專利名稱：選擇方法ii的制作方法
選擇方法11本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法。更具體地說，該方法涉及用轉(zhuǎn)化 盒CTransformation Cassette)轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述轉(zhuǎn)化盒靶向植物質(zhì)體并且包含選 擇基因，例如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)，以及轉(zhuǎn)基因。在選擇轉(zhuǎn)化質(zhì)體以后，在植物細胞中誘導(dǎo) 重組酶的表達，其導(dǎo)致從質(zhì)體切除選擇基因以及在質(zhì)體中表達轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供了包 括轉(zhuǎn)化盒的細胞和植物。在農(nóng)業(yè)中基因修飾(GM)糧食作物的使用正快速增長，在2005年世界市場大約為 ￡140億。然而，在科學(xué)家、政治家、監(jiān)管機構(gòu)以及大眾中，日益關(guān)注有關(guān)通過花粉轉(zhuǎn)基因從 GM作物擴散到其它植物物種從而產(chǎn)生所謂的“超雜草”的風(fēng)險。在現(xiàn)在農(nóng)業(yè)中所使用的所有商業(yè)GM作物具有包含轉(zhuǎn)基因的工程核基因組，其中 所述轉(zhuǎn)基因賦予所期望的性狀如對疾病、昆蟲、惡劣的環(huán)境條件的抗性，以及增加的維生素 含量、香味、以及貯存時間。然而，關(guān)于核轉(zhuǎn)基因存在多種嚴(yán)重問題，包括基因沉默和低水平 的轉(zhuǎn)基因表達。解決與核轉(zhuǎn)基因有關(guān)的問題的一種方式是將轉(zhuǎn)基因插入植物的質(zhì)體基因組 中。質(zhì)體是植物特有的細胞器。每個植物細胞包含大約100種質(zhì)體，每種質(zhì)體包含大 約100個基因組。這實際上意味著，與植物核轉(zhuǎn)化相比，其中每個植物細胞將具有至多2-3 個拷貝的基因，當(dāng)將基因插入到質(zhì)體基因組中時，每個植物細胞包含大約10，000個拷貝的基因。相對于核基因表達，在質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因的表達具有許多優(yōu)點(i)轉(zhuǎn)基因不會通過 花粉擴散；(ii)高水平表達蛋白質(zhì)(高達總細胞蛋白的47%) ； (iii)由于質(zhì)體節(jié)制，蛋白 質(zhì)的“毒性”效應(yīng)降低；(iv)多種基因的同時表達便于生化途徑工程；以及(ν)消除了基因 沉默。質(zhì)體基因工程具有明確的基礎(chǔ)和適用的應(yīng)用，因為潛在地在很小的環(huán)境風(fēng)險下可以 高水平生產(chǎn)任何蛋白質(zhì)，從而開辟了生產(chǎn)可食用疫苗、生物藥品以及具有農(nóng)藝價值的產(chǎn)品 的可能性。目前，用來選擇質(zhì)體(其已用轉(zhuǎn)基因加以轉(zhuǎn)化)的僅有的可靠的選擇系統(tǒng)是基于 使用抗生素如壯觀霉素(奇放線菌素，spectinomycin)。這樣的選擇系統(tǒng)的一個缺點在于， 它們還將選擇對壯觀霉素具有抗性的自發(fā)核糖體突變體。鑒于所涉及的時間尺度，這是一 個較大的問題。本發(fā)明是基于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇和再生系統(tǒng)，其基于在質(zhì)體中基因如異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶(IPT)基因(細胞分裂素生物合成)的過度表達。該系統(tǒng)便于用缺乏細胞分裂素(由于 在質(zhì)體中的細胞分裂素生產(chǎn))的培養(yǎng)基直接選擇包含轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細胞。因此該系統(tǒng)提供了 沒有抗生素的選擇和再生系統(tǒng)，該系統(tǒng)將克服與自發(fā)壯觀霉素突變體有關(guān)的問題并關(guān)心在 GMO中抗生素抗性基因的使用。雖然IPT已先前在植物核轉(zhuǎn)化中被用作選擇性標(biāo)記(例如EP 1069855A)，但先前 沒有啟示它用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道以下事實質(zhì)體是在植物細胞內(nèi)的半自 主性細胞器(具有它們自己的基因組和代謝)。尤其是，先前未表明，在質(zhì)體中制備IPT前 體或產(chǎn)生的任何IPT能夠擴散出質(zhì)體而進入細胞質(zhì)以引發(fā)細胞分裂素信號從而刺激枝條再生。因此，用于選擇質(zhì)體選擇基因的標(biāo)準(zhǔn)不同于用于選擇基因組選擇基因的那些標(biāo)準(zhǔn)。由于以下事實，S卩，在成體植物中植物激素生物合成多肽的過度表達導(dǎo)致受損害 的發(fā)育，所以在已發(fā)生選擇和最初再生以后優(yōu)選除去植物激素生物合成基因。僅可以在除 去植物激素生物合成基因以后，才可能激活上述轉(zhuǎn)基因(表達感興趣的多肽)，使得還可以 消除在選擇和再生期間由于轉(zhuǎn)基因表達所引起的任何不利影響。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，該方法包 括以下步驟(i)用基因構(gòu)建物(genetic construct)轉(zhuǎn)化植物細胞，其中基因構(gòu)建物包含旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的至少 一種質(zhì)體的基因組中，其中轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒(Excision Cassette),(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，以及可選 地編碼多肽的核苷酸序列，其賦予對抗生素的抗性，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別。在一些實施方式中，該方法另外包括以下步驟(ii)用缺乏一種或多種植物激素生物合成多肽或抗生素的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化植物 細胞。在其它實施方式中，該方法另外包括以下步驟(iii)在植物細胞中表達重組酶，其中重組酶是識別第一和第二位點特異性重組 元件的重組酶。本發(fā)明的方法適合于可以被轉(zhuǎn)化和再生的所有植物。所述植物可以是單子葉植物 或雙子葉植物。合適的植物的實例是谷類(水稻、小麥、大麥、燕麥、高粱、玉米)、豆類(苜蓿、扁 豆、花生、豌豆、大豆)、油料作物(棕櫚、向日葵、椰子、油菜、橄欖)、經(jīng)濟作物(棉花、甘蔗、 木薯)、蔬菜作物(馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、甘薯、甜菜、南瓜、黃瓜、萵苣(生菜)、花椰菜、花 椰菜、食莢菜豆、卷心菜(甘藍)、芹菜、洋蔥、大蒜)、水果/樹木和堅果(香蕉、葡萄哈密瓜、 香瓜、西瓜、草莓、橘子、蘋果、芒果、鱷梨、桃、葡萄柚、菠蘿、楓、杏仁)、飲料(咖啡、茶、可可 粉)、以及木材樹(櫟樹、黑胡桃、懸鈴木)。其它合適的植物包括蘚類和浮萍。優(yōu)選地，植 物是煙草或生菜。
可以以任何方便的形式來使用待轉(zhuǎn)化的植物細胞，例如，作為個別細胞、細胞群， 以分離(離解)形式或未分離(離解)形式，或作為植物組織或植物部分的一部分。優(yōu)選 地，細胞存在于從完整植物除去的葉子中。優(yōu)選使用主動生長的葉子。術(shù)語“質(zhì)體”用來包括在真核植物的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的所有細胞器，其包含由雙膜結(jié) 合的DNA，并發(fā)育自常見類型，即前質(zhì)體。質(zhì)體可以包含色素和/或貯存材料。質(zhì)體的實例包括葉綠體、白色體、造粉體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、油質(zhì)體(造油體)以 及老年質(zhì)體(成體質(zhì)體)。優(yōu)選地，質(zhì)體是綠色質(zhì)體，最優(yōu)選葉綠體。如在本文中所使用的，術(shù)語“基因構(gòu)建物”是指核酸分子，其包含規(guī)定的元件和盒。 基因構(gòu)建物可以，例如，以載體或質(zhì)粒的形式。它還可以包含其它元件，其使得它可以處理 和再生，如復(fù)制起點、選擇元件、以及多克隆位點。通常，基因構(gòu)建物將是雙鏈核酸分子，優(yōu) 選dsDNA分子。第一和第二同源重組元件是這樣的重組元件，其能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植 物細胞中的至少一種質(zhì)體的基因組中。在將基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到植物細胞中以后，第一和第二同源重組元件與在所選質(zhì)體 的基因組中的對應(yīng)序列重組，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化盒插入到所選質(zhì)體的基因組中。選擇同源重組元件的核苷酸序列，使得轉(zhuǎn)化盒特異性地靶向一種或多種所選質(zhì) 體。尤其是，選擇同源重組元件的核苷酸序列，使得沒有或基本上沒有轉(zhuǎn)化盒被整合到植 物的核基因組或植物的線粒體基因組中。換句話說，同源重組元件的核苷酸序列優(yōu)選是質(zhì) 體特異性的，即，相應(yīng)的序列并不存在于核基因組中并且優(yōu)選并不存在于上述植物的線粒 體基因組中。這可以通過避免存在于植物的核基因組中以及可選地存在于線粒體基因組中 的序列來進行。通過標(biāo)準(zhǔn)方式，例如，通過核基因組的Southern印跡并借助于標(biāo)記的序列 探針或通過序列分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地檢測特異性序列是否存在于核基因組 中。除了上述外，可以使用來自質(zhì)體基因組的任何序列，只要所選的插入位點對于細 胞不是致死的，即，它并不導(dǎo)致細胞死亡。優(yōu)選地，插入位點不在質(zhì)體基因的編碼區(qū)中。第一和第二同源重組元件的序列的取向應(yīng)與質(zhì)體基因組中的取向相同以便于有 效的同源重組。為了使轉(zhuǎn)化盒靶向質(zhì)體基因組，第一和第二同源重組元件的核苷酸序列必須相同 或基本相同于所選植物質(zhì)體的基因組中的序列。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“基本上相同”是指第一和第二同源重組序列的核苷酸序 列獨立地大于95 %，優(yōu)選大于98 %或大于99 %以及特別優(yōu)選100 %相同于在待轉(zhuǎn)化的質(zhì) 體中存在的序列。可以利用序列對比的Clustal方法并使用默認(rèn)參數(shù)，例如KTUPLE UGAP PENALTY = 3、WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，來確定百分比序列同一性。類似地，第一和第二同源重組元件的核苷酸序列應(yīng)優(yōu)選不相同于或基本上相同于 在所選植物的核基因組中的序列。在該范圍內(nèi)，術(shù)語“基本上相同”是指第一和第二同源 重組序列的核苷酸序列獨立地小于50%，更優(yōu)選小于70%或小于90%相同于在待轉(zhuǎn)化植 物的核基因組中存在的序列?？梢岳眯蛄袑Ρ鹊腃lustal方法并使用默認(rèn)參數(shù)，例如 KTUPLE UGAPPENALTY = 3、WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，來確定百分比序列同 一性。
優(yōu)選地，第一和第二同源重組序列的長度將各自獨立地是50-2500、50-2000、 50-1500或50-1000個核苷酸，更優(yōu)選長度約150、約1000或約1200個核苷酸。在質(zhì)體基因組中，第一和第二同源重組序列之間的距離可以是0-4000個核苷酸 或更多。優(yōu)選地,距離是約1-100、100-500、500-1000或1000-3000個核苷酸。存在于第一和第二同源重組之間的遺傳元件(即，遺傳元件(a)-(d))的總長度優(yōu) 選少于4000個核苷酸。優(yōu)選地，第一同源重組序列是煙草(Nicotiana tabacum)(登錄號Z00044)葉綠 體基因組DNA的核苷酸104091-105380 ；和/或優(yōu)選地，第二同源重組序列是煙草(登錄號 Z00044)葉綠體基因組DNA的核苷酸105381-106370。在另外的其它實施方式中，第一同源重組序列優(yōu)選是煙草(登錄號Z00044)葉綠 體基因組DNA的核苷酸1(^925-101857 ；和/或第二同源重組序列是煙草(登錄號Z00044) 葉綠體基因組DNA的核苷酸100933-100130。轉(zhuǎn)化盒啟動子(a)必須是在所選植物質(zhì)體中可操作的轉(zhuǎn)化盒啟動子。該啟動子是 這樣的啟動子，其能夠在已切除所述切除盒以后引發(fā)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄；以及能夠在切除盒并 不包含自己的啟動子的情況下引發(fā)編碼植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。該啟 動子可以，例如，是來自植物或細菌基因的啟動子。優(yōu)選地，啟動子是植物特異性的。合適的啟動子的實例包括PpsbA、RbcL以及ftrri啟動子。優(yōu)選地，啟動子是ftrn啟動子(例如，質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。其它優(yōu)選的啟動子包括ftrn-rbcl-ds啟動子構(gòu)建物，如圖M以及其圖例所示； Prrn-atpB-ds啟動子構(gòu)建物，如圖25以及其圖例所示；以及ftrn-T7glO啟動子構(gòu)建物，如 圖沈以及其圖例所示。在一些實施方式中，啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。這便于選擇基因的可誘導(dǎo)的、受控表 達。例如，可誘導(dǎo)啟動子可以是通過IPTG可誘導(dǎo)的，例如ftrnL啟動子。其它可誘導(dǎo)啟動 子包括通過光、黑暗、乙醇、干旱、金屬、病原體、生長調(diào)節(jié)劑、熱、冷、半乳糖以及其它糖可誘 導(dǎo)的那些可誘導(dǎo)啟動子?？商鎿Q地，啟動子是高表達水平啟動子。切除盒包括第一位點特異性重組元件；可選地，第二啟動子；編碼植物激素生物 合成多肽的核苷酸序列；終止序列；以及第二位點特異性重組元件。第一和第二位點特異性重組元件是核苷酸的序列，其能夠被位點特異性重組酶識 別和/或結(jié)合，其中所述位點特異性重組酶是通過重組酶所產(chǎn)生的。位點特異性重組元件 必須旁側(cè)切除盒中的遺傳元件，例如元件(b2)(如果使用的話)、(b3)、(b4)、任何其它所期 望的元件。第一和第二重組元件的序列將彼此相同或基本上相同；并且將相對于彼此處于 相同取向(例如，均為5' -3'或均為3' -5')。當(dāng)重組酶是Cre時，位點特異性重組序列優(yōu)選為Iox序列。位點特異性Iox重組 位點是34bp序列；這些重組位點作為用于Cre重組酶多肽的結(jié)合位點。野生型Iox序列是 優(yōu)選的(^10 J, Niu Qff, Moller SG，Chua NH (2001) Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nat. Biotechnol. 19,157-161.)。切除盒啟動子(當(dāng)存在時)必須是在所選的植物質(zhì)體中可操作的啟動子。該啟動 子是能夠引發(fā)植物激素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。