專利名稱：平滑肌干細(xì)胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有特定的表面標(biāo)記物的來自平滑肌的組織干細(xì)胞、其新的分離方法 及培養(yǎng)方法以及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來逐漸明確存在于各種器官 組織內(nèi)的固有生物體(組織)干細(xì)胞負(fù)責(zé)各器 官·組織的維持和再生。迄今已報(bào)道了來自各種組織的干細(xì)胞，并且分離出了干細(xì)胞。作為截至目前被分離的干細(xì)胞，例如可以舉出骨骼肌干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、肝臟干 細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胰臟干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、脂肪組織干細(xì)胞等。作為其分離方法，多采用 邊緣群(side population, SP)法，本發(fā)明人以前使用SP法分離了人子宮的平滑肌干細(xì)胞 (參見專利文獻(xiàn)1)。再生醫(yī)療作為修復(fù)因疾患或外傷等損傷或喪失的人體細(xì)胞或組織、使其功能恢復(fù) 的醫(yī)療，目前受到極大的關(guān)注。認(rèn)為只要能夠分離鑒定上述組織干細(xì)胞，使其復(fù)制增殖，再 生醫(yī)療就是可能的。專利文獻(xiàn)1日本特開2007-202435號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供平滑肌干細(xì)胞、特別是子宮肌干細(xì)胞，進(jìn)而其目的在于提 供上述干細(xì)胞的應(yīng)用。平滑肌的1種即子宮肌能夠以年為單位發(fā)生妊娠導(dǎo)致的顯著的細(xì)胞尺寸增大 (hypertrophy)和細(xì)胞數(shù)增加(hyperplasia)，該劇烈變化可以在女性的一生中反復(fù)20次 以上。子宮肌是非常獨(dú)特的組織，已知其在妊娠 分娩時(shí)表現(xiàn)為顯著的增大和細(xì)胞數(shù)增加， 在產(chǎn)褥期急劇發(fā)生細(xì)胞凋亡。本發(fā)明人著眼于從妊娠到產(chǎn)褥期的細(xì)胞數(shù)增加及細(xì)胞凋亡的一系列事件，考慮在 作為子宮肌的主要構(gòu)成組織的子宮平滑肌中存在組織干細(xì)胞的可能性。本發(fā)明人以前發(fā)明 了采用SP法分離人子宮的平滑肌干細(xì)胞的方法(日本特開2007-20M35號(hào)公報(bào))。但是， 因?yàn)镾P法在與DNA色素的反應(yīng)后經(jīng)過照射UV激光進(jìn)行揀選的過程，所以也包括細(xì)胞的損 傷，無法確保分離的干細(xì)胞的安全性·無菌性。因此，本發(fā)明人作為細(xì)胞損傷少、且能夠確保分離細(xì)胞的安全性或無菌性的方法， 嘗試了使用表面標(biāo)記物的分離。即，采集正常子宮肌層，通過酶處理得到分散細(xì)胞，通過流 式細(xì)胞儀揀選Lin (⑶31，⑶45，血型糖蛋白A)陰性細(xì)胞后，區(qū)分為⑶34陽性/⑶49f陽性細(xì) 胞(雙陽性細(xì)胞；DP/Lin-)及其他細(xì)胞(nonDP)。最終通過FACS，作為子宮肌DP/Lin-(DP/ Lin-)而從該分散細(xì)胞中分離出特征在于⑶31、⑶45及血型糖蛋白A為陰性、⑶34及⑶49f 為陽性的雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-)。另一方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以僅⑶34及⑶49f的表達(dá)為指標(biāo)，可以將特征在于⑶34 及CD49f為陽性的雙陽性細(xì)胞(DP)作為子宮肌DP進(jìn)行分離。此時(shí)還發(fā)現(xiàn)可以事先選擇CD45為陰性的細(xì)胞、作為子宮肌DP從中分離特征在于CD34及CD49f為陽性的雙陽性細(xì)胞 (DP)。然后，解析DP/Lin-、DP及DP/Lin-以外的子宮肌細(xì)胞的表達(dá)基因，確認(rèn)了具有干 細(xì)胞的特征。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)DP/Lin-及DP在體外能夠分化誘導(dǎo)為骨 脂肪 軟骨細(xì)胞，將DP/ Lin-及DP移植給免疫缺陷小鼠時(shí)，能夠再構(gòu)筑子宮肌樣組織，確認(rèn)了分離的細(xì)胞為子宮平 滑肌干細(xì)胞。SP，本發(fā)明如下所述。[1]分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌干細(xì)胞的 方法，包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD31抗體、抗CD45抗體、抗血型 糖蛋白A抗體、抗CD34抗體及抗CD49f抗體接觸，分離不與抗CD31抗體、抗CD45抗體及抗 血型糖蛋白A抗體結(jié)合、而與抗CD34抗體及抗CD49f抗體結(jié)合的細(xì)胞。[2]分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌干細(xì)胞的 方法，包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD34抗體及抗CD49f抗體接觸， 分離與抗⑶；34抗體及抗⑶49f抗體結(jié)合的細(xì)胞。[3] [2]所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌 干細(xì)胞的方法，包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD45抗體、抗CD34抗 體及抗CD49f抗體接觸，分離不與抗CD45抗體結(jié)合、而與抗CD34抗體及抗CD49f抗體結(jié)合 的細(xì)胞。[4] [1] [3]中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，使用流式細(xì)胞儀 揀選細(xì)胞。[5] [1]所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，包括將哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞通過流式 細(xì)胞儀揀選為Lin(CD31，CD45，血型糖蛋白A)陽性細(xì)胞(Lin+)和Lin陰性細(xì)胞(Lin-)，采 集Lin陰性細(xì)胞，進(jìn)而采集⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。