臍血中的紅細(xì)胞、血小板和部分血漿，收集富含臍血干/祖細(xì)胞的有核細(xì)胞(NC)，通過(guò)分離使臍血濃縮和純化，提高臍血干/祖細(xì)胞的濃度，以滿足研究和保存的需要。目前臍血分離技術(shù)包括羥乙基淀粉(HEQ沉淀法、Percoll溶液密度梯度離心法、 單克隆抗體加流式細(xì)胞儀分析法、免疫磁珠分選法或氯化銨溶解法等。Derming-Kendall 等對(duì)淋巴細(xì)胞液(Ficoll)分離、密度梯度離心分離、NH4C1溶解法、甲基纖維素法、明膠分離法、羥乙基淀粉(HEQ沉降法等不同臍血分離方法的分離效果進(jìn)行詳細(xì)的分析和比較后認(rèn)為，3%明膠沉降法的分離效果最好，其CD34+細(xì)胞的回收率和集落(CFU-C)回收率最高， 分別達(dá)到86%和92%。溶解法次之，但其終體積較大因而實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。Ficoll和 Percoll密度梯度離心法，雖然應(yīng)用較廣泛，但其對(duì)技術(shù)的要求較高而且費(fèi)用相對(duì)較貴。而且Ficoll法單次分離臍血量較小，在分離血量多的樣本時(shí)，使用的離心管數(shù)多，工作量大， 很容易造成污染，因此不適宜大批量臍血的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種一次離心且不需轉(zhuǎn)移的通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，所述離心采用一次離心，分兩步進(jìn)行，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、離心力25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為5_15°C，離心力 400-1000g，離心 10-20 分鐘。具體地，包括如下步驟(1)將采集袋中的臍帶血充分搖勻，消毒，按比例加入羥乙基淀粉(HEQ，將血袋放在微電腦采液控制器上，充分混勻；(2)用氣袋填充臍帶血袋周圍，使臍帶血袋處于垂直狀態(tài)，置于離心杯中配平、進(jìn)行梯度離心，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為 5-15°C，400-1000g，離心 10-20 分鐘；(3)離心完畢后，采集袋中的臍帶血分為三層，上層為血漿，中層為臍帶血造血干細(xì)胞，下層為紅細(xì)胞，分別將上層的血漿和下層的紅細(xì)胞放出，采集袋中即為富集的臍帶血造血干細(xì)胞。
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優(yōu)選，第一步離心條件設(shè)定為10°C、50g、離心7分鐘；第二步離心條件設(shè)定為 747g，10°C，離心 15 分鐘。本發(fā)明的有益效果是采用梯度離心法分離臍帶血造血干細(xì)胞，降低了干細(xì)胞在二次離心時(shí)需轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移袋中帶來(lái)的污染危險(xiǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，所述離心采用一次離心，分兩步進(jìn)行，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、離心力25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為5-15°C，離心力400-1000g，離心10-20分鐘。具體地，包括如下步驟(1)將采集袋中的臍帶血充分搖勻，消毒，按比例加入羥乙基淀粉(HEQ，將血袋放在微電腦采液控制器上，充分混勻；(2)用氣袋填充臍帶血袋周圍，使臍帶血袋處于垂直狀態(tài)，置于離心杯中配平、進(jìn)行梯度離心，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為 5-15°C，400-1000g，離心 10-20 分鐘；(3)離心完畢后，采集袋中的臍帶血分為三層，上層為血漿，中層為臍帶血造血干細(xì)胞，下層為紅細(xì)胞，分別將上層的血漿和下層的紅細(xì)胞放出，采集袋中即為富集的臍帶血造血干細(xì)胞。優(yōu)選，第一步離心條件設(shè)定為10°C、50g、離心7分鐘；第二步離心條件設(shè)定為 747g，10°C，離心 15 分鐘。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1.將采集袋中的臍帶血充分搖勻。用碘酒消毒采集袋取樣部位1次，75%酒精消毒2次。用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)消毒部位，抽取血樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和有核細(xì)胞活率檢測(cè)。