0074] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了以下優(yōu)點(diǎn)：沉淀方法可以基于沉淀劑的過飽和水 平，但是不基于這樣的試劑的溶解度水平。例如，可溶性的尿囊素對病毒溶解度不具有實(shí)際 影響，而過飽和的尿囊素會共沉淀病毒。因而，隨后通過簡單地加入水來溶解帶有結(jié)合的病 毒的以前過飽和的尿囊素，會從新溶解的尿囊素釋放病毒。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指示，酰脲（包括尿囊 素）的結(jié)合病毒、但是不結(jié)合蛋白的能力，將尺寸組分反映為它的選擇性。這又指示，酰脲 修飾的表面會提供平行能力來凈化其它種類的微生物，并潛在地滅活那些種類中的至少一 些。這樣的種類可以包括細(xì)菌、支原體屬和原生動物。
[0075] 在某些實(shí)施方案中，過飽和的尿囊素選擇性地結(jié)合大生物靶標(biāo)（諸如病毒）的明 顯能力可以用于增強(qiáng)病毒的生物學(xué)功能的故意暫停，例如在目的在于滅活病毒使其喪失感 染其正常宿主的能力的情況下。這樣的應(yīng)用包括：通過低pH處理來滅活病毒（在包括尿囊 素的情況下），或通過用有機(jī)多價(jià)陽離子（諸如依沙吖啶、亞甲藍(lán)、苯扎氯銨、氯己定）或有 機(jī)多價(jià)陰離子（諸如辛酸）處理來滅活病毒，或通過非離子型有機(jī)溶劑諸如三（正丁基） 磷酸鹽（可能與非離子型表面活性劑組合），或通過獨(dú)立于三（正丁基）磷酸鹽的表面活性 劑，或前述物質(zhì)的組合來滅活病毒。尿囊素的通過氫鍵合發(fā)生結(jié)合的明顯能力意味著，它不 會干擾這些滅活處理，并且它本身不被這些滅活處理干擾。除了所述具體滅活方法以外且 獨(dú)立于所述具體滅活方法，過飽和的尿囊素的結(jié)合病毒并由此從樣品物理地除去所述病毒 的能力，應(yīng)當(dāng)理解為直接促進(jìn)來自給定樣品的感染性病毒的總體減少。
[0076] 在某些實(shí)施方案中，與表面結(jié)合的不溶性酰脲可以結(jié)合內(nèi)毒素，但是奇怪地幾乎 不表現(xiàn)出結(jié)合DNA的能力。這會擴(kuò)展這樣的實(shí)施方案從蛋白制品和/或含有DNA質(zhì)粒的制 品除去內(nèi)毒素和/或病毒的潛在效用。在DNA存在于與其它樣品組分形成的穩(wěn)定復(fù)合物中 的其它實(shí)施方案中，通過除去所述DNA所結(jié)合的復(fù)合物，尿囊素具有除去DNA的作用。
[0077] 在某些實(shí)施方案中，提供了試劑盒，其用于方便地實(shí)施本文中公開的任意方法。這 樣的試劑盒可以包括試劑和一套關(guān)于實(shí)施所述方法的普通說明書。除了試劑盒以外，本領(lǐng) 域技術(shù)人員會認(rèn)識到，本文中公開的方法可以定制成用在不同的應(yīng)用中，諸如在抗病毒和/ 或抗微生物呼吸過濾器、面罩、水的緊急解毒系統(tǒng)等當(dāng)中。
[0078] 應(yīng)當(dāng)理解，前述的一般描述和下述的詳細(xì)描述都僅僅是示例性的和解釋性的，并 且不限制要求保護(hù)的發(fā)明。 實(shí)施例
[0079] 下述實(shí)施例解釋了這樣的方法：通過所述方法，可以實(shí)施本發(fā)明的各方面，或可以 制備適合于實(shí)施本發(fā)明的某些實(shí)施方案的材料。