[6] [2]所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，包括從哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞中 通過流式細(xì)胞儀采集⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。[7] [3]所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，包括從哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞中 通過流式細(xì)胞儀采集⑶45陰性細(xì)胞，進(jìn)而采集⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。[8] [1] [7]中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，平滑肌為子宮肌。[9] [1] [8]中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，哺乳動(dòng)物為人。[10]平滑肌干細(xì)胞，通過[1] [9]中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶31、⑶45及血型 糖蛋白A為陰性，⑶；34及⑶49f為陽性。[11]平滑肌干細(xì)胞，通過[1] [9]中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶34及⑶49f為 陽性。[12]平滑肌干細(xì)胞，通過[1] [9]中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶45為陰性，⑶34 及⑶49f為陽性。[13] [10] [12]中任一項(xiàng)所述的平滑肌干細(xì)胞，其中，進(jìn)而ABCG2為陽性。[14] [10] [13]的平滑肌干細(xì)胞，具有通過移植到平滑肌中分化成平滑肌的能 力。[15]來自子宮肌的[14]的平滑肌干細(xì)胞，具有通過移植到子宮肌中分化成子宮肌的能力。[16]平滑肌組織再生用組合物，包含[10] [15]中任一項(xiàng)所述的平滑肌干細(xì)胞。本說明書包括作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2008-103867號(hào)的說明 書和/或附圖中記載的內(nèi)容。


圖1-1是表示用被熒光標(biāo)記的抗體實(shí)施了染色的子宮肌分散細(xì)胞的流式細(xì)胞儀 解析結(jié)果的圖。圖1-2是表示DP/Lin-、nonDP/Lin-及Lin+中的ABCG2的RT-PCR表達(dá)解析結(jié)果的 圖。圖中，組織是指通過機(jī)械·酶處理進(jìn)行分散時(shí)的子宮肌細(xì)胞(DP/Lin-、nonDP/Lin-及 Lin+)，NC表示以蒸餾水為模板的陰性對(duì)照。圖2是將細(xì)胞增殖活性表示為指標(biāo)的關(guān)于在正常氧濃度20%或低氧濃度2%下培 養(yǎng)的DP/Lin-及其他組分的增殖的圖。圖3是表示在骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)的DP/Lin-(圖3A)及nonDP/Lin-(圖3B) 的堿性磷酸酶染色顯微鏡像的照片。圖4是表示在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)的DP/Lin-(圖4A)及nonDP/Lin-(圖 4B)的油紅0染色顯微鏡像的照片。圖5是表示在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)的DP/Lin-的甲苯胺藍(lán)染色顯微鏡像的 照片。圖6是表示移植了 DP/Lin-的NOG妊娠小鼠子宮的熒光免疫染色像的照片。圖7是表示移植了 nonDP/Lin-的雌激素(E2)緩釋小粒移植NOG小鼠子宮的熒光 免疫染色像的照片。圖8是表現(xiàn)移植了 DP/Lin-、DP/Lin-及Lin+的NOG小鼠子宮因雌激素(E2)緩釋 小粒移植、妊娠而產(chǎn)生的人細(xì)胞的比例的圖。圖9是表示未進(jìn)行使用Lin標(biāo)記物的初揀選的子宮肌分散細(xì)胞的流式細(xì)胞儀解析 結(jié)果的圖，所述Lin標(biāo)記物實(shí)施了利用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體的染色。圖 10 是表示以 DP (Double positive ；CD49f (+) OKM (+))組分中的 CD31 的表達(dá)為 指標(biāo)的細(xì)胞亞組分的細(xì)胞分布的圖。圖11是表示DP組分、⑶49f (-)⑶34 (+)組分及⑶34 (-)組分中的分化標(biāo)記物基 因的表達(dá)解析結(jié)果的圖。圖12是表示DP組分的細(xì)胞群落形成狀態(tài)的照片。圖13是表示DP組分、CD49f (_)CD34(+)組分、CD34(_)組分、DP組分中的CD31⑴ 亞組分(DP 31+)及DP組分中的⑶31(-)亞組分(DP 31-)的群落形成能力的圖。圖14是表示將DP組分移植到重度免疫缺陷小鼠子宮內(nèi)的結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的干細(xì)胞是從平滑肌中分離的來自平滑肌組織的干細(xì)胞。作為本發(fā)明的 干細(xì)胞來源的平滑肌，可以舉出子宮平滑肌、內(nèi)臟平滑肌、血管平滑肌，優(yōu)選為子宮平滑肌。 可以采集它們的組織片，使細(xì)胞分散，從分散的細(xì)胞中分離干細(xì)胞，例如可以使用子宮肌瘤片。采集平滑肌的動(dòng)物種類沒有限定，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、 牛、馬、山羊、猴、人等哺乳動(dòng)物。本發(fā)明中，“干細(xì)胞”是指具有自身復(fù)制能力、具有多能性的細(xì)胞。干細(xì)胞通常可以 在組織受到傷害時(shí)將該組織再生。組織干細(xì)胞不同于胚性干細(xì)胞，是分化方向被限定的細(xì) 胞，存在于組織中的特定位置，具有未分化的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。因此，組織干細(xì)胞的多能性水平 低。組織干細(xì)胞的核/細(xì)胞質(zhì)比高，缺乏細(xì)胞內(nèi)小器官。一般而言，組織干細(xì)胞具有多分化 能力，細(xì)胞周期慢，在個(gè)體的一生以上維持增殖能力。