該啟動子可以是來自植物或細菌基因的啟動子。優(yōu)選地，啟動子是植物特異性的。合適的啟動子的實例包括I^sbA、RbcL以及 Prrn啟動子。優(yōu)選地，啟動子是ftrn啟動子(例如，質(zhì)體核糖體RNA (rrn)操縱子啟動子 (nt 59034-59303,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。植物激素生物合成多肽作為選擇標(biāo)記，從而便于選擇已用轉(zhuǎn)化盒轉(zhuǎn)化的植物細 胞。植物激素生物合成多肽可以是任何多肽，其涉及植物細胞分裂素或植物生長素或其它 植物生長調(diào)節(jié)劑的合成，或其調(diào)節(jié)植物細胞分裂素或植物生長素或其它植物生長調(diào)節(jié)劑的 生產(chǎn)或代謝。優(yōu)選地，存在編碼1、2、3、或4個植物激素生物合成多肽的核苷酸序列。編碼植物 激素生物合成多肽的核苷酸序列可以存在于操縱子中，并具有單個可選的啟動子和終止元 件?？商鎿Q地，植物激素生物合成多肽核苷酸序列可以各自具有它們自己的啟動子和終止 元件。進一步的選項是，存在編碼植物激素生物合成多肽的兩個或更多的核苷酸序列，作為 融合蛋白，可選地具有連接蛋白的短接頭序列(例如，編碼1-10個氨基酸接頭序列，例如聚 甘氨酸接頭)。在其它實施方式中，編碼植物激素生物合成多肽的一些核苷酸序列可以存在 于操縱子中和/或作為融合蛋白，并且其它核苷酸序列具有它們自己的啟動子和/或終止 子。在一些實施方式中，植物激素生物合成多肽是IPT (異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)，其是與細 胞分裂素生物合成有關(guān)的酶。IPT核苷酸序列可以來自任何合適的來源。由于密碼子用法， 細菌IPT基因是優(yōu)選的，這是因為核基因在葉綠體不可能表達到最高水平。優(yōu)選地，IPT核苷酸序列來自根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或來自 植物(例如，來自正被轉(zhuǎn)化的植物)。在其它實施方式中，植物激素生物合成多肽是iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)和/或 iaaM(色氨酸單加氧酶)，其是與植物生長素生物合成有關(guān)的酶。核苷酸序列可以來自任何 來源。由于密碼子用法，細菌iaaH和/或iaaM基因是優(yōu)選的。優(yōu)選地，iaaH和/或iaaM核苷酸序列來自根瘤土壤桿菌。在本發(fā)明的其它實施方式中，其中涉及植物生長素生物合成酶，可以用缺乏植物 生長素的培養(yǎng)基來選擇轉(zhuǎn)化植物。自然存在的植物生長素的實例包括4-氯吲哚乙酸、苯乙 酸(PAA)以及吲哚-3- 丁酸(IBA)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，植物激素生物合成酶是iaaH和iaaM，優(yōu)選來自 根瘤土壤桿菌。切除盒終止子可以防止在切除所述切除盒以前轉(zhuǎn)基因的過早表達。為此可以使用 任何終止子，只要它在被轉(zhuǎn)化的植物細胞中被識別。尤其是，終止子可以是植物終止子或細 菌終止子。合適的終止子的實例包括rrn、psbA、rbcL以及T7終止子。優(yōu)選的終止子是TrbcL終止子(例如，核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺 苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。在本發(fā)明的一些實施方式中，在切除盒中所使用的啟動子和終止子并不來自相同 質(zhì)體基因。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”(即，元件(C))用來指被引入到質(zhì)體的基因組 中的核酸分子。轉(zhuǎn)基因可以是，例如，基因組DNA、cDNA或合成核酸分子，其編碼肽或多肽；
11編碼mRNA、tRNA或核酶的核酸分子；或任何其它核酸分子。轉(zhuǎn)基因的實例包括那些轉(zhuǎn)基因，其編碼抗體、抗生素、除草劑、疫苗抗原、酶、酶抑 制劑以及設(shè)計肽。單抗原或多抗原可以產(chǎn)生自病毒科、細菌、真菌或其它病原體。抗原可以表達為多 種抗原的單個單位或多個單位，例如用于廣譜疫苗開發(fā)。可以產(chǎn)生用于化妝品的酶(例如，超氧化物歧化酶、過氧化物酶等)。還可以產(chǎn)生 用于去污劑組合物的酶。本發(fā)明特別涉及具有特異性活性的蛋白/酶的生產(chǎn)，例如，用來提高免疫反應(yīng)的 免疫刺激劑，如干擾素；以及生長因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NGF、BDNF、NT3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、蛋白水解酶(木瓜蛋白 酶、菠蘿蛋白酶)、以及食品補充酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶)。本發(fā)明還涉及在質(zhì)體中蛋白/酶的生產(chǎn)或過度表達，其使得植物更耐生物和非生 物脅迫，如鹽和金屬。其實例包括產(chǎn)生葉綠體轉(zhuǎn)基因植物，其螯合鐵(Fe)以在重要的農(nóng)業(yè) 區(qū)清除過量金屬，從而供未來的種植。本發(fā)明進一步涉及使用編碼多肽的轉(zhuǎn)基因，其可以改進在質(zhì)體中的脂肪酸生物合 成?？梢詫⒁环N或多種轉(zhuǎn)基因插入到轉(zhuǎn)化盒中。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因序列是相鄰的。轉(zhuǎn)基因序列可以另外編碼融合于感興趣的多肽的蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽。蛋白質(zhì)純化標(biāo) 簽的實例包括N末端流感血細胞凝集素-HA-表位(HA)和6個組氨酸氨基酸的序列(HIS6) 以及鏈球菌標(biāo)簽。每種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可以具有不同的親和標(biāo)記物。在已切除所述切除盒以后，第一啟動子能夠驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表達，導(dǎo)致在質(zhì)體中轉(zhuǎn) 基因的產(chǎn)物的積累。通過任何合適的方式，可以從植物細胞純化或分離轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物。在本發(fā)明的一些實施方式中，組成型表達轉(zhuǎn)基因，而與是否已除去所述切除盒無 關(guān)。在這樣的實施方式中，轉(zhuǎn)基因可以表達自其自己的啟動子。如果在再生期間植物并不 顯示轉(zhuǎn)基因表達的任何有害影響，則這樣的實施方式是有用的。轉(zhuǎn)化盒終止子(遺傳元件(d))會終止轉(zhuǎn)基因的表達。為此可以使用任何終止子， 只要它在被轉(zhuǎn)化的植物細胞中被識別。尤其是，終止子可以是植物終止子或細菌終止子。合適的終止子的實例包括TrbcL或TspbA聚腺苷酸加成序列。優(yōu)選的終止子是 psbA聚腺苷酸加成序列。在轉(zhuǎn)化盒中，優(yōu)選以次序(a)、(b)、(c)、(d)可操作地連接元件。在切除盒中，第一和第二位點特異性重組元件必須旁側(cè)可選的啟動子(當(dāng)存在 時)、編碼植物激素生物合成多肽的核苷酸序列以及終止元件。在本發(fā)明的一些實施方式中，編碼植物激素生物合成多肽的核苷酸序列和終止元 件將在轉(zhuǎn)化盒的啟動子的下游(即3')，因而后面的啟動子將能夠驅(qū)動植物激素生物合成 多肽的表達。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，包括(bl)第一位點特異性重組元件，
(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，在5' -3'方向上以上面規(guī)定的次序可操作地連接。在本發(fā)明的該實施方式中，第一啟動子能夠驅(qū)動編碼植物激素生物合成多肽的核 苷酸序列的表達(例如，如圖3-4所示)。在除去所述切除盒以后，第一啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因 的表達。在本發(fā)明的其它實施方式中，與第一啟動子、轉(zhuǎn)基因以及第一終止元件相比，切除 盒將是處于反方向。在該實施方式中，切除盒的表達部分將以反方向存在于這樣的核苷酸 鏈中，其互補于編碼第一啟動子、轉(zhuǎn)基因以及第一終止元件的核苷酸鏈。在這樣的實施方式中，切除盒將包含第二啟動子，其能夠驅(qū)動編碼植物激素生物 合成多肽的核苷酸序列的表達。在本發(fā)明的該實施方式中，轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中(a)、(b)、(c)以及(d)在5' -3'方向上以上面規(guī)定的次序可操作地加以連 接，其中切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)第二啟動子，(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別，并且其中可操作性連接切除盒的部分并且其中與(a)、(c)以及(d)相比，切除盒處于 反方向。在該實施方式中，第二啟動子驅(qū)動編碼植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的表 達(例如，如圖5-6所示)。在除去所述切除盒以后，第一啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表達。轉(zhuǎn)化盒并不限于本文規(guī)定的部分(a)-(d)。它可以例如另外包含5' -UTR以增加 轉(zhuǎn)基因的表達水平和/或3'-另外的氨基酸以增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一些實施方式中，轉(zhuǎn)化盒另外包含第二選擇性標(biāo)記基因，例如抗生素 抗性基因，優(yōu)選編碼壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(例如，aadA基因)。這種多肽賦 予對抗生素壯觀霉素的抗性?？梢詫⒕幋a壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列置于轉(zhuǎn)化盒 中的啟動子之一的下游。它可以例如被置于下游并可操作性地連接至第一啟動子；或置于下游并可操作性地連接至編碼植物激素生物合成多肽(例如，IPT)的核苷酸序列；或置于 上游并可操作性地連接至編碼植物激素生物合成多肽(例如，IPT)的核苷酸序列。在還有的其它實施方式中，轉(zhuǎn)化盒排除第二選擇性標(biāo)記基因和/或排除核苷酸序 列，其賦予對抗生素的抗性。在一些實施方式中，轉(zhuǎn)化盒另外包含LacI基因，優(yōu)選在適當(dāng)啟動子(例如T7)的 控制下，以便于可誘導(dǎo)的表達。在將轉(zhuǎn)化盒成功遞送到質(zhì)體以后，用缺乏植物激素生物合成多肽的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn) 化細胞。通常，通過添加細胞分裂素和植物生長素來再生植物。因為轉(zhuǎn)化質(zhì)體將優(yōu)選產(chǎn)生 IPT，因而產(chǎn)生細胞分裂素，所以在僅植物生長素存在的條件下可以選擇和再生植物。用于 選擇的細胞將優(yōu)選是葉細胞。在本發(fā)明的一些實施方式中，在細胞分裂素抑制劑(例如，細胞分裂素氧化酶或 化學(xué)抑制劑)存在的情況下選擇植物，以使細胞分裂素從生物合成位點到植物其它部分的 滲漏最小化。這減少了在植物中的鑲嵌性(鑲嵌現(xiàn)象)。在本發(fā)明的一些實施方式中，該方法另外包括以下步驟(iii)在植物細胞中表達重組酶，其中重組酶是識別第一和第二位點特異性重組 元件的重組酶。該重組酶是位點特異性重組酶。位點特異性重組酶是一種多肽，該多肽能夠結(jié)合 于位點特異性重組元件并在位點特異性重組元件附近的核酸分子中誘導(dǎo)交換事件。在本發(fā) 明中，重組酶的表達導(dǎo)致從質(zhì)體基因組切除所述切除盒。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，重組酶是這樣的一種重組酶，其能夠結(jié)合于存在于切除盒中 的第一和第二位點特異性重組元件，導(dǎo)致以標(biāo)準(zhǔn)方式切除所述切除盒。位點特異性重組元件/位點特異性重組酶的實例包括Cre-lox，來自釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisae)的 FLP-FRP 系統(tǒng)(0 ‘ Gorman S, Fox DT，Wahl GM. (1991) Recombinase-mediated gene activation and site-specificintegration in mammalian cells. Science. 25，1351-1555.))，來自噬菌體 Mu 的 GIN/gix 系統(tǒng)(Maeser S and Kahmann R. (1991)The Gin recombinase ofphage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. MoIGen Genet. 230,170-176.)或來自魯氏酵 母菌(Zygosaccharomyces rouxii)的 R/RS 系統(tǒng)(Onouchi H, Yokoi K, Machida C, Matsuzaki H, Oshima Y, Matsuoka K, Nakamura K, Machida Y. (1991)Operation of an efficientsite-specific recombination system of Zygosaccaromyces rouxii in tobaccocells. Nucleic Acids Res. 19,6373-6378·)。編碼重組酶的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子，優(yōu)選植物特異性內(nèi)含子。這樣的內(nèi)含 子的存在將抑制重組酶多肽在原核生物例如細菌中的表達。優(yōu)選的重組位點是Iox連同重組酶Cre。優(yōu)選地，使用的重組酶序列是編碼Cre多 肽的cDNA序列。優(yōu)選地，通過重組酶從質(zhì)體基因組切除所有或基本上所有切除盒。然而，本領(lǐng)域技 術(shù)人員將明了，一個或多個重組元件的一些或所有序列可以留在質(zhì)體基因組中。通過任何 合適的方式，重組酶可以表達在細胞中。在本發(fā)明的一些實施方式中，植物細胞是這樣一種細胞，其已經(jīng)包括被整合到核基因組中的可表達構(gòu)建物，其中可表達構(gòu)建物包括編碼質(zhì)體靶向的轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列和 重組酶(可操作性連接的，即，在框架中)?？杀磉_構(gòu)建物可以例如通過同源重組被引入到 核基因組中。在這樣的情況下，重組酶必須是在可誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下。借助于構(gòu)建物，這 樣的可誘導(dǎo)啟動子可以被引入，或構(gòu)建物可以被整合到相鄰于內(nèi)源性可誘導(dǎo)啟動子。通過交叉，可以從期望的群體除去包含編碼重組酶的位于核的序列的植物，其中， 由于這種性狀的分離，可能失去上述序列。在本發(fā)明的其它實施方式中，植物細胞是這樣一種細胞，其已經(jīng)包括被整合到期 望的質(zhì)體的基因組中的可表達構(gòu)建物，其中可表達構(gòu)建物包括編碼重組酶的核苷酸序列。 可表達構(gòu)建物可以例如通過同源重組已被引入到質(zhì)體基因組中。在這樣的情況下，重組酶 必須是在可誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下。