[0080] 實(shí)施例1.通過用尿囊素共沉淀來純化病毒，即噬菌體M13。通過以7%的重量/ 體積比加入尿囊素，共沉淀噬菌體細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。pH為約7.0。電導(dǎo)率為20mS。通過 將尿囊素溶解在50mM H印es、150mM NaCl(pH 7.0)中，回收病毒。噬菌體回收率為約70%。 與上清液一起消除了大于99%的蛋白和小分子污染物。
[0081] 實(shí)施例2.噬菌體M13的共沉淀。在5. 0、6.0的pH值和8.0%尿囊素，重復(fù)實(shí)施例 1。如從上清液的除去所判斷的，在2個(gè)實(shí)施例的范圍內(nèi)的共沉淀效率與pH反相關(guān)。
[0082] 實(shí)施例3.噬菌體M13的共沉淀。在與40、60、80和100mS/cm的電導(dǎo)率值對應(yīng)的 NaCl濃度，重復(fù)實(shí)施例1。這些鹽濃度對應(yīng)于約400、600、800和IOOOmM NaCl。如從樣品除 去病毒所判斷的，沉淀效率與電導(dǎo)率直接相關(guān)。最佳共沉淀發(fā)生在400mM NaCl。這被解釋 為反映了病毒顆粒之間的相互靜電排斥的抑制，具有支持酰脲表面上的顆粒的更高填裝密 度的結(jié)果。
[0083] 實(shí)施例4.噬菌體M13的共沉淀。用3%、5%和10%尿囊素，重復(fù)實(shí)施例1。如從 上清液的除去所判斷的，共沉淀效率與尿囊素濃度直接相關(guān)?；厥章史謩e從約31 %增加至 57%、至 91%。
[0084] 實(shí)施例5.噬菌體M13的共沉淀。用在400mM NaCl (pH 6. 0)中的7%尿囊素沉淀 噬菌體細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。大多數(shù)蛋白和小分子污染物與上清液一起消除。估測的回收率 超過90%。通過將尿囊素溶解在50mM Hepes (pH 7.0)中，然后通過超濾進(jìn)行濃縮，回收病 毒。通過分析型陰離子交換色譜法估測得自組合方法的純度超過90% ;回收率為約80%。
[0085] 實(shí)施例6.減毒的登革熱病毒的共沉淀。將減毒的登革熱病毒與在600mM NaCl (pH 6.0)中的7%尿囊素組合。除去上清液。通過將尿囊素溶解在50mM !fepes(pH 7.0)中，回 收病毒。通過免疫測定估測的回收率為70-80%。宿主蛋白污染減少了 99. 3%。
[0086] 實(shí)施例7.通過加入10%的量的尿囊素，在生理?xiàng)l件下共沉淀含有IOltl個(gè)顆粒/mL 的鼠細(xì)小病毒的病毒培養(yǎng)物。上清液的感染試驗(yàn)記錄了 99. 9%的病毒除去。
[0087] 實(shí)施例8.通過加入10 %的量的尿囊素，在生理?xiàng)l件下共沉淀含有101°個(gè)顆粒/mL 的鼠白血病病毒的病毒培養(yǎng)物。上清液的感染試驗(yàn)記錄了 99. 9%的病毒除去。
[0088] 實(shí)施例9.通過用尿囊素共沉淀從蛋白制品除去病毒。通過以5%的重量/體積比 加入尿囊素，共沉淀噬菌體M13細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。pH為約7.0。電導(dǎo)率為約15mS。在沉 淀物中消除了約60%的病毒。大多數(shù)蛋白保留在上清液中。