本發(fā)明中，提到干細(xì)胞時(shí)是指包含至 少一定量干細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)，例如包含90%以上、優(yōu)選95%以上干細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)。本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞是Lin-，⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。Lin-細(xì)胞是指 分化抗原為陰性、不具有對(duì)應(yīng)于由干細(xì)胞向特定系統(tǒng)的細(xì)胞的分化而表達(dá)的表面抗原的細(xì) 胞，即在細(xì)胞表面沒有表達(dá)上述表面抗原的細(xì)胞。本發(fā)明中是指CD31、CD45及血型糖蛋 白A(GPA)為陰性的細(xì)胞。CD31是在幾乎全部單核細(xì)胞、血小板及粒細(xì)胞中表達(dá)的抗原， CD45是在包括末梢血的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的全部 白細(xì)胞中表達(dá)的抗原，GPA是與紅細(xì)胞有關(guān)聯(lián)的抗原。CD34是在未分化的干細(xì)胞中表達(dá)的 細(xì)胞，⑶49f是在血小板或巨核細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞。本發(fā)明中，將⑶34陽性且⑶49f陽性 的細(xì)胞稱為雙陽性(DP)細(xì)胞，將為Lin-、⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞稱為DP/Lin-細(xì) 胞。本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)作為干細(xì)胞標(biāo)記物的ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2, ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G2)。進(jìn)而，本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞是⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。該細(xì)胞中，⑶45、 CD31及血型糖蛋白A可以是陰性，也可以是陽性。本發(fā)明中將該細(xì)胞均稱為雙陽性(DP)細(xì) 胞。本發(fā)明的干細(xì)胞可以基于平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞表面的抗原特性進(jìn)行分離。S卩，只要 從平滑肌細(xì)胞中分離Lin-、⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞即可。另一方面，本發(fā)明的干細(xì)胞可以以僅⑶34及⑶49f的表達(dá)為指標(biāo)從平滑肌細(xì)胞中 分離⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。進(jìn)而，此時(shí)，可以預(yù)先選擇⑶45陰性細(xì)胞，從中分離 ⑶；34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。最初使細(xì)胞從平滑肌中分散。細(xì)胞分散可以通過將組織片進(jìn)行切片，用膠原酶等 酶處理來進(jìn)行。分散的細(xì)胞優(yōu)選分散至單一細(xì)胞的狀態(tài)，例如可以使其通過細(xì)胞過濾網(wǎng)等， 進(jìn)而使用Ficoll-Paque (注冊(cè)商標(biāo))等比重液進(jìn)行密度梯度離心分離，進(jìn)一步進(jìn)行胰島素 處理等，由此使其作為單一細(xì)胞分散。然后，可以使各自用不同的熒光色素標(biāo)記的針對(duì)⑶31、⑶45、血型糖蛋白A、⑶34 及CD49f或進(jìn)而ABCG2的抗體與分散的平滑肌細(xì)胞接觸，而將具有表面抗原的平滑肌細(xì)胞 染色，使用流式細(xì)胞儀或FACS揀選DP/Lin-細(xì)胞，由此分離本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞。此時(shí)， 可以用流式細(xì)胞儀直接從平滑肌細(xì)胞中分離，也可以在用流式細(xì)胞儀進(jìn)行揀選前使用結(jié)合 了針對(duì)包含CD31、CD45及血型糖蛋白A的分化抗原中的1種以上抗原的抗體的磁珠，除去 具有分化抗原的細(xì)胞，使用FACS從剩余的細(xì)胞中分離本發(fā)明的細(xì)胞。另外，可以使各自用不同的熒光色素標(biāo)記的針對(duì)⑶34及⑶49f、或⑶45、⑶34及 CD49f的抗體與分散的平滑肌細(xì)胞接觸以將具有表面抗原的平滑肌細(xì)胞染色，使用流式細(xì) 胞儀或FACS揀選DP細(xì)胞，由此分離本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞。此時(shí)，可以從平滑肌細(xì)胞中用流式細(xì)胞儀直接分離CD34及CD49f陽性細(xì)胞，也可以在用流式細(xì)胞儀揀選前使用結(jié)合了針 對(duì)CD45的抗體的磁珠除去具有CD45的細(xì)胞，從剩余的細(xì)胞中使用FACS分離本發(fā)明的細(xì) 胞。作為用于標(biāo)記的熒光色素，可以舉出Cy (商標(biāo))3、Cy5、TexasRed (注冊(cè)商 標(biāo))、APC (allophycocyanin,別藻藍(lán)蛋白)、PE (phycoerythrin,藻紅蛋白)、PE_Cy5、 FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)、PerCP等。作為流式細(xì)胞儀、FACS， 例如可以使用 FACS vantage (Becton .Dickinson 社制)、FACS Calibur (Becton .Dickinson 社制)等。分離的本發(fā)明的干細(xì)胞可以通過培養(yǎng)使其增殖。此時(shí)，使用的培養(yǎng)基沒有限定， 可以使用公知的培養(yǎng)基(例如DMEM(Dulbecco' smodified Eagle' s medium)培養(yǎng)基)。 特別優(yōu)選使用公知的干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。