借助于構(gòu)建物，這樣的可誘導(dǎo)啟動子可以已被引入，或構(gòu) 建物可以已被整合到相鄰于內(nèi)源性可誘導(dǎo)啟動子。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟(iii)包括(iii)從可操作性地連接至 編碼重組酶(其存在于植物細胞中)的核苷酸序列的可誘導(dǎo)啟動子，在植物細胞中誘導(dǎo)重 組酶的表達，其中重組酶識別第一和第二位點特異性重組元件。優(yōu)選地，可操作性地連接至編碼重組酶的核苷酸序列的可誘導(dǎo)啟動子存在于植物 細胞的核基因組中。在其它優(yōu)選的實施方式中，可操作性連接于編碼重組酶的核苷酸序列的可誘導(dǎo)啟 動子存在于植物細胞的質(zhì)體基因組中。在本發(fā)明的其它實施方式中，在步驟⑴以前、與步驟⑴同時或在步驟⑴以 后；或在步驟(ii)以前、與步驟(ii)同時或在步驟(ii)以后，用重組酶載體來轉(zhuǎn)化植物細 胞，所述重組酶載體包括可操作性連接于編碼重組酶的核苷酸序列的啟動子。重組酶載體是這樣的核酸載體，該核酸載體包括能夠驅(qū)動下游重組酶的表達的啟 動子元件。優(yōu)選設(shè)計上述載體，使得重組酶僅在或基本上僅在質(zhì)體中表達或特異性地靶向 或基本上特異性地靶向質(zhì)體。在重組酶載體中的啟動子必須是在待轉(zhuǎn)化的植物細胞中可操作的啟動子。該啟動 子可以，例如是來自植物或細菌基因的啟動子。優(yōu)選地，啟動子是植物特異性或質(zhì)體特異性 的。最優(yōu)選地，啟動子是可誘導(dǎo)啟動子如XVE(Zuo J, Niu Qff, Chua NH. (2000)Technical advance :An estrogenreceptor—based transactivator XVE mediates highly inducible gene expressionin transgenic plants. Plant J. 24，265—273.)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“植物特異性的”是指植物特異性的或基本上植物特異性 的。類似地，術(shù)語“質(zhì)體特異性的”是指質(zhì)體特異性的或基本上質(zhì)體特異性的。啟動子可以是或可以不是可誘導(dǎo)啟動子。如果在選擇(步驟(ii))以前或期間將 重組酶載體引入到植物細胞中，則優(yōu)選啟動子是可誘導(dǎo)的。能夠在植物中操作的可誘導(dǎo)啟 動子的實例包括光可誘導(dǎo)啟動子、金屬可誘導(dǎo)啟動子、熱激啟動子以及其它環(huán)境可誘導(dǎo)啟 動子。優(yōu)選地，啟動子是可誘導(dǎo)啟動子，例如XVE啟動子(Zuo J，Niu Qff,Chua NH. (2000) Technical advance :An estrogen receptor—basedtransactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenicplants. Plant J. 24，265—273.)或 lac 啟動子。
在本發(fā)明的一種實施方式中，重組酶載體包括可操作性地連接于核苷酸序列的啟 動子，所述核苷酸序列編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽和重組酶。在表達以后，將產(chǎn)生多肽產(chǎn)物，其包括可操作性連接于重組酶多肽的靶向質(zhì)體的 轉(zhuǎn)運肽。在該實施方式中，啟動子可以是或可以不是質(zhì)體特異性的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽”是指這樣的肽序列，該肽序列能夠 以特異性或基本上特異性方式使重組酶多肽靶向質(zhì)體。在表達以后，將產(chǎn)生重組酶多肽并 借助于靶向質(zhì)體的肽將該多肽特異性地導(dǎo)入到質(zhì)體中。靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽的實例包括來自靶向質(zhì)體的蛋白的靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽。優(yōu)選地，靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽是能夠使重組酶多肽靶向葉綠體的轉(zhuǎn)運肽。最優(yōu)選地，靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽是來自基質(zhì)質(zhì)體靶向的蛋白的靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽。靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽的具體實例包括來自AtABCl的轉(zhuǎn)運肽(SimonGeir Moller, Tim Kunkel and Nam-Hai Chua. (2001) “ A plastidic ABC proteininvolved in intercompartmental communication of light signaling " , Genes andDev.15, 90-103.)；來自 AtMinEl 的轉(zhuǎn)運肽(Jodi Maple, Nam-Hai Chua andSimon Geir Moller (2002) " The topological specificity factor AtMinEl isrequired for correct plastid division site placement in Arabidopsis" , Plant J. 31, 269-277)；以及來自 GIANT CHL0R0PLAST 1 的轉(zhuǎn)運肽(Jodi Maple, Makoto Τ. Fujiwara, Nobutaka Kitahata, Tracey Lawson, Neil Baker, ShigeoYoshida and Simon Geir Moller (2004) " GIANT CHL0R0PLAST 1 isessential for correct plastid division in Arabidopsis ". Current Biology. 14，776-781))。最優(yōu)選地，重組酶載體包括XVE啟動子，其可操作性地連接于編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn) 運肽的核苷酸序列，以及CRE重組酶。重組酶載體還可以包括其它元件，例如，nptll基因(卡那霉素抗性)，以便于轉(zhuǎn)化 細胞的選擇。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟(iii)包括(iii)用重組酶載體轉(zhuǎn)化植 物細胞，所述重組酶載體包括啟動子、編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列以及重組酶，其 中重組酶是識別第一和第二位點特異性重組元件的重組酶。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟(iii)包括(iii)用重組酶載體轉(zhuǎn)化植物細胞，上述 重組酶載體包括啟動子、編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列以及重組酶，其中啟動子能 夠驅(qū)動編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列以及重組酶在植物細胞中的表達，并且其中， 在植物細胞中表達以后，重組酶多肽通過轉(zhuǎn)運肽而靶向質(zhì)體。更優(yōu)選地，啟動子是可誘導(dǎo)啟 動子。在本發(fā)明的其它實施方式中，基因構(gòu)建物另外包括如本文定義的重組酶載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用核酸載體來轉(zhuǎn)化植物細胞的許多方法。這些方法包括 直接DNA攝取到原生質(zhì)體中、PEG介導(dǎo)攝取到原生質(zhì)體、微粒轟擊、電穿孔、熱激、DNA的微 注射、組織外植體或細胞的微粒轟擊、植物組織的真空滲入、借助于土壤桿菌的植物組織的 T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、以及植物(優(yōu)選煙草)液體培養(yǎng)。為了轉(zhuǎn)化包含所選質(zhì)體的植物細胞，可以使用任何這樣的合適的方法。在本發(fā)明的一些實施方式中，待轉(zhuǎn)化的植物細胞是保衛(wèi)細胞，即，氣孔保衛(wèi)細胞。這樣的細胞已表明是全能的，因此再生應(yīng)當(dāng)是更有效的。保衛(wèi)細胞可以用作表皮條或用作 分離的保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體。(Hall et al. 1996. 112 889-892，Plant Physiology ；Hall et al.1996，14. 1133-1138，NatureBiotechnology)。為了使基因構(gòu)建物靶向質(zhì)體，生物導(dǎo)彈(biolistic)轉(zhuǎn)化是優(yōu)選的。這涉及將核 酸載體涂敷的金顆粒(微粒)發(fā)射到植物組織的質(zhì)體中，接著是轉(zhuǎn)化質(zhì)體的選擇和植物再 生。優(yōu)選地，植物組織是植物葉片，雖然還可以使用胼胝體(就水稻轉(zhuǎn)化來說)。本發(fā)明的方法優(yōu)選還包括以下另外的步驟在植物細胞中誘導(dǎo)重組酶的表達。該步驟將在重組酶載體/可表達構(gòu)建物和轉(zhuǎn)化盒均存在于植物細胞中以后進行。 優(yōu)選地，該步驟將在用缺乏植物激素細胞分裂素的培養(yǎng)基選擇植物細胞以后進行?？梢酝ㄟ^施加誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)重組酶的表達，其導(dǎo)致激活存在于重組酶載體中的 啟動子或內(nèi)源性啟動子或可表達構(gòu)建物。表達重組酶多肽，然后使它結(jié)合于切除盒中的第 一和第二位點特異性重組元件，從而導(dǎo)致所述盒的切除。(如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，位 點特異性重組元件之一和某個相鄰序列可以留在質(zhì)體基因組中)。在從質(zhì)體基因組已除去編碼植物激素生物合成多肽的核苷酸序列以后，存在于轉(zhuǎn) 化盒中的啟動子將能夠直接表達下游轉(zhuǎn)基因，因而產(chǎn)生感興趣的多肽。通常，在細胞分裂素(嫩枝形成)和植物生長素(根形成)存在的情況下再生植 物。在再生包含IPT基因(產(chǎn)生細胞分裂素)的植物的情況下，適當(dāng)?shù)募毎?組織(例如， 葉節(jié))將被置于僅包含植物生長素的培養(yǎng)基上(用于根再生)，而由于IPT基因的存在將發(fā) 生嫩枝再生。本發(fā)明還提供了一種用于制備轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方法，該方法包括用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物 細胞的方法(如上文所描述的)，以及另外包括從質(zhì)體純化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方式包括用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，該方法包 括以下步驟(i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，其中基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的至少 一種質(zhì)體的基因組中，其中轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別，并且其中第一和第二位點特異性重組元件是Iox元件并且重組酶是Cre。本發(fā)明的另一種特別優(yōu)選的實施方式包括用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，該方法 包括以下步驟(i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，其中基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的至少 一種質(zhì)體的基因組中，其中轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，其中一個 或多個的多肽是IPT，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別。本發(fā)明的又一種特別優(yōu)選的實施方式包括用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，該方法 包括以下步驟(i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，其中基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的至少 一種質(zhì)體的基因組中，其中轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中切除盒包含(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，其中一個 或多個的多肽是IPT，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別并且其中第一和第二位點特異性重組元件是Iox元件且重組酶是Cre。又一種特別優(yōu)選的實施方式提供了一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，該方法包 括以下步驟(i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，其中基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的至少 一種質(zhì)體的基因組中，其中轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c) 一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，其中一個 或多個的多肽是IPT，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別并且其中第一和第二位 點特異性重組元件是Iox元件且重組酶是Cre，(ii)用缺乏IPT的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化植物細胞；以及(iii)在植物細胞中，以導(dǎo)致從質(zhì)體基因組切除所述切除盒的水平表達Cre重組酶。本發(fā)明還提供了一種如本文定義的轉(zhuǎn)化盒、以及如本文定義的重組酶載體。本發(fā)明進一步提供了一種包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒的植物細胞、包含本發(fā)明的重組酶 載體的植物細胞、以及包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒和重組酶載體的植物細胞。本發(fā)明進一步提供了一種包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒的轉(zhuǎn)基因植物、包含本發(fā)明的重組 酶載體的轉(zhuǎn)基因植物、以及包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒和重組酶載體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明進一步提供了一種包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒的植物種子、包含本發(fā)明的重組酶 載體的植物種子、以及包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒和重組酶載體的植物種子。本發(fā)明進一步提供了一種包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒的植物質(zhì)體、包含本發(fā)明的重組酶 載體的植物質(zhì)體、以及包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒和重組酶載體的植物質(zhì)體。另外，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明的方法可獲得或獲得的植物細胞。