2.按比例加入HES (羥乙基淀粉)。公式為HES體積/臍帶血重量(含抗凝劑) =1/5，即加入HES的數(shù)量=臍帶血重量(含抗凝劑)X 0.2 (ml)。3.將血袋放在微電腦采液控制器上，充分混勻10分鐘。4使用梯度離心法制備有核細(xì)胞4. 1用氣袋填充臍帶血袋周圍，使臍帶血袋處于垂直狀態(tài)，置于離心杯中。4. 2配平、進(jìn)行梯度離心。第一步離心條件設(shè)定為10°C、50g(g為離心力單位)、離心7分鐘；第二步離心條件設(shè)定為747g，10°C，離心15分鐘。5.離心完畢后，小心地將離心后的臍帶血袋垂直放在血漿分漿夾上，將血袋下端的管道穿過(guò)血液分漿夾底部的開(kāi)口。6.用止血鉗夾住采集袋下端管道。用碘酒消毒采集袋取樣部位一次，75%酒精消毒兩次。用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)消毒部位，連接轉(zhuǎn)移袋，松開(kāi)止血鉗放出紅細(xì)胞。待紅細(xì)胞界面據(jù)采集袋底部Icm時(shí)，夾住止血鉗。記錄放出紅細(xì)胞的重量。熱合管道。7.用止血鉗夾住采集袋頂端管道，用碘酒消毒采集袋取樣部位一次，75 %酒精消毒兩次。用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)消毒部位，連接轉(zhuǎn)移袋，松開(kāi)止血鉗放出血漿，當(dāng)采集袋中剩余血體積到33ml時(shí)，夾住止血鉗。
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8.松開(kāi)血漿夾，取下采集袋，使管道內(nèi)的血漿回流。采集袋中即為富集的臍帶血造血干細(xì)胞。9.充分混勻采集袋中的臍帶血，抽取樣品分做有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、苔盼藍(lán)拒染、⑶34+ 細(xì)胞檢測(cè)、干祖細(xì)胞培養(yǎng)等檢測(cè)。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述離心采用一次離心，分兩步進(jìn)行，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、離心力25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為5-15°C，離心力400-1000g，離心10-20分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，其特征在于， 包括如下步驟(1)將采集袋中的臍帶血充分搖勻，消毒，按比例加入羥乙基淀粉，將血袋放在微電腦采液控制器上，充分混勻；(2)用氣袋填充臍帶血袋周圍，使臍帶血袋處于垂直狀態(tài)，置于離心杯中配平、進(jìn)行梯度離心，第一步離心條件設(shè)定為5-15°C、25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為 5-15°C，400-1000g，離心 10-20 分鐘；(3)離心完畢后，采集袋中的臍帶血分為三層，上層為血漿，中層為臍帶血造血干細(xì)胞， 下層為紅細(xì)胞，分別將上層的血漿和下層的紅細(xì)胞放出，采集袋中即為富集的臍帶血造血干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，其特征在于， 第一步離心條件設(shè)定為10°C、50g、離心7分鐘；第二步離心條件設(shè)定為747g，10°C，離心15 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)階梯離心分離臍帶血造血干細(xì)胞的方法，所述離心采用一次離心，分兩步進(jìn)行，第一步離心條件設(shè)定為5-15℃、離心力25-80g、離心5-10分鐘；第二步離心條件設(shè)定為5-15℃，離心力400-1000g，離心10-20分鐘。本發(fā)明采用梯度離心法分離臍帶血造血干細(xì)胞，降低了干細(xì)胞在二次離心時(shí)需轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移袋中帶來(lái)的污染危險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102321583SQ20111030017
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者張昊, 曹禹, 楊俊曄, 林瑩, 武文杰, 王福喜, 賀雪萍, 韓俊領(lǐng), 魯瑞周 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司