例如可以使用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基間充 質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSCBM)) (Cambrex Bio Science社、現(xiàn)Poietics社)、間充質(zhì)干細(xì)胞 生長培養(yǎng)基(MSCGM) (Cambrex Bio Science社、現(xiàn)Poietics社)等。可以在培養(yǎng)基中適當(dāng) 添加胎牛血清等血清或青霉素、鏈霉素等抗生素及各種生理活性物質(zhì)。另外，培養(yǎng)本發(fā)明的 干細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)氧濃度低于通常培養(yǎng)時(shí)的20%的條件下進(jìn)行。優(yōu)選在5%以下、更優(yōu)選在 2. 5%以下、特別優(yōu)選在2%的條件下進(jìn)行?？梢酝ㄟ^用該方法進(jìn)行培養(yǎng)，使干細(xì)胞增殖。只 要在組織培養(yǎng)用培養(yǎng)皿中播種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)即可。進(jìn)而，可以將分離的本發(fā)明的干細(xì)胞在體外分化誘導(dǎo)成特定的組織細(xì)胞。因?yàn)?本發(fā)明的干細(xì)胞具有多能性，所以基本上可以分化誘導(dǎo)成任意的組織細(xì)胞。用于各種組 織的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基在市場上銷售，可以使用上述市售培養(yǎng)基進(jìn)行分化誘導(dǎo)。例如分化 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞時(shí)，只要使用BulletKit成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science社、 現(xiàn)Poietics社)即可，分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞時(shí)，只要使用BulletKit脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng) 基(Cambrex Bio Science社、現(xiàn)Poietics社)即可，分化誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞時(shí)，只要使用 BulletKit軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science社)進(jìn)行培養(yǎng)即可。另外，也可以 將本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成子宮肌組織細(xì)胞等平滑肌組織細(xì)胞。此時(shí)，在氧濃度 為通常的細(xì)胞培養(yǎng)條件、即在約20%的條件下進(jìn)行?？梢詫⒎只癁樯鲜鼋M織細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn) 一步培養(yǎng)，構(gòu)筑組織。干細(xì)胞是否分化誘導(dǎo)為組織細(xì)胞可以通過調(diào)查各組織細(xì)胞中特有的標(biāo)記物的表 達(dá)來決定。例如分化為骨細(xì)胞可以根據(jù)是否有堿性磷酸酯酶染色陽性細(xì)胞來調(diào)查，分化為 脂肪細(xì)胞可以根據(jù)是否有油紅O染色陽性細(xì)胞來調(diào)查。進(jìn)而，分化為軟骨細(xì)胞可以根據(jù)是 否有甲苯胺藍(lán)染色陽性軟骨小粒來調(diào)查。進(jìn)而，本發(fā)明包含使本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞永生化的細(xì)胞系。該細(xì)胞系兼具增殖 能力及多能性，可以使其僅增殖需要數(shù)量進(jìn)行利用。建立的細(xì)胞系可用作平滑肌的分化、發(fā) 生等研究用工具。人的細(xì)胞因放射線或突變誘發(fā)物質(zhì)或病毒而變成永生化細(xì)胞(有時(shí)為癌 細(xì)胞)，特別是最近，作為不引發(fā)腫瘤化或染色體異常、比較保持原始的細(xì)胞特性地使其永 生化的方法，進(jìn)行的是將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)或SV40T基因等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞可用于再生醫(yī)療等。例如可以將本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞用 注射器通過注射移植給予到損傷的平滑肌部位，使得干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞，將損傷的 平滑肌再生。另外，也可以如上所述將本發(fā)明的干細(xì)胞在體外進(jìn)行分化誘導(dǎo)，構(gòu)筑組織，將該組織移植。在上述再生醫(yī)療中，為了避免移植的細(xì)胞或組織被受體排斥，優(yōu)選從要進(jìn)行再 生醫(yī)療的患者中采集組織片，從該組織片中分離本發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞，進(jìn)行利用。例如可 以從因子宮肉瘤等疾患而切除了一部分子宮的患者的殘留部分的子宮肌中采集組織片，從 該組織片中分離子宮肌干細(xì)胞，用于上述患者的子宮再生。另外，如上所述，本發(fā)明的平滑 肌干細(xì)胞也可以分化成其他組織。例如可以從平滑肌以外的特定組織被損傷的患者中，由 子宮肌等平滑肌取出組織片，分離平滑肌干細(xì)胞，將該平滑肌干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成被損傷的 組織，由此可以用于平滑肌以外的組織的再生醫(yī)療。本發(fā)明也包括含本發(fā)明的干細(xì)胞的再 生醫(yī)療用組合物、即再生醫(yī)療用制劑。進(jìn)而，可以通過將來自人的本發(fā)明的干細(xì)胞移植給作為人以外的動(dòng)物的免疫缺 陷動(dòng)物，得到部分地具有人的平滑肌組織的模型動(dòng)物。例如通過將本發(fā)明的平滑肌干細(xì) 胞移植到免疫缺陷動(dòng)物的平滑肌中，本發(fā)明的干細(xì)胞分化成平滑肌，而在動(dòng)物體內(nèi)部分地 構(gòu)筑人平滑肌組織。在動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)筑人平滑肌組織只要測定細(xì)胞表達(dá)的人平滑肌特有的 蛋白質(zhì)，確認(rèn)形態(tài)上具有平滑肌的特征即可。