圖1是示出了 IPT基因切除和YFP基因激活的總體原則的示意圖。包含IPT基因的pPTIOOl-YFP被夾在兩個Iox位點之間，其便于在再生以后的CRE 介導(dǎo)的IPT切除。IPT基因的除去導(dǎo)致同時轉(zhuǎn)基因(YFP)激活。
圖2 =CRE 誘導(dǎo)切除 pPTIOOl-YFP 中的 IPT 盒。包含pPTIOOl-YFP載體的大腸桿菌DH5a細胞的明場(A)和熒光⑶圖像。包含 pPTIOOl-YFP和pERlO-TP.CRE載體的大腸桿菌DH5a細胞的明場(C)和熒光(D)圖像(圖 1)。在pPTIOOl-YFP中IPT盒的CRE誘導(dǎo)切除導(dǎo)致來自ftrn啟動子的YFP的組成型表達。 (E)利用跨越TrbcL和TpsbA終止子的引物在pPTIOOl-YFP載體中IPT盒的CRE誘導(dǎo)切除 的PCR證實(圖3)。M 分子量標(biāo)記。圖 3 (A)pPTIOOl 和(B)pPT1001-YFP 載體的示意圖。HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； Prrn 質(zhì)體核糖體RNA (rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體 基因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；YFP 黃色熒光蛋白；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。圖4 包含蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽的修飾pPTIOOl-YFP載體(pPTIOOl載體系列)的示意圖。(A) pPTIOOla-YFP,包含N末端流感血細胞凝集素-HA-附加表位(HA3)的 pPTIOOl-YFP。(B)pPTIOOlb-YFP，包含 6 個 N 末端組氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI001-YFP。(C) pPTI001c-YFP,包含C末端流感血細胞凝集素-HA-附加表位(HA3)的 pPTIOOl-YFP。(D) pPT100Id-YFP，包含 6 個 C 末端組氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI001-YFP。為了便于使用EcoRV 作為來自在(C)pPTIOOlc-YFP 禾Π (D)pPTIOOld_YFP 中的 YFP 的克隆位點下游，修飾IPT DNA序列，以將在核苷酸位置519處的腺嘌呤改變成胍(+1作為 在起始密碼子中的腺嘌呤)，從而除去內(nèi)源性EcoRV位點。圖 5 (A) pPTI002 和(B) pPTI002_YFP 載體的示意圖。HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； Prrn 質(zhì)體核糖體RNA (rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體 基因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；YFP 黃色熒光蛋白；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。載體系列ρΡΤΙ002的結(jié)構(gòu)(還參見圖6)是用來確保在CRE介導(dǎo)切除以前不存在 從ftrn啟動子到上述轉(zhuǎn)基因(在這種情況下為YFP)的遺漏表達。雖然這似乎并不是真正 的問題，如圖2所示，但我們已將IPT基因和YFP基因置于相反取向。圖6 包含蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽的修飾PPTI002-YFP載體(pPTI002載體系列)的示意 圖。 (A) pPTI002a-YFP,包含N末端流感血細胞凝集素-HA-附加表位(HA)的 PPTI002-YFP。 (B)pPTI002b-YFP，包含 6 個 N 末端組氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI002_YFP。
(C) pPTI002c-YFP,包含C末端流感血細胞凝集素-HA-附加表位(HA)的 PPTI002-YFP。(D)pPTI002d-YFP，包含 6 個 C 末端組氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI002_YFP。為了便于使用EcoRV 作為來自在(C)pPTI002c_YFP 禾Π (D)pPTI002d_YFP 中的 YFP 的克隆位點下游，修飾IPT DNA序列，以將在核苷酸位置519處的腺嘌呤改變成胍(+1作為 在起始密碼子中的腺嘌呤)，從而除去內(nèi)源性EcoRV位點。圖 7 :pER10/TPCRE 的示意圖。XVE作為可誘導(dǎo)啟動子，其驅(qū)動TP-CRE (融合于CRE的轉(zhuǎn)運肽)表達。該轉(zhuǎn)基因的 選擇是通過由nptll基因賦予的卡那霉素抗性。圖8 使用IPT選擇性標(biāo)記來選擇和再生陽性葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。A)質(zhì)體轉(zhuǎn)化以后的第一輪選擇表明在沒有細胞分裂素存在的情況下存在新的嫩芽。B)來自A所示的初級轉(zhuǎn)化體的第二輪選擇。C)用于CRE滲入和GFP激活的再生葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植物(圖10)。圖9 轉(zhuǎn)基因插入煙草質(zhì)體基因組的證實。利用在煙草葉綠體基因組的旁側(cè)區(qū)中 的引物和在盒內(nèi)退火到TrbcL終止子的引物，證實了在同源重組位點pPTIOOl/YFP插入煙 草葉綠體基因組。示出的泳道WT，野生型；#1，再生物1 ’#2再生物2 ；M，標(biāo)記。圖10 在煙草葉細胞中YFP表達的誘導(dǎo)。在pER10/TP. CRE的滲入和誘導(dǎo)以后，通過熒光顯微鏡分析的包含pPTIOOl/YFP轉(zhuǎn) 化盒的再生物葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植物。通過落射熒光顯微鏡并利用Volocity II軟件來俘 獲重建YFP熒光團(YFP)和葉綠素自身熒光(Chlorophyll)的擴展焦點圖像。比例尺= 5 μ m0圖11 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTI005 HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； PpsbA 質(zhì)體psbA啟動子；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；T7 :T7轉(zhuǎn)錄終止序列；Prrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序列(ntl05381_106370，登錄號Z00044煙 草葉綠體基因組DNA)。圖12 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體ρΡΤΙ007 H0M3 同源重組序列(nt 1(^925-101857，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； PpsbA 質(zhì)體psbA啟動子；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；T7 :T7轉(zhuǎn)錄終止序列；Prrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重組序列(nt 100933-100130，登錄號Z00044 煙草葉綠體基因組DNA)。
圖13 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體ρΡΤΙ008 H0M3 同源重組序列(nt 1(^925-101857，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA:壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重組序 列(nt 100933-100130，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。IPT. aadA盒構(gòu)建為操縱 子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6個堿基對隔離物。圖14 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體ρΡΤΙ009 H0M3 同源重組序列(nt 1(^925-101857，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA:壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重組序 列(nt 100933-100130，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。IPT. aadA盒表達為融合蛋 白。在IPT a基因之前有SD序列和a 6個堿基對隔離物并且兩個可讀框由8個甘氨酸接 頭序列隔開。圖15 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pinPTI。每種pPTI載體包含組成型表達LacI基因。ρΡΤΙ003作為一個實例示出。將修飾 的ftrn啟動子(ftTnL)插入IPT. aadA盒的上游，從而便于IPT. aadA盒的可誘導(dǎo)、受控表 達。(A)pindlPTI，包含LacI可讀框并在IPT. aadA盒上游的ftrn啟動子序列和修飾PrrnL 啟動子的調(diào)控下的pPTI。(B)pind2PTI，包含LacI可讀框并在IPT. aadA盒上游的T7啟 動子序列和修飾ftrnL啟動子調(diào)控下的pPTI。HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380, 登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；Prrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；IPT 來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶基因；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL 核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧 酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉 綠體基因組DNA)。IPT. aadA盒構(gòu)建為操縱子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6 個堿基對隔離物。圖16 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTI+將修飾每種pPTI載體以包含修飾的ftrn-trbcUPrrn啟動子構(gòu)建物，由ftrn啟 動子和rbcL 5'翻譯調(diào)控區(qū)構(gòu)成)，以最終產(chǎn)生外源蛋白的更高水平的表達。PPTI003作 為一個實例示出。HOMl 同源重組序列(ntl04091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因 組DNA) ；Prrn-t 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙 草葉綠體基因組DNA)以及rbcL 5'翻譯調(diào)控區(qū)；IPT 來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶基因；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL 核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶聚 腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA 聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基
22因組DNA)。IPT. aadA盒被構(gòu)建成操縱子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6個堿 基對隔離物。圖 17 :pPTI003HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA:壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序 列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。IPT. aadA盒被構(gòu)建為操縱 子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6個堿基對隔離物。pPTI004HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基 因組DNA) ；IPT:來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA:壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重組序 列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。IPT. aadA盒表達為融合蛋 白。在IPT a基因之前有SD序列和6個堿基對隔離物并且兩個可讀框由8個甘氨酸接頭 序列隔開。圖18 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTAOOlHOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠 體基因組DNA) ；iaaH:來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿菌 的色氨酸單加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。iaaH. iaaM盒被構(gòu)建為操縱子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6個堿基對隔離物。圖19 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTA002HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； ftrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠 體基因組DNA) ；iaaH:來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿菌 的色氨酸單加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。