例如平滑肌為子宮肌時(shí)，只要確認(rèn)波形蛋白 (vimentin)陽性即來自人(紅色)、并且α SMA陽性細(xì)胞(綠色)、形態(tài)上為子宮平滑肌即 可。由此得到的部分地具有人平滑肌組織的動(dòng)物可以作為具有人平滑肌組織的模型動(dòng)物利 用。例如平滑肌為子宮肌時(shí)，可以用于使子宮收縮或使子宮舒緩的藥劑的篩選。另外，使本 發(fā)明的平滑肌干細(xì)胞癌化進(jìn)行移植時(shí)，可以制作具有人子宮癌等的模型動(dòng)物，可以用于治 療劑的篩選。作為免疫缺陷動(dòng)物，可以舉出scid小鼠、NOG小鼠等免疫缺陷小鼠。通過以下的實(shí)施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。實(shí)施例1子宮肌雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-細(xì)胞)的制備(1)單一分散子宮肌細(xì)胞的制備將從人子宮分離的子宮肌瘤片用剪刀剪成約2mm3的小片，將其以相對(duì)于Ig組 織片為IOml的比例移植到含有0.2% (w/v)的膠原酶(和光純藥、大阪)、0.05% (w/v) 的DNaseI (GIBC0、美國加利福尼亞州)的DMEM培養(yǎng)基(含有1 %的抗生素-抗真菌劑 [GIBC0]、10%的胎牛血清[BioWest、美國福羅里達(dá)州]的 Dulbecco，s modified Eagle，s 培養(yǎng)基[DMEM、Sigma-Aldrich、美國密蘇里州])中，在37°C下振蕩16小時(shí)，進(jìn)行酶促細(xì)胞 分散處理。接下來，用400 μ m孔徑的聚乙烯網(wǎng)進(jìn)行過濾后，進(jìn)而使細(xì)胞通過40 μ m孔徑細(xì)胞 過濾網(wǎng)(BD Biosciences、美國馬薩諸塞州)，分散至單一細(xì)胞的狀態(tài)。接下來，將上述分散 的細(xì)胞重疊在 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、美國新澤西州)上，以 780Xg 實(shí)施15分鐘的密度梯度離心，從表面層回收單一細(xì)胞的分散液。將其用0.05% (w/v)胰島 素-EDTA(Sigma-Aldrich) · 0. 05% (w/v)DNaseI溶液進(jìn)行酶處理，通過吹打制成完全分散 的細(xì)胞集團(tuán)。(2)用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞染色使上述分散的單一子宮肌細(xì)胞集團(tuán)以2X IO6的濃度浮游在含2%胎牛血清、IOmM HEPES及1 %青霉素及鏈霉素的Hank，s平衡化緩沖液(不含鈣及鎂、HBSS+)，加入熒光標(biāo)記 抗體，在4°C下使其反應(yīng)30分鐘。接下來于4°C進(jìn)行離心后，使其浮游在2ml的上述Hank's 液中，為了揀選死細(xì)胞用碘化丙啶(PI)進(jìn)行染色。使用的熒光標(biāo)記抗體是PE結(jié)合抗CD31抗體(IgGl、BDBiosciences)、PE結(jié) 合抗 CD45 抗體(IgGl、BD Biosciences)、PE 結(jié)合抗 Glycohporin A 抗體(IgG2b、BDBiosciences)、APC 結(jié)合抗 CD34 抗體(IgGl、BD Biosciences)及 FITC 結(jié)合抗 CD49f 抗體 (IgG2a、BD Biosciences)。(3)子宮肌雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-)的分離基于熒光強(qiáng)度通過流式細(xì)胞儀將細(xì)胞集團(tuán)二維展開。將上述進(jìn)行了染色的分散細(xì) 胞使用流式細(xì)胞儀(FACS Vantage SE, Becton Dickinson 社)及解析軟件(Cell-Quest, Becton Dickinson社)進(jìn)行角軍析。圖1表示該細(xì)胞分布圖。由此邊進(jìn)行二維展開邊收集IXlO5的細(xì)胞，揀選 Lin(CD31，CD45，Glycophorin Α)陽性細(xì)胞(Lin+)和陰性細(xì)胞(Lin-)后(圖 1-1A 及 B)， 區(qū)分成CD34陽性/CD49f陽性細(xì)胞(雙陽性細(xì)胞；DP/Lin_)及其他細(xì)胞(nonDP/Lin-)(圖 1-1C)。最終分取雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-)組分，作為子宮肌DP/Lin-細(xì)胞。(4)分化標(biāo)記物基因的表達(dá)解析使用Trizol (Invitrogen，加利福尼亞州)從上述分離的DP/Lin-、nonDP/Lin_及 Lin+中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)解析ABCG2的信使RNA的表達(dá)。圖 1-2是其結(jié)果。需要說明的是，作為內(nèi)標(biāo)的GAPDH的表達(dá)水平在兩者間沒有差別。這表示 DP/Lin-與其他組分相比將作為干細(xì)胞標(biāo)記物的ABCG2高表達(dá)、處于分化度比較低的未成 熟階段，DP/Lin-具有與組織干細(xì)胞的特性一致的性質(zhì)。實(shí)施例2子宮肌雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-細(xì)胞)的培養(yǎng)不是在通常的培養(yǎng)氧濃度即20 %的條件下，而是在2 %的低氧濃度下，在 Multi-Gas Incubator (Astec 社、福岡)中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果，在20%氧濃度下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，即使經(jīng)過3周，細(xì)胞與其他組分相比也沒有增 殖，而在2%的低氧濃度下培養(yǎng)1周時(shí)，形成細(xì)胞群落，在2周時(shí)，細(xì)胞增殖至幾乎鋪滿(圖 2)。實(shí)施例3子宮肌雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-細(xì)胞)的分化誘導(dǎo)分析為了研究上述培養(yǎng)DP/Lin-是否具有作為干細(xì)胞特性之一的多分化能力，將DP/ Lin-分別在可分化誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，研究是否能 夠分化成不同的細(xì)胞系譜。作為用于骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使用ft~ekit成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science社制、三光純藥銷售、制品編號(hào)PT-3002)，作為用于脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培 養(yǎng)基，使用I^reKit脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science社制、三光純藥銷售、制 品編號(hào)PT-3004)。作為用于軟骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使用I^reKit軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng) 基(Cambrex Bio Science社制、三光純藥銷售、制品編號(hào)PT-4121)。將上述培養(yǎng)后的DP/ Lin-和DP/Lin nonDP/Lin-以約5 X IO3/孔的濃度播種到96孔平板上，在MSCGM培養(yǎng)基下 以2% (低氧濃度)的氧濃度培養(yǎng)約2 3周直至鋪滿。在用于以下的分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)開 始時(shí)，將氧濃度恢復(fù)至通常水平即20%，進(jìn)行分化誘導(dǎo)。向骨分化上述培養(yǎng)DP/Lin-被分化誘導(dǎo)為骨細(xì)胞。每3 4日更換上述骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 培養(yǎng)2 3周。向骨細(xì)胞的分化以堿性磷酸酯酶染色陽性細(xì)胞的出現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果，DP/ Lin-時(shí)大量出現(xiàn)堿性磷酸酯酶染色陽性細(xì)胞(紫色)(圖3A)，而non DP/Lin-時(shí)幾乎沒有 確認(rèn)出現(xiàn)堿性磷酸酯酶染色陽性細(xì)胞(圖3B)。
向脂肪分化上述培養(yǎng)DP/Lin-被分化誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞。首先，在用上述脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 培養(yǎng)3日后，用脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)1 3日。以此為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，最 后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)最多1周后，進(jìn)行清洗·固定，為了將脂肪滴染色而進(jìn)行油紅0染色。 結(jié)果，DP/Lin-時(shí)出現(xiàn)油紅0染色陽性細(xì)胞(紅色)(圖4A)，而nonDP/Lin-時(shí)幾乎完全沒 有確認(rèn)有油紅0染色陽性細(xì)胞(圖4B)。向軟骨分化上述培養(yǎng)DP/Lin-被分化誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞。每3 4日更換上述軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培 養(yǎng)基，用2 3周在15ml離心管內(nèi)進(jìn)行三維培養(yǎng)。向軟骨細(xì)胞的分化用甲苯胺藍(lán)染色陽性 軟骨小粒的出現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果，DP/Lin-時(shí)出現(xiàn)甲苯胺藍(lán)染色陽性軟骨小粒(紫色)(圖 5)，而nonDP/Lin-時(shí)沒有確認(rèn)有軟骨小粒。實(shí)施例4向重度免疫缺陷小鼠移植子宮肌雙陽性細(xì)胞(DP/Lin-細(xì)胞)的實(shí)驗(yàn)將含有10%戊巴比妥(大日本藥品制)的磷酸緩沖液(Sigma)以350 μ 1對(duì) N0G(N0D/SCID/ycnul1)小鼠(財(cái)團(tuán)法人實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所、川崎市)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射， 將其麻醉。將上述分離得到的約5 X IO4個(gè)DP/Lin-及DP/Lin-使用29G的注射針注入NOG 小鼠的各子宮角，然后飼養(yǎng)約4 5周。進(jìn)行上述移植4 5周后，將移植后NOG小鼠分成 3組，進(jìn)行干細(xì)胞在生物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)解析。首先，為了使第1組為高雌激素環(huán)境，皮下移植2 片雌激素(E2)緩釋小粒(Innovative Research of America、美國福羅里達(dá)州)。然后，第 2組什么都不做。最后，使第3組與雄小鼠交配，在妊娠第18. 5日供解析。熒光組織染色摘除子宮，包埋在Tissue-iTek OCT compound(Sakura Finetech、美國加利福尼亞 州)中進(jìn)行凍結(jié)，使用低溫恒溫器(Leica Microsystems、德國· Wetzler市)以6μπι厚 度進(jìn)行連續(xù)切片。對(duì)于得到的凍結(jié)切片，用4%甲醛在室溫下固定20分鐘后，用磷酸緩沖 液進(jìn)行清洗。用含有0.2% Triton X_100的磷酸緩沖液進(jìn)行10分鐘細(xì)胞膜滲透處理后， 在10%牛血清白蛋白溶液中浸漬30分鐘以施行封閉處理。接下來，將進(jìn)行了上述處理的 切片與針對(duì)子宮平滑肌標(biāo)記物即α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a SMA)的抗體(clone 1A4，200倍 稀釋、DAKOCytomatio、丹麥)在4°C下反應(yīng)一整夜后，使用Alexa Fluor 488(綠色熒光 用)標(biāo)記二次抗體(Molecular Probes、美國俄勒岡州)(稀釋1000倍，37°C，1小時(shí))以 檢測一次抗體。接下來，使其與被紅色用熒光色素Cy3 (Sigma-Aldrich)直接標(biāo)記的、僅對(duì) 人的細(xì)胞反應(yīng)的波形蛋白抗體(clone V9)反應(yīng)，進(jìn)行熒光二重染色。進(jìn)而，切片用核染色 劑T0T0-3 (Molecular Probes)進(jìn)行對(duì)比染色。