iaaH. iaaM盒表達為融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6個堿基對隔離物并且兩個可讀 框由8個甘氨酸接頭序列隔開。圖20 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTA003HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；iaaH 來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿菌的色氨酸單加氧酶；Prrn:質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。iaaH. iaaM盒被構(gòu)建為操縱子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6個堿基對隔離物。圖21 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTA004HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)； TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄 號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；iaaH 來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿菌的色氨酸單加氧酶；Prrn:質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt 59034-59303，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。iaaH. iaaM盒表達為融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6個堿基對隔離物并且兩個可讀 框由8個甘氨酸接頭序列隔開。圖22 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTA005HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；PpsbA:質(zhì)體psbA啟動子；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；T7 :T7轉(zhuǎn)錄終止序 列；ftTn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt59034_59303，登錄號Z00044煙草葉 綠體基因組DNA) ；iaaH:來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿 菌的色氨酸單加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列 (ntl02539-102685,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成 序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。 iaaH. iaaM盒被構(gòu)建為操縱子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6個堿基對隔離 物。圖23 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTA006HOMl 同源重組序列(nt 104091-105380，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；PpsbA:質(zhì)體psbA啟動子；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；T7 :T7轉(zhuǎn)錄終止序 列；Prrn 質(zhì)體核糖體RNA(rrn)操縱子啟動子(nt59034_59303，登錄號Z00044煙草葉 綠體基因組DNA) ；iaaH:來自根瘤土壤桿菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 來自根瘤土壤桿 菌的色氨酸單加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列 (ntl02539-102685,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成 序列；H0M2 同源重組序列(nt 105381-106370,登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。 iaaH. iaaM盒表達為融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6個堿基對隔離物并且兩 個可讀框由8個甘氨酸接頭序列隔開。圖M 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTS4H0M4L 同源重組序列(nt 104065-102312，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；Prrn-rbcl-ds 質(zhì)體核糖體 RNA (rrn)操縱子啟動子(nt590;34-59303，登錄號 Z00044 煙草葉綠體基因組DNA)，rbcl是質(zhì)體rbcL基因的5' -UTR并且下游序列(ds)序列編 碼RbcL氨基酸1-14(Kuroda andMaliga(2001)) 0在葉綠體中，翻譯起始密碼子下游的序列是翻譯效率的重要決定子。(Plant Physiol, volume 125 (I)Page 431，圖1) ；IPT 來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL 核 酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登錄號Z00044 煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4R 同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。圖25 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTS5H0M4L 同源重組序列(nt 104065-102312，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；Prrn-atpB-ds 質(zhì)體核糖體 RNA(rrn)操縱子啟動子(nt590;34-59303，登錄號 Z00044 煙草葉綠體基因組DNA)，atpb是質(zhì)體atpb基因的5 ‘ -UTR并且下游序列(ds)序列編 碼AtpB氨基酸1-14 (Kuroda andMaliga(2001)) 在葉綠體中，翻譯起始密碼子下游的 序列是翻譯效率的重要決定子。(Plant Physiol, volume 125 (I)Page 431，圖1) ;IPT 來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA 壯觀霉素腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL 核 酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登錄號Z00044 煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4R :同源重組序列(nt 105381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。圖沈質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPTS6H0M4L 同源重組序列(nt 104065-102312，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組 DNA) ；Prrn-T7gl0 質(zhì)體核糖體 RNA(rrn)操縱子啟動子(nt590;34-59303，登錄號 Z00044 煙草葉綠體基因組DNA)，T7gl0是大腸桿菌噬菌體T7基因10的5' -UTR(Kuroda and Maliga(2001)Complementarityof the 16S rRNA penultimate stem with sequences downstream of the AUGdestabilizes the plastid mRNAs. Nucleic Acids Res.volume 29 (4)page 972，圖1) ；IPT :來自根瘤土壤桿菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；aadA :壯觀霉素 腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M4R 同源重組序列(ntl05381-106370，登錄號Z00044煙草葉綠體基因組DNA)。在以下實施例中進一步限定本發(fā)明，其中，除非另有說明，否則份數(shù)和百分比是按 重量計并且度是攝氏度。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例，雖然表明是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但僅 以舉例說明的方式給出。根據(jù)以上討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的 本質(zhì)特征，并且在沒有偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進行本發(fā)明的各種變化和 改進，以使它適于各種用途和條件。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)以上描述，除本文 示出和描述的那些改進之外，本發(fā)明的各種改進將是顯而易見的。這樣的改進也旨在落在 所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文提及的每個參考文獻的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。 實施例實施例1如在圖3和圖5中詳細描述的，在基因盒的任何一側(cè)，利用來自煙草的葉綠體基因 組的1289bp同源重組序列(104091-105380nt)和989bp同源重組序列(105381_106370nt) (Shinozaki K, Ohme Μ, Tanaka Μ, Wakasugi Τ, Hayashida N, Matsubayashi Τ, Zaita N,Chunwongse J,Obokata J,Yamaguchi-Shinozaki K,Ohto C,Torazawa K,Meng BY,Sugita Μ, Deno H, Kamogashira Τ, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H, Sugiura Μ. (1986)The complete nucleotide sequence of thetobacco chloroplast genome : its gene organization and expression. EMBO J. 5，2043—2049.)來構(gòu)建質(zhì)體轉(zhuǎn) 化載體pPTIOOl和ρΡΤΙ002。還已使用來自煙草葉綠體DNA的更短的同源重組序列(長度 為157和14;3bp)，其顯示質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的3倍增加。為了證明原理，將黃色熒光蛋白(YFP)報告基因克隆到pPTIOOl和pPTI002中以 生成pPTIOOl-YFP (圖3)和pPTI002-YFP(圖5)。如在附錄1中詳細描述的，然后將這些載 體轟擊到煙草葉子中。關(guān)于轉(zhuǎn)化實驗，使用了來自在溫室中生長的植物的葉子而不是在洋 紅盒中生長的植物的葉子，因為這可以增加轉(zhuǎn)化效率。用10%超級漂白滅菌劑(Coventry) 對葉子進行殺菌10分鐘并在無菌水中洗滌三次。然后切割葉子以適合用于轟擊的平板。按 照這些策略，轉(zhuǎn)化效率幾乎增加10倍。因為pPTIOOl和ρΡΤΙ002載體系列也在細菌中起作用，所以我們測試了 IPT基 因的CRE介導(dǎo)切除是否在大腸桿菌細胞中最終功能上導(dǎo)致YFP基因激活和YFP熒光。圖 1示出了表示系統(tǒng)的主要部分的示意圖。產(chǎn)生化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5 α細胞并用載體 PER10-TP. CRE(其組成型表達TP. CRE融合蛋白)轉(zhuǎn)化，然后用包含壯觀霉素的LB培養(yǎng) 基加以選擇。隨后產(chǎn)生包含PER10-TP.CRE載體的化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5ci細胞并用 pPTIOOl-YFP加以轉(zhuǎn)化。用包含壯觀霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基來選擇包含兩種載體的細 胞。將單集落接種到包含壯觀霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，并在用裝備有用于YFP熒光的 濾光器(激發(fā)器HQ500/20、發(fā)射器S5!35/30)和Hamamatsu Orca,ER 1394冷卻式CCD相機的 Nikon TE-2000U倒置式熒光顯微鏡分析YFP表達以前，生長至0. 4的0D600。利用Openlab 軟件(Improvision)來俘獲圖像。用質(zhì)粒DNA(其制備自大腸桿菌細胞)和引物TrbcL-F 和TpsbA-R(其跨越IPT盒區(qū))來進行IPT切除的PCR證實。圖2表明在添加CRE以前沒 有IPT基因的切除(圖2A和圖2E)，而在CRE添加以后，在分子水平，IPT基因被除去(圖 2E)，這導(dǎo)致YFP表達(圖2D)。實施例2對植物發(fā)育具有毒性作用的蛋白質(zhì)的表達由于毒性作用，在植物中高水平的外源蛋白的表達可以導(dǎo)致對植物發(fā)育的有害影 響。所描述的系統(tǒng)通過以下而克服了該問題將轉(zhuǎn)基因插入到質(zhì)體基因組中，其中它仍然是 休眠的直到通過CRE/lox介導(dǎo)的重組除去IPT選擇性標(biāo)記基因。將編碼“植物毒性”蛋白的轉(zhuǎn)基因插入到pPTIOOl載體系列的TrbcL和TspbA聚 腺苷酸加成序列之間或PPTI002載體系列的ftrn啟動子和TspbA聚腺苷酸加成序列之間 的pPTIOOl或ρΡΤΙ002載體之一中(圖3和圖5)，然后利用附錄1所示的協(xié)議將構(gòu)建物轉(zhuǎn) 化到質(zhì)體中，接著是細胞分裂素介導(dǎo)的選擇和再生。在再生以后，通過CRE介導(dǎo)的重組除去 IPT基因，然后激活毒性轉(zhuǎn)基因，從而導(dǎo)致對最初植物再生的最小的不利影響。在表達以后， 可以利用圖4和圖6所示的pPTIOOl或ρΡΤΙ002載體系列中存在的親和標(biāo)記物之一來純化 重組蛋白。實施例3在質(zhì)體中具有作用的蛋白質(zhì)的表達