將各染色后的切片用TCS SP2共焦顯微鏡 (Leica Microsystems)進(jìn)行顯微鏡檢查。結(jié)果，如圖6所示，在移植了 DP/Lin-的子宮中出現(xiàn)波形蛋白陽性即來自人(紅 色)、并且為α SMA陽性細(xì)胞(綠色)、在形態(tài)上也為子宮平滑肌的組織(黃色)。另一方 面，移植了 nonDP/Lin-及Lin+的子宮沒有確認(rèn)到上述DP/Lin-中觀察到的來自人的組織， 如圖7所示，存在來自人的細(xì)胞(紅色)，但它們分布在小鼠平滑肌組織(綠色)的間隙內(nèi)。另外，可知DP/Lin-的增殖被雌激素片或妊娠刺激，來自人的細(xì)胞的比例定量增 加(圖8)。這表示DP/Lin-具有構(gòu)筑子宮平滑肌的能力，而nonDP/Lin-及Lin+不具有該能力，DP/Lin-特異性地具有子宮肌的組織干細(xì)胞特性。另外，判明DP/Lin-的增殖被雌激素 (E2)緩釋小粒或妊娠刺激。實(shí)施例5制備子宮?、?4陽性/⑶49f陽性細(xì)胞(沒有用Lin標(biāo)記物進(jìn)行初揀選 的情況)進(jìn)一步，以200細(xì)胞/cm2的低細(xì)胞密度在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)分離后的各種細(xì)胞組分， 解析群落形成能力。解析時(shí)，可以用29G針擦過培養(yǎng)皿以把握一個(gè)個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的舉動(dòng)。(1)單一分散子宮肌細(xì)胞的制備將從人子宮中分離的子宮肌瘤片用剪刀切成約2mm3的小片，以相對(duì)于Ig組織 片為IOml的比例移植到含有0.2% (w/v)的膠原酶(和光純藥、大阪)、0.05% (w/v) 的DNaseI (GIBC0、美國加利福尼亞州)的DMEM培養(yǎng)基(含有1 %的抗生素-抗真菌劑 [GIBC0]、10%的胎牛血清[BioWest、美國福羅里達(dá)州]的 Dulbecco，s modified Eagle，s 培養(yǎng)基[DMEM、Sigma-Aldrich、美國密蘇里州])中，在37°C下振蕩16小時(shí)，進(jìn)行酶促細(xì)胞 分散處理。接下來，用400 μ m孔徑的聚乙烯網(wǎng)進(jìn)行過濾后，進(jìn)一步使細(xì)胞通過40 μ m孔徑細(xì) 胞過濾網(wǎng)(BD Biosciences、美國馬薩諸塞州)，由此分散成單一細(xì)胞的狀態(tài)。接下來，將上 述分散后的細(xì)胞重疊在Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、美國新澤西州)上，以 780Xg進(jìn)行15分鐘的密度梯度離心，從表面層中回收單一細(xì)胞的分散液。將其用0. 05% (w/v)胰島素-EDTA(Sigma-Aldrich) ‘ 0. 05% (w/v)DNaseI溶液進(jìn)行酶處理，并通過吹打 形成完全分散的細(xì)胞集團(tuán)。(2)用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞染色使上述分散后的單一子宮肌細(xì)胞集團(tuán)以2X106的濃度浮游在含有2%胎牛血清、 IOmM HEPES及青霉素及鏈霉素的Hank's平衡化緩沖液(不含有鈣及鎂、HBSS+)中，加 入熒光標(biāo)記抗體，使其在4°C下反應(yīng)30分鐘。接下來在4°C下進(jìn)行離心后，使其浮游在2ml 的上述Hank’ s液中，為了揀選死細(xì)胞，用碘化丙啶(PI)進(jìn)行染色。熒光標(biāo)記抗體使用實(shí)施 例1中使用的抗體。(3)子宮?、?4陽性/⑶49f陽性細(xì)胞的分離對(duì)于PI㈠(活細(xì)胞)、⑶45陰性及FSC (i^rward scatter (前方散射光)；表示細(xì) 胞的大小)150 500的細(xì)胞，基于熒光強(qiáng)度，通過流式細(xì)胞儀將細(xì)胞集團(tuán)二維展開。使用 流式細(xì)胞儀(FACS Vantage SE, Becton Dickinson 社)及解析軟件(Cell-Quest, Becton Dickinson社)解析上述進(jìn)行了染色的分散細(xì)胞。分級(jí)的細(xì)胞的分化標(biāo)記物基因的表達(dá)解 析用與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行。進(jìn)而，用與實(shí)施例2相同的方法研究群落形成能力。進(jìn) 而，用與實(shí)施例4同樣的方法移植到重度免疫缺陷小鼠中。圖9表示細(xì)胞分布。圖9A表示細(xì)胞集團(tuán)整體的細(xì)胞分布，圖9B、C及D分別表示 DP (Double positive ；CD49f (+) CD34(+))組分、CD49f (-) CD34 (+)組分及 CD!M(-)組分的 各組分的細(xì)胞分布。橫軸表示CD49f的強(qiáng)度，縱軸表示CD34的強(qiáng)度。PI (-)的活細(xì)胞中的 DP (Double positive)組分為 9. 8%, 49f (-) 34 (+)組分為 13. 7%, 34(-)組分為 43. 8%。從 中分取 DP (CD49f (+) CD34 (+))組分。圖10表示以DP組分中的⑶31的表達(dá)為指標(biāo)的細(xì)胞亞組分的細(xì)胞分布。如圖所 示，DP組分根據(jù)⑶31是否表達(dá)進(jìn)一步分為2個(gè)亞組(DP 31+及DP 31-) 0圖10A表示細(xì)胞 集團(tuán)整體的細(xì)胞分布，圖10B表示DP組分的細(xì)胞分布。圖10C表示DP組分的⑶31的表達(dá)譜，圖IOD表示⑶31 (+)組分的細(xì)胞分布，圖IOE表示⑶31 (-)組分的細(xì)胞分布。在單一子 宮肌細(xì)胞集團(tuán)的PI (_)的細(xì)胞中存在3. 6%⑶31陽性細(xì)胞，存在3. 7%⑶31陰性細(xì)胞。圖11表示DP組分、CD49f (_)CD34(+)組分及CD34(_)組分中的分化標(biāo)記物基因 的表達(dá)解析結(jié)果。如圖11所示，DP組分與其他組分相比，ERa、ERi3及平滑肌分化標(biāo)記物 的表達(dá)水平低。另一方面，ABCG2強(qiáng)表達(dá)。圖12表示DP組分的細(xì)胞的第1日(A)、第7日⑶、第14日(C)及第21日⑶的 群落形成狀態(tài)。圖12E及F表示增殖中的群落的狀態(tài)。另外，圖13表示DP組分、CD49f(_) CD34 (+)組分、CD34(_)組分、DP組分中的CD31 (+)亞組分(DP 31+)及DP組分中的CD31 (-) 亞組分(DP 31-)的群落形成能力。如圖所示，DP組分與其他組分(⑶49f(_)⑶34(+)組分、 ⑶34(-)組分)相比群落形成能力高。