質(zhì)體在植物發(fā)育期間具有不可或缺的作用，因此其對在質(zhì)體內(nèi)表達蛋白(植物或 非植物)有利，其將對植物生長、發(fā)育具有積極作用和/或賦予作為整體的植物改進的特 性。由于在質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因的高表達水平關(guān)聯(lián)于以下事實作為選擇性標(biāo)記基因的IPT并不 導(dǎo)致自發(fā)核糖體突變體的產(chǎn)生(正如常見的壯觀霉素選擇性標(biāo)記基因)，所以本發(fā)明代表 用于該用途的理想系統(tǒng)。將轉(zhuǎn)基因插入到pPTIOOl載體系列的TrbcL和TspbA聚腺苷酸加成序列之間或 PPTI002載體系列的ftrn啟動子和TspbA聚腺苷酸加成序列之間的pPTIOOl或pPTI002載 體之一中(圖3和圖幻，然后利用附錄1所示的協(xié)議將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到質(zhì)體中，接著是細胞分 裂素介導(dǎo)的選擇和再生。在再生以后，通過CRE介導(dǎo)的重組除去IPT基因，并激活轉(zhuǎn)基因， 從而導(dǎo)致對最初植物再生的最小的不利影響。實施例4真核生物蛋白的高水平表達由于不溶性和/或缺乏翻譯后修飾，經(jīng)常存在與真核生物蛋白在細菌系統(tǒng)中的表 達有關(guān)的問題。類似地，真核生物蛋白在哺乳動物細胞中的表達是昂貴和費力的。利用IPT 標(biāo)記基因選擇和轉(zhuǎn)基因激活，本系統(tǒng)可以用于在質(zhì)體中表達真核生物蛋白。如在實施例2和3中所描述的，可以將編碼真核生物蛋白的任何基因插入到一種 或所有的pPTIOOl系列或ΡΡΤΙ002系列載體中，接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。在 再生以后，可以利用圖4和圖6所示的親和標(biāo)記物來純化表達的蛋白并用于下游應(yīng)用。將被表達的可能的真核生物蛋白家族的非排它性清單包括抗體、酶、酶抑制劑以 及設(shè)計肽。實施例5原核蛋白的高水平表達由于質(zhì)體的內(nèi)共生起源，所以可以在質(zhì)體中表達原核蛋白。如在實施例2和3中 所描述的，可以將編碼原核蛋白的任何基因插入到一種或所有的pPTIOOl系列或PPTI002 系列載體中，接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。在再生以后，可以利用圖4和圖6所示 的親和標(biāo)記物來純化表達的蛋白并用于下游應(yīng)用。實施例6來自相同啟動子的多種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達由于質(zhì)體的內(nèi)共生起源，所以可以在質(zhì)體中表達操縱子樣基因結(jié)構(gòu)。這意味著在 單啟動子的調(diào)節(jié)下多種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)和同時表達。如在實施例2和3中所描述的，可以將編 碼原核和真核生物起源(或混合起源)的蛋白質(zhì)的多種基因插入到一種或所有的PPTIOOl 系列或ρΡΤΙ002系列載體中，接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。實施例7在煙草的質(zhì)體中來自pPTIOOl/YFP的YFP的表達將pPTI001/YFP載體轟擊到煙草葉細胞中，然后用僅包含植物生長素的培養(yǎng)基和 用缺乏所有激素的培養(yǎng)基來選擇再生物。獲得再生物(圖8)并轉(zhuǎn)移到包含植物生長素的 二次選擇培養(yǎng)基中，以在轉(zhuǎn)移到土壤以前誘導(dǎo)根形成。通過PCR并利用載體特異性引物和 在煙草葉綠體基因組的旁側(cè)區(qū)中的引物來證實在煙草質(zhì)體基因組中加入有轉(zhuǎn)化盒(圖9)。 用pER10/TP. CRE，表達TP. CRE融合的雙載體，浸潤來自再生植物的葉子，接著誘導(dǎo)。在72小時以后，通過熒光顯微鏡分析了浸潤組織(滲入組織)。揭示了包含GFP發(fā)熒光葉綠體的 細胞(圖10)。實施例8另外和新的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體為了優(yōu)化選擇和再生系統(tǒng)，已進一步構(gòu)建了新系列的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體。已進行了以 下修飾和添加1)除IPT基因以外還包含aadA基因，用于雙重選擇目的。2)包含新的同源重組位點(H0M3和H0M4)，其可以增加更加有效的同源重組和轉(zhuǎn) 基因插入。3)包含IPTG可誘導(dǎo)啟動子。4)包含修飾ftrri啟動子以用于更高的表達水平。載體的詳情示于圖11-16中。所有例證的載體包含IPT選擇性標(biāo)記基因。實施例9使用植物生長素生物合成作為用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記如在圖18-21中詳細示出的，在基因盒任何一側(cè)利用來自煙草的葉綠體基因組 的 1289bp 同源重組序列(104091-105380nt)和 989bp 同源重組序列(105381_106370nt) (Shinozaki K, Ohme Μ, Tanaka Μ, Wakasugi Τ, Hayashida N, Matsubayashi Τ, Zaita N, Chunwongse J,Obokata J,Yamaguchi-Shinozaki K,Ohto C,Torazawa K,Meng BY,Sugita Μ, Deno H, Kamogashira Τ, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H, Sugiura Μ. (1986)The complete nucleotide sequence of thetobacco chloroplast genome : its gene organization and expression. EMBO J. 5，2043—2049.)來構(gòu)建質(zhì)體轉(zhuǎn) 化載體pPTA001-pPTA004。還可以使用更短或更長的同源重組序列以確保適當(dāng)?shù)耐粗亟M 事件。如在附錄3中詳細描述的，將這些載體轟擊到煙草葉子中。關(guān)于轉(zhuǎn)化實驗，使用了 在洋紅盒中生長的植物的有效生長的嫩葉。實施例10 對植物發(fā)育具有毒性作用的蛋白的表達由于毒性作用，在植物中高水平外源蛋白的表達可以導(dǎo)致對植物發(fā)育的不利影 響。所描述的系統(tǒng)通過組合以下可以克服該問題將轉(zhuǎn)基因插入到質(zhì)體基因組中，其中它仍 然是休眠的，直到通過CRE/lox介導(dǎo)的重組除去植物生長素選擇性標(biāo)記基因。將編碼“植物毒性”蛋白的轉(zhuǎn)基因插入到ftrn啟動子和TpsbA聚腺苷酸加成序列 之間的pPTA001-pPTA004載體之一中(圖18-21)，然后利用附錄3所示的協(xié)議將構(gòu)建物轉(zhuǎn) 化到質(zhì)體中，接著是植物生長素介導(dǎo)的選擇和再生。在再生以后，通過CRE介導(dǎo)的重組除去 植物生長素基因并激活毒性轉(zhuǎn)基因，從而導(dǎo)致對最初植物再生的最小的不利影響。在表達 以后，使用賦予期望性狀的葉綠體轉(zhuǎn)基因植物或純化重組蛋白。實施例11在質(zhì)體中具有作用的蛋白的表達質(zhì)體在植物發(fā)育期間具有不可或缺的作用，因此對在質(zhì)體內(nèi)表達蛋白(植物或非 植物)是有利的，其將對植物生長、發(fā)育具有積極作用和/或賦予作為整體的植物改進的特
28性。由于在質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因的高表達水平關(guān)聯(lián)于以下事實作為選擇性標(biāo)記基因的iaaH和 iaaM并不導(dǎo)致白發(fā)核糖體突變體的產(chǎn)生(正如常見的壯觀霉素選擇性標(biāo)記基因)，所以本 發(fā)明代表用于該用途的理想系統(tǒng)。將編碼質(zhì)體蛋白的轉(zhuǎn)基因插入到ftrn啟動子和TrbcL聚腺苷酸加成序列之間的 pPTA001-pPTA004載體之一中(圖18-21)，然后利用附錄3中所示的協(xié)議將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到 質(zhì)體中，接著是植物生長素介導(dǎo)的選擇和再生。在再生以后，通過CRE介導(dǎo)的重組除去iaaH 和iaaM基因并激活轉(zhuǎn)基因，從而導(dǎo)致對最初植物再生的最小的不利影響。實施例12真核生物蛋白的高水平表達由于不溶性和/或缺乏翻譯后修飾，經(jīng)常存在與真核生物蛋白在細菌系統(tǒng)中的表 達有關(guān)的問題。類似地，真核生物蛋白在哺乳動物細胞中的表達是昂貴和費力的。利用iaaH 和iaaM標(biāo)記基因選擇和轉(zhuǎn)基因激活，本系統(tǒng)可以用于在質(zhì)體中表達真核生物蛋白。如在實施例10和11中所描述的，可以將編碼真核生物蛋白的任何基因插入到一 種或所有pPTA001-pPTA004系列載體中，接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。在再生以 后，可以純化表達的蛋白并用于下游應(yīng)用。將被表達的可能的真核生物蛋白家族的非排它清單包括抗體、酶、酶抑制劑以及 設(shè)計肽。實施例13原核蛋白的高水平表達由于質(zhì)體的內(nèi)共生起源，所以可以在質(zhì)體中表達原核蛋白。如在實施例10和11中 所描述的，可以將編碼原核蛋白的任何基因插入到一種或所有的ppTA001-pTA004載體中， 接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。在再生以后，可以純化表達的蛋白并用于下游應(yīng)用。實施例14來自相同啟動子的多種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達由于質(zhì)體的內(nèi)共生起源，所以可以在質(zhì)體中表達操縱子樣基因結(jié)構(gòu)。這意味著 在單啟動子的調(diào)節(jié)下多種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)和同時表達。如在實施例10和11中所描述的， 可以將編碼原核和真核生物起源(或混合起源)的蛋白的多種基因插入到一種或所有 pPTA001-pPTA004載體中，接著是轉(zhuǎn)化、選擇和再生(如前所述)。實施例15另外和新的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體為了優(yōu)化選擇和再生系統(tǒng)，進一步構(gòu)建了新系列的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體。進行了以下修 飾和添加1)除iaaH和iaaM基因以外還包含aadA基因，用于雙重選擇(圖22_23，pPTA005 和 pPTA006)。2)包含具有不同長度和組成的新的同源重組位點，其可以增加同源重組和轉(zhuǎn)基因 插入的效率。3)包含用來驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達的各種可誘導(dǎo)啟動子。4)包含修飾的ftrri啟動子，以獲得更高的表達水平。在圖M-26中給出了本發(fā)明的其它優(yōu)選構(gòu)建物。
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附錄1利用細胞分裂素選擇的葉綠體轉(zhuǎn)化的協(xié)議時間過程標(biāo)準(zhǔn)程序在3-5個月內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物。 轟擊第一嫩芽3-8周·同種植物的傳代培養(yǎng)生產(chǎn)3-4周·在分析以前，在土壤中生長1-2周設(shè)備設(shè)置氦槍Biorad PDS 1000 破裂盤 PSI :1100 破裂盤鎖定蓋(retaining cap)和蓋子上的大載體(宏觀載體，macrocarrier) 之間的間隙1/4〃·在停止屏支座下方的間隔環(huán)2·大載體送出組件的水平1 (從頂部)·培養(yǎng)皿(陪替氏培養(yǎng)皿)固定架的水平4(從頂部) 真空流入率最大·真空釋放率減弱釋放，使得其接近真空流入的速度。原液(儲備溶液)· 2. 5M CaCl2高壓滅菌器或過濾消毒· IM亞精胺游離堿，在滅菌H2O中· dH20· DNA, 1 μ g/ μ 1，在 dH20 或 IX TE 中· 100% 乙醇·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盤 停止屏·大載體·金顆粒DNA-金顆?；旌衔锏闹苽洹?0mg的金顆粒懸浮在Iml的無水乙醇中作為儲備懸浮液?！と?. 25ml的金儲備懸浮液并微離心5秒。除去乙醇并用無菌蒸餾水洗滌3次， 在洗滌之間微離心3分鐘。·將金再懸浮在0. 25ml dH20中。 將50 μ 1等分部分的金-H2O懸浮液加入到埃彭道夫管中?！ぴ诿總€埃彭道夫管中連續(xù)添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2· 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亞精胺游離堿 以最高速度渦旋5分鐘。
·在每個管中添加200 μ 1的無水乙醇?！ぴ陔x心機中以3000rpm旋轉(zhuǎn)2秒。 除去盡可能多的上清液并在無水乙醇中沖洗沉淀物一次，然后以3000rpm離心2秒。 將沉淀物再懸浮在30 μ 1無水乙醇中(制備4-5個彈丸)。在冰上儲存混合物。制備基因槍和消耗品·用70%乙醇或70%異丙醇對槍真空室和表面進行滅菌。·在70%乙醇中滅菌破裂盤和大載體固定架10分鐘。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干?！⒋筝d體浸泡在無水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。 打開氦氣罐。將氦氣罐調(diào)節(jié)器設(shè)定為1300psi (或高于破裂盤的額定值200psi)。轟擊·將大載體急射到它們的固定架中。 將5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大載體的中心上?；旌衔飸?yīng)均勻擴散開并且?guī)?乎沒有塊。·將破裂盤置于定位環(huán)中并將環(huán)擰緊至氦桶?！⑼Ｖ蛊梁蛶в薪?DNA的大載體(在固定架中)置于鎖定組件中并擰緊。·將組件置于真空室，水平1 (首先從頂部)。 放置樣品，水平4。除去培養(yǎng)皿蓋?！そ油ㄕ婵毡?。·抽真空至 27-29 in. Hg?！ぐ醋〔⒈３稚鋼舭粹o直到破裂盤破裂。 釋放真空并除去樣品?！こテ屏驯P、大載體以及停止屏。 如果需要的話，重復(fù)?！ぴ趯嶒灲Y(jié)束時，關(guān)閉氦氣罐。在槍中抽真空并通過槍釋放剩余的氦，然后關(guān)閉氦 調(diào)節(jié)器。成功轟擊的關(guān)鍵通常在于顆粒在大載體上的擴散。乙醇/金/DNA混合物應(yīng)快速 擴散越過大載體的中心。所得的擴散應(yīng)是顆粒的很細的涂粉，其均勻擴散并且?guī)缀醪话?塊。塊會引起增加的細胞死亡。每30 μ 1金-DNA混合物給出4或5次轟擊。剩余的混合物通常太稠密以致不可 能獲得良好的結(jié)果。煙草制備和再生培養(yǎng)基MS =MS鹽和維生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝膠pH 5. 8高壓滅菌器RMOP =MS 鹽(IX)lmg/1 BAP0. lmg/1 NAA
100mg/l 肌醇30g/l 蔗糖6g/l植物凝膠pH 5. 8高壓滅菌器RMOP-BAPpH 5. 8高壓滅菌器MS+MS 培養(yǎng)基lmg/1 IBA (吲哚-3-丁酸)2μΜ 17-β-雌二醇pH 5. 8高壓滅菌器組織培養(yǎng)·在包含MS培養(yǎng)基的洋紅盒中利用無菌技術(shù)來微增殖煙草植物。·切除展開的葉并將背軸面置于位于RMOP培養(yǎng)基頂部的Whatman濾紙上。在轟 擊濾紙以前，允許稍微干燥(1-2小時)葉子。每次轟擊可以處理1-3片葉子，其覆蓋大約 9cm培養(yǎng)皿的1/3。·轟擊以后，密封平板并將葉子置于下的12:12光周期下2天?！ぴ趦商煲院?，將葉子切割成大約5mm2的部分并背軸面朝下地置于缺乏BAP的 RMOP培養(yǎng)基上?！ぞG色嫩芽可以收集自3-8周的漂白外植體?！で懈顏碜赃@些嫩芽的葉子Omm2)并在相同選擇性培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)大約4周。 通常收集4個嫩芽/最初傳代培養(yǎng)的嫩芽。這些嫩芽生根在包含MS培養(yǎng)基+Img/ 1 IBA禾口 2μ M 17-β-雌二醇的管中?！ぴ诜蛛x后大約3-5周，將生根的嫩芽轉(zhuǎn)移到土壤中。使植物在標(biāo)準(zhǔn)煙草條件 (16:8光周期，25°C )下生長。附注1.為了轟擊，煙草葉子并不必須完全放平。2.在濾紙上2天以后煙草葉子將失去它們的膨脹。這是可行的。3.進行最少量的轉(zhuǎn)移。需要完成的最大量的轉(zhuǎn)移a.從在MS中生長的植物切除葉子。將葉子置于RMOP上的濾紙上。b.轟擊以后2天，將葉外植體置于RMOP-BAP上。c. 3-8周以后，從綠色嫩芽除去葉子，切割，然后轉(zhuǎn)移到RM0P-BAP。d.收集4個嫩芽，轉(zhuǎn)移到在個別管中的MS+lmg/1 ΙΒΑ+2 μ M 17-β-雌二醇中。平均實驗的轉(zhuǎn)化頻率是1. 5株穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物至0. 3株穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物/轟擊。用于煙草葉綠體轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基名稱 組成容器 時間4MSSMS鹽和維生素 洋紅盒(IX)30g/l 蔗糖
6g/l植物凝膠
pH 5. 8
高壓滅菌器
MFB1MS鹽(IX) 培養(yǎng)皿(9cm) 2天
lmg/1 BAP
0.lmg/1 NAA
lmg/1硫胺素
100mg/l 肌醇
30g/l蔗糖
6g/l植物凝膠
pH 5. 8
高壓滅菌器
MTS2MFB減去BAP 深培養(yǎng)皿 3-10周5
MFR3MSS 洋紅盒 3-5周
lmg/1 IBA (吲
哚-3- 丁酸)
2μΜ 17-β-雌二
醇
附注1.MFB 用于轟擊的培養(yǎng)基
2. MTS 用于轉(zhuǎn)基因選擇的培養(yǎng)基
3. MFR:用于生根的培養(yǎng)基
4.時間煙草葉子留在培養(yǎng)基中的時間
5.該時間包括第二選擇時間
附錄2
利用細胞分裂素和抗生素選擇的用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的協(xié)議以及設(shè)備設(shè)
氦槍 Biorad PDS 1000
破裂盤PSI 1100
在破裂盤鎖定蓋和蓋子上的大載體之間的間隙1/4"
在停止屏支座下方的間隔環(huán)2
大載體送出組件的水平1 (從頂部)
培養(yǎng)皿固定架的水平4(從頂部)
真空流入率最大
真空釋放率減弱釋放，使得它接近真空流入的速度。
原液
2. 5MCaCl2高壓滅菌器或過濾消毒
在滅菌H2O中的IM亞精胺游離堿
dH20
在 dH20 或 IX TE 中的 1 μ g/ul 的 DNA
100%乙醇
·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盤 停止屏·大載體·金顆粒DNA-金顆?；旌衔锏闹苽洹?0mg的金顆粒懸浮在Iml的無水乙醇中作為儲備懸浮液。 取0. 25ml的金儲備懸浮液并微離心5秒。除去乙醇并用無菌蒸餾H2O洗滌3次， 在洗滌之間微離心3分鐘?！⒔鹪賾腋≡?. 25ml dH20中。 將50 μ 1等分部分的金-H2O懸浮液加入到埃彭道夫管中?！ぴ诿總€埃彭道夫管中連續(xù)添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2. 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亞精胺游離堿 以最高速度渦旋5分鐘?！は蛎總€管中添加200 μ 1無水乙醇?！ぴ陔x心機以3000rpm旋轉(zhuǎn)2秒?！こケM可能多的上清液并在無水乙醇中沖洗沉淀物一次，在3000rpm下離心2秒。 將沉淀物再懸浮在30 μ 1無水乙醇中(制備4-5個彈丸)。在冰上儲存混合物。制備基因槍和消耗品·用70%乙醇或70%異丙醇對槍真空室和表面進行滅菌。·在70%乙醇中滅菌破裂盤和大載體固定架10分鐘。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干?！⒋筝d體浸泡在無水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。 打開氦氣罐。將氦氣罐調(diào)節(jié)器設(shè)置為1300psi(或在破裂盤的額定值以上 200psi)。轟擊·將大載體急射到它們的固定架中。
將5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大載體的中心上?；旌衔飸?yīng)均勻擴散開并且?guī)?乎沒有塊?！⑵屏驯P置于定位環(huán)中并擰緊到氦桶?！⑼Ｖ蛊梁蛶в薪?DNA的大載體(在固定架中)置于鎖定組件中并擰緊?！⒔M件置于真空室中，水平1 (首先從頂部)。 將樣品置于水平4。除去培養(yǎng)皿蓋?！そ油ㄕ婵毡谩！こ檎婵罩?27_29in. Hg。·按住并保持射擊按鈕直到破裂盤破裂。
釋放真空并除去樣品?！こテ屏驯P、大載體以及停止屏。 如果需要的話，重復(fù)。·在實驗結(jié)束時，關(guān)閉氦氣罐。在槍中抽真空并通過槍釋放剩余的氦，然后關(guān)閉氦 調(diào)節(jié)器。附注1.成功轟擊的關(guān)鍵通常在于顆粒在大載體上的擴散。乙醇/金/DNA混合物應(yīng)快 速擴散越過大載體的中心。所得的擴散應(yīng)是顆粒的很細的涂粉，其均勻擴散并且?guī)缀醪话?含塊。并且塊會引起細胞死亡。2.每30 μ 1金-DNA混合物給出4或5次轟擊。剩余的混合物通常太稠密以致不 可能獲得良好的結(jié)果。煙草制備和再生培養(yǎng)基MS =MS鹽和維生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝膠pH 5. 8高壓滅菌器RMOP =MS 鹽(IX)lmg/1 BAP0. lmg/1 NAAlmg/1 硫胺素1 OOmg/1 肌醇30g/l 蔗糖6g/l植物凝膠pH 5. 8高壓滅菌器RMOP-BAP+ 壯觀霉素500 μ g/ml 壯觀霉素pH 5. 8高壓滅菌器MS+ MS 培養(yǎng)基lmg/1 IBA (吲哚-3-丁酸)2μΜ 17-β-雌二醇pH 5. 8高壓滅菌器組織培養(yǎng)·在包含MS培養(yǎng)基的洋紅盒中利用無菌技術(shù)來微增殖煙草植物?！で谐归_的葉并將背軸面置于位于RMOP培養(yǎng)基頂部的Whatman濾紙上。在轟
擊濾紙以前，允許稍微干燥(1-2小時)葉子。每次轟擊可以處理1-3片葉子，其覆蓋大約 9cm培養(yǎng)皿的1/3?！まZ擊以后，密封平板并將葉子置于下的12:12光周期2天。·在兩天以后，將葉子切割成大約5mm2的部分并背軸面朝下地置于缺乏BAP但包 含壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基上。
·綠色嫩芽可以收集自3-8周的漂白外植體?！で懈顏碜赃@些嫩芽的葉子Omm2)并在相同選擇性培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)大約4周。 通常收集4個嫩芽/最初傳代培養(yǎng)的嫩芽。這些嫩芽生根在包含MS培養(yǎng)基+Img/ 1 IBA禾口 2μ M 17-β-雌二醇的管中?！ぴ诜蛛x后大約3-5周，將生根的嫩芽轉(zhuǎn)移到土壤中。使植物在標(biāo)準(zhǔn)煙草條件 (16:8光周期，25°C )下生長。

附注
為了轟擊，煙草葉子并不必須完全放平。
在濾紙上2天以后煙草葉子將失去它們的膨脹。這是可行的。
進行最少量的轉(zhuǎn)移。需要完成的最大量的轉(zhuǎn)移
從在MS中生長的植物切除葉子。將葉子置于RMOP上的濾紙上。
轟擊以后2天，將葉外植體置于RMOP-BAP+壯觀霉素上。
3-8周以后，從綠色嫩芽除去葉子，切割，然后轉(zhuǎn)移到RMOP-BAP+壯觀霉素。
收集4個嫩芽，轉(zhuǎn)移到在個別管中的MS+lmg/1 ΙΒΑ+2 μ Μ17- β -雌二醇中。
平均實驗的轉(zhuǎn)化頻率為1. 5株穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物至0. 3株穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物/轟擊。
用于煙草葉綠體轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基
名稱 MSS
MFB1
MTS'MFR3


組成
MS鹽和維生素 (IX)
30g/l蔗糖 6g/l植物凝膠 pH 5. 8 高壓滅菌器 MS 鹽(IX) lmg/1 BAP 0. lmg/1 NAA lmg/1硫胺素 100mg/l 肌醇 30g/l蔗糖 6g/l植物凝膠 pH 5. 8 高壓滅菌器 MFB減去BAP +壯觀霉素 MSS
lmg/1 IBA (吲 哚-3- 丁酸) 2μΜ 17-β-雌:
容器 洋紅盒
時間4
培養(yǎng)皿(9cm) 2天
深培養(yǎng)皿 3-10周
洋紅盒
3-5周
36
附注1. MFB 用于轟擊的培養(yǎng)基2. MTS 用于轉(zhuǎn)基因選擇的培養(yǎng)基3. MFR 用于生根的培養(yǎng)基4.時間煙草葉子留在培養(yǎng)基中的時間5.該時間包括第二選擇時間附錄3利用植物生長素選擇的用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的協(xié)議設(shè)備設(shè)置氦槍Biorad PDS 1000 破裂盤 PSI :1100·破裂盤鎖定蓋和蓋子上的大載體之間的間隙1/4〃·在停止屏支座下方的間隔環(huán)2·大載體送出組件的水平1 (從頂部)·培養(yǎng)皿固定架的水平4(從頂部)·真空流入率最大·真空釋放率減弱釋放，使得它接近真空流入的速度。原液· 2. 5M CaCl2高壓滅菌器或過濾消毒·在滅菌H2O中的IM亞精胺游離堿· dH20·在 dH20 或 IX TE 中的 1 μ g/ul 的 DNA· 100% 乙醇·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盤·停止屏·大載體·金顆粒DNA-金顆?；旌衔锏闹苽洹?0mg的金顆粒懸浮在Iml的無水乙醇中作為儲備懸浮液。 取0. 25ml的金儲備懸浮液并微離心5秒。除去乙醇并用無菌蒸餾H2O洗滌3次， 在洗滌之間微離心3分鐘?！⒔鹪賾腋≡?. 25ml dH20中。 將50 μ 1等分部分的金-H2O懸浮液加入到埃彭道夫管中?！ぴ诿總€埃彭道夫管中連續(xù)添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2. 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亞精胺游離堿 以最高速度渦旋5分鐘。
·向每個管中添加200 μ 1的無水乙醇。·在離心機以3000rpm旋轉(zhuǎn)2秒。 除去盡可能多的上清液并在無水乙醇中沖洗沉淀物一次，在3000rpm下微離心2秒。 將沉淀物再懸浮在30 μ 1無水乙醇中(制備4-5個彈丸)。在冰上儲存混合物。制備基因槍和消耗品·用70%乙醇或70%異丙醇對槍真空室和表面進行滅菌?！ぴ?0%乙醇中滅菌破裂盤和大載體固定架10分鐘。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干?！⒋筝d體浸泡在無水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。 打開氦氣罐。將氦氣罐調(diào)節(jié)器設(shè)置為1300psi(或在破裂盤的額定值以上 200psi)。轟擊·將大載體急射到它們的固定架中。 將5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大載體的中心上?；旌衔飸?yīng)均勻擴散開并且?guī)?乎沒有塊?！⑵屏驯P置于定位環(huán)中并擰緊到氦桶?！⑼Ｖ蛊梁蛶в薪?DNA的大載體(在固定架中)置于鎖定組件中并擰緊?！⒔M件置于真空室中，水平1 (首先從頂部)。 將樣品置于水平4。除去培養(yǎng)皿蓋?！そ油ㄕ婵毡??！こ檎婵罩?27_29in. Hg?！ぐ醋〔⒈３稚鋼舭粹o直到破裂盤破裂。 釋放真空并除去樣品。·除去破裂盤、大載體以及停止屏。 如果需要的話，重復(fù)?！ぴ趯嶒灲Y(jié)束時，關(guān)閉氦氣罐。在槍中抽真空并通過槍釋放剩余的氦，然后關(guān)閉氦 調(diào)節(jié)器。附注1.成功轟擊的關(guān)鍵通常在于顆粒在大載體上的擴散。乙醇/金/DNA混合物應(yīng)快 速擴散越過大載體的中心。所得的擴散應(yīng)是顆粒的很細的涂粉，其均勻擴散并且?guī)缀醪话?含塊。并且塊會引起細胞死亡。2.每30 μ 1金-DNA混合物給出4或5次轟擊。剩余的混合物通常太稠密以致不 可能獲得良好的結(jié)果。煙草制備和再生培養(yǎng)基MS =MS鹽和維生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝膠pH 5. 8高壓滅菌器RMOP =MS 鹽(IX)0685]
0686]
權(quán)利要求
1. 一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，所述方法包括以下步驟 (i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述植物細胞，其中，所述基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件， 其中，所述第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化盒整合到存在于所述植物細胞 中的至少一種質(zhì)體的基因組中， 其中，所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c)一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件， (b2)可選的第二啟動子，(b3)編碼植物激素生物合成多肽IPT (異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶) 以及iaaM(色氨酸單加氧酶)的一個或多個核苷酸序列， (b4)第二終止元件， (b5)第二位點特異性重組元件，其中，所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別。