另外，在DP組分中的⑶31(+)亞組分和CD31(_)亞 組分之間沒有確認(rèn)到群落形成能力存在差別。圖14表示將DP組分移植到重度免疫缺陷小鼠子宮內(nèi)的結(jié)果。如圖所示，移植了 DP組分的子宮出現(xiàn)波形蛋白陽性即來自人(紅色)、并且為ciSMA陽性細(xì)胞(綠色)、形態(tài) 上也為子宮平滑肌的組織(黃色)。這表示DP組分的細(xì)胞具有構(gòu)筑子宮肌樣組織的能力。由此可知，不用譜系(lineage)標(biāo)記物進(jìn)行揀選、以⑶34及⑶49f的表達(dá)為指標(biāo) 即可分離子宮平滑肌干細(xì)胞。產(chǎn)業(yè)上的可利用性如實(shí)施例所示，本發(fā)明的特征在于⑶31、⑶45及血型糖蛋白A為陰性、⑶34及 ⑶49f為陽性的DP/Lin-及特征在于⑶45為陰性、⑶34及⑶49f為陽性的DP具有1)未分 化狀態(tài)、2)多分化能力、3)自身組織構(gòu)筑能力這樣的組織干細(xì)胞特性，所以DP/Lin-及DP 是子宮肌的組織干細(xì)胞，根據(jù)本方法在世界上首次成功分離子宮肌的組織干細(xì)胞。分離的 DP/Lin-及DP在進(jìn)行子宮肌的發(fā)生機(jī)制、負(fù)責(zé)妊娠·分娩中的子宮肌的增殖·退縮·功能 表達(dá)的細(xì)胞機(jī)制、進(jìn)而子宮肌瘤等來自子宮肌的疾患的病因解析或針對(duì)于此的藥劑開發(fā)方 面，成為有用的生物資源。另外，也期待DP/Lin-細(xì)胞及DP細(xì)胞作為其他臟器治療中的細(xì) 胞材料進(jìn)行臨床應(yīng)用。本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請(qǐng)直接作為參考引入本說明書中。
權(quán)利要求
1.分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌干細(xì)胞的方法， 包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD31抗體、抗CD45抗體、抗血型糖蛋 白A抗體、抗⑶34抗體及抗⑶49f抗體接觸，分離不與抗⑶31抗體、抗⑶45抗體及抗血型 糖蛋白A抗體結(jié)合、而與抗CD34抗體及抗CD49f抗體結(jié)合的細(xì)胞。
2.分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌干細(xì)胞的方法， 包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD34抗體及抗CD49f抗體接觸，分離 與抗⑶34抗體及抗⑶49f抗體結(jié)合的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平 滑肌干細(xì)胞的方法，其中，包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD45抗體、 抗⑶34抗體及抗⑶49f抗體接觸，分離不與抗⑶45抗體結(jié)合、而與抗⑶34抗體及抗⑶49f 抗體結(jié)合的細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，使用流式細(xì)胞儀 揀選細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，包括通過流式細(xì)胞儀將哺乳 動(dòng)物平滑肌細(xì)胞揀選為Lin(CD31，CD45，血型糖蛋白A)陽性細(xì)胞(Lin+)和Lin陰性細(xì)胞 (Lin-)，采集Lin陰性細(xì)胞，進(jìn)而采集CD34陽性且CD49f陽性的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求2所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，通過流式細(xì)胞儀從哺乳動(dòng)物 平滑肌細(xì)胞中采集⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求3所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，包括通過流式細(xì)胞儀從哺乳 動(dòng)物平滑肌細(xì)胞中采集⑶45陰性細(xì)胞，進(jìn)而采集⑶34陽性且⑶49f陽性的細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，平滑肌為子宮肌。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的分離平滑肌干細(xì)胞的方法，其中，哺乳動(dòng)物為人。
10.平滑肌干細(xì)胞，通過權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶31、⑶45及血型 糖蛋白A為陰性，⑶34及⑶49f為陽性。
11.平滑肌干細(xì)胞，通過權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶34及⑶49f為陽性。
12.平滑肌干細(xì)胞，通過權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法分離，⑶45為陰性，⑶34 及⑶49f為陽性。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的平滑肌干細(xì)胞，其中，進(jìn)而ABCG2為陽性。
14.如權(quán)利要求10 13中任一項(xiàng)所述的平滑肌干細(xì)胞，具有通過移植到平滑肌中而分 化成平滑肌的能力。
15.來自子宮肌的權(quán)利要求14所述的平滑肌干細(xì)胞，具有通過移植到子宮肌中而分化 成子宮肌的能力。
16.平滑肌組織再生用組合物，包含權(quán)利要求10 15中任一項(xiàng)所述的平滑肌干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明是分離平滑肌干細(xì)胞的方法，是分離來自哺乳動(dòng)物平滑肌的平滑肌干細(xì)胞的方法，包括使哺乳動(dòng)物平滑肌細(xì)胞與用熒光色素標(biāo)記的抗CD45抗體、抗CD34抗體及抗CD49f抗體接觸，分離不與抗CD45抗體結(jié)合、而與抗CD34抗體及抗CD49f抗體結(jié)合的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102057037SQ20098012191
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者丸山哲夫, 小野政德 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