2.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，所述方法包括以下步驟 (i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述植物細胞，其中，所述基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件， 其中，所述第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化盒整合到存在于所述植物細胞 中的至少一種質(zhì)體的基因組中， 其中所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c)一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件， (b2)可選的第二啟動子，(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中，所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述方法另外包括以下步驟 ( )用缺乏一種或多種所述植物激素生物合成多肽的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化植物細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述方法另外包括以下步驟 (iii)在所述植物細胞中表達重組酶，其中所述重組酶是識別所述第一和第二位點特異性重組元件的重組酶。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和第二位點特異性重組元 件是Iox位點。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述重組酶是Cre重組酶。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物激素生物合成多肽是涉及 植物細胞分裂素或植物生長素或其它植物生長調(diào)節(jié)劑的合成、或調(diào)節(jié)植物細胞分裂素或植 物生長素或其它植物生長調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)或代謝的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述植物激素生物合成多肽選自IPT(異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)以及iaaM (色氨酸單加氧酶)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述一種或多種轉(zhuǎn)基因中的至少一 種編碼抗體、抗生素、除草劑、疫苗抗原、酶、酶抑制劑或設(shè)計肽。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，選擇所述同源重組元件的核苷酸序 列，使得所述轉(zhuǎn)化盒特異性地靶向一種或多種所選的質(zhì)體。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，選擇所述同源重組元件的核苷酸序 列，使得沒有或基本上沒有轉(zhuǎn)化盒被整合到所述植物的核基因組中。
12.根據(jù)權(quán)利要求4至11中任一項所述的方法，其中，步驟(iii)包括從可操作性連 接至核苷酸序列的可誘導(dǎo)啟動子誘導(dǎo)所述植物細胞中重組酶的表達，所述核苷酸序列編碼 存在于所述植物細胞中的重組酶，其中所述重組酶識別所述第一和第二位點特異性重組元 件。
13.根據(jù)權(quán)利要求4至11中任一項所述的方法，其中，步驟(iii)包括在步驟(i) 以前、與步驟⑴同時或在步驟⑴以后；或在步驟(ii)以前、與步驟(ii)同時或在步驟 ( )以后，用重組酶載體轉(zhuǎn)化所述植物細胞，其中所述重組酶載體包括可操作性連接至編 碼重組酶的核苷酸序列的啟動子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述重組酶載體包括可操作性連接至核苷酸 序列的啟動子，其中所述核苷酸序列編碼靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽和重組酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述靶向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運肽是能夠?qū)⑺鲋亟M酶 靶向葉綠體的轉(zhuǎn)運肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法，其中，所述啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述編碼植物激素生物合成多肽的 核苷酸序列和所述第二終止元件在所述第一啟動子的下游，其中所述第一啟動子能夠驅(qū)動 所述植物激素生物合成多肽的表達。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別；(C) 一種或多種轉(zhuǎn)基因， (d)第一終止元件，在5’ -3’方向上以上面規(guī)定的次序可操作性地進行連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中，與所述第一啟動子、轉(zhuǎn)基因以及 第一終止元件相比，所述切除盒處于反方向，并且所述切除盒包括第二啟動子，所述第二啟 動子能夠驅(qū)動編碼所述植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的表達。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c)一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件，其中(a)、(b)、(c)以及(d)在5’ -3’方向上以上面規(guī)定的次序可操作性地進行連接，其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件，(b2)第二啟動子，(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別，并且 其中可操作性連接所述切除盒的部分(bl)-(b5)，并且 其中，與(a)、(c)以及(d)相比，所述切除盒處于反方向。
21.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，所述方法包括以下步驟 (i)用基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述植物細胞，其中所述基因構(gòu)建物包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件， 其中所述第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化盒整合到存在于所述植物細胞 中的至少一種質(zhì)體的基因組中， 其中所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在所述植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c)一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件， (b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，其中所述多肽 之一是IPT，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別，并且其中所述第一和第二位點特異性重組元件是Iox元件而所述重組酶是ere。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，另外包括以下步驟(ii)用缺乏IPT的培養(yǎng)基選擇 轉(zhuǎn)化植物細胞；以及(iii)在所述植物細胞中以導(dǎo)致從所述質(zhì)體基因組切除所述切除盒的 水平表達Cre重組酶。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)化盒另外包括編碼賦予對抗 生素抗性的多肽的核苷酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述抗生素是壯觀霉素。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物選自由谷類(水稻、小麥、 大麥、燕麥、高粱、玉米)、豆科作物(苜蓿、扁豆、花生、豌豆、大豆)、油料作物(棕櫚、向日 葵、椰子、油菜、橄欖)、經(jīng)濟作物(棉花、甘蔗、木薯)、蔬菜作物(馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、甘 薯、甜菜、南瓜、黃瓜、萵苣、椰菜、花椰菜、食莢菜豆、卷心菜、芹菜、洋蔥、大蒜)、水果/樹木 和堅果(香蕉、葡萄哈密瓜、香瓜、西瓜、草莓、橘子、蘋果、芒果、鱷梨、桃、葡萄柚、菠蘿、楓、 杏仁)、飲料(咖啡、茶、可可粉)、木材樹(櫟樹、黑胡桃、懸鈴木)、蘚類以及浮萍組成的組。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物是煙草或萵苣。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物細胞是個體細胞、細胞群、 以分離形式或未分離形式，作為植物組織或植物部分的一部分，或原生質(zhì)體或植物液體培 養(yǎng)物。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述植物細胞存在于植物葉片中。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述質(zhì)體選自葉綠體、白色體、造粉 體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、油質(zhì)體以及老年質(zhì)體。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述質(zhì)體是綠色質(zhì)體。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述質(zhì)體是葉綠體。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和/或第二啟動子是 PsbA, RbcL 或 Prrn 啟動子。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和/或第二終止子是rrn、 psbA、rbcL或T7終止子。
35.一種用于產(chǎn)生植物的方法，包括通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法產(chǎn)生 植物細胞，并且由所述植物細胞再生植物。
36.一種通過根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得或可獲得的轉(zhuǎn)化植物細胞。
37.一種通過根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法獲得或可獲得的植物。
38.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方法，包括根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，以 及另外包括以下步驟純化或分離所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，以及可選地包裝所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
39.一種通過根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法獲得或可獲得的純化或分離的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求39所述的純化或分離的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品， 其中，所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是抗體、抗生素、除草劑、疫苗抗原、酶、酶抑制劑或設(shè)計肽。
41.一種基因構(gòu)建物，包括旁側(cè)轉(zhuǎn)化盒的第一和第二同源重組元件，其中，所述第一和第二同源重組元件能夠引導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化盒整合到存在于植物細胞中的 至少一種質(zhì)體的基因組中， 其中所述轉(zhuǎn)化盒包括(a)在植物細胞中可操作的第一啟動子，(b)切除盒，(c)一種或多種轉(zhuǎn)基因，(d)第一終止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位點特異性重組元件， (b2)可選的第二啟動子(b3)編碼一種或多種植物激素生物合成多肽的一個或多個核苷酸序列，(b4)第二終止元件，(b5)第二位點特異性重組元件，其中所述第一和第二位點特異性重組元件能夠由重組酶識別。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的基因構(gòu)建物，其中，所述第一和第二位點特異性重組元件 是Iox位點。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或權(quán)利要求42所述的基因構(gòu)建物，其中，所述重組酶是Cre重組酶。
44.根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項所述的基因構(gòu)建物，其中，所述植物激素生物合成 多肽是涉及植物細胞因子或植物生長素或其它植物生長調(diào)節(jié)劑的合成、或調(diào)節(jié)植物細胞因 子或植物生長素或其它植物生長調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)或代謝的多肽。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的基因構(gòu)建物，其中，所述植物激素生物合成多肽選自 IPT (異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)以及iaaM (色氨酸單加氧酶)。
46.根據(jù)權(quán)利要求41至45中任一項所述的基因構(gòu)建物，其中，選擇所述同源重組元件 的核苷酸序列，使得所述轉(zhuǎn)化盒特異性地靶向一種或多種所選的質(zhì)體。
47.根據(jù)權(quán)利要求41至46中任一項所述的基因構(gòu)建物，其中，選擇所述同源重組元件 的核苷酸序列，使得沒有或基本上沒有轉(zhuǎn)化盒被整合到所述植物的核基因組中。
48.一種植物細胞或植物或植物種子，包括根據(jù)權(quán)利要求41至47中任一項所述的基因 構(gòu)建物。
49.一種植物、植物細胞或植物種子，包括根據(jù)權(quán)利要求48所述的基因構(gòu)建物，其中， 編碼一種或多種植物激素生物合成肽(b3)的一個或多個核苷酸序列、以及可選的所述可 選的第二啟動子(b2)和/或第二終止元件(b4)已從所述切除盒中切除，優(yōu)選通過重組酶 對所述第一和第二位點特異性重組元件的作用。
50.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方法，包括純化或分離、以及可選地包裝來自權(quán)利要求 48或49所述的植物細胞、植物或植物種子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是抗體、抗生素、除草劑、疫苗 抗原、酶、酶抑制劑或設(shè)計肽。
52.一種通過根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的方法獲得或可獲得的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細胞的方法。更具體地，該方法涉及用轉(zhuǎn)化盒轉(zhuǎn)化植物細胞，其中轉(zhuǎn)化盒靶向植物質(zhì)體并且包括選擇基因，例如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)，以及轉(zhuǎn)基因。在選擇轉(zhuǎn)化質(zhì)體以后，在植物細胞中誘導(dǎo)重組酶的表達，其導(dǎo)致從質(zhì)體切除選擇基因以及在質(zhì)體中表達轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供了包含轉(zhuǎn)化盒的細胞和植物。
文檔編號C12N15/82GK102137933SQ200980121779
公開日2011年7月27日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者約迪·馬普勒, 蔡南海, 西蒙·蓋爾·默勒 申請人:普拉斯泰德股份有限公司