[0089] 實(shí)施例10.減少蛋白溶液中的內(nèi)毒素。將被約50EU/mL內(nèi)毒素污染的、卵白蛋白 在50mM磷酸鹽、IOOmM NaCl (pH 7. 2)中的樣品用3%尿囊素飽和，溫育15分鐘，此后通過 膜過濾除去沉淀物。上清液的內(nèi)毒素含量減少了超過95%，達(dá)到小于2EU/mL。用10%尿囊 素重復(fù)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)毒素減少了超過99. 5%，達(dá)到小于lEU/mL。
[0090] 實(shí)施例11.使用在固體表面上的酰脲從IgG-內(nèi)毒素混合物回收抗體和減少內(nèi) 毒素。將內(nèi)毒素加入到lmg/mL的在5mM HEPES IOOmM NaCl (pH 7.0)中的人IgG中至 22,000EU/ml。將2% (w/v)尿囊素加入到該混合物的等分試樣中，并將其在室溫混合15分 鐘。通過離心使混懸液澄清。測量蛋白和內(nèi)毒素濃度以計(jì)算抗體回收率和內(nèi)毒素除去。2% (w/v)尿囊素使內(nèi)毒素減少了 2倍?？贵w回收率未受尿囊素的量影響。在后續(xù)系列實(shí)驗(yàn)中， 將尿囊素的量逐漸增加至高達(dá)10%?？贵w回收率逐漸降低至在10%尿囊素時(shí)的約93%，而 內(nèi)毒素除去效率增加至約99%。這些實(shí)驗(yàn)說明，過量的尿囊素的使用可以導(dǎo)致一些蛋白的 損失。在這樣的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做出關(guān)于內(nèi)毒素除去相對于蛋白回收率的最 多產(chǎn)平衡的有見識的決定，并相應(yīng)地調(diào)節(jié)固相酰脲的有效性。使用在約12kDa至IMDa的尺 寸范圍內(nèi)的蛋白的額外實(shí)驗(yàn)指示這樣的確定趨勢：蛋白的損失隨著蛋白尺寸增加而增加。
[0091] 實(shí)施例12.尿囊素和尿酸作為用于除去內(nèi)毒素的基底的對比。將內(nèi)毒素加入在 5mM H印es、100mM NaCl (pH 7. 0)中的 6. 7mg/mL 人 IgG 溶液至 13, 000EU/ml 的終濃度。將 1、2和4% (w/v)的尿囊素或尿酸加入該混合物的等分試樣中，并將其在室溫混合15分鐘。 作為對照，將等量的馬鈴薯淀粉加入各個(gè)系列中。最后，通過離心將反應(yīng)混合物澄清。測量 蛋白和內(nèi)毒素濃度以計(jì)算抗體回收率和內(nèi)毒素除去。在加入淀粉的情況下，沒有內(nèi)毒素減 少。所有濃度的尿酸產(chǎn)生了 4倍減少。尿囊素在實(shí)驗(yàn)之間使內(nèi)毒素減少了 5-10倍（低至 高）?？贵w回收率總是大于90%。除了尿酸的較差性能以外，結(jié)果不隨尿酸的量而變化的 事實(shí)是令人迷惑的，并且凸顯了尿囊素是優(yōu)選的開始酰脲。
[0092] 實(shí)施例13.通過加入尿囊素加速澄清哺乳動物細(xì)胞收獲物。將尿囊素加入5L含 有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物（其含有IgM單克隆抗體以及常見范圍的污染物）中至1%的 終濃度。將容器輕輕渦旋以混合組分。尿囊素和未知細(xì)胞培養(yǎng)組分之間的相互作用造成該 量的尿囊素完全溶解，所以加入另外的1 %，使得總加入量達(dá)到2% (w/v)。再次將容器渦旋 以混合組分。盡管已經(jīng)觀察到微粒材料在加入尿囊素之前非常緩慢地沉降且在有1 %尿囊 素存在下僅稍微更快，但是2%尿囊素明顯地加快沉降速率，并且使細(xì)胞培養(yǎng)物上清液光學(xué) 上澄清地閃爍。1%和2%尿囊素之間的差異被解釋為以下指示：由于一些溶解物質(zhì)在樣品 中的存在，1%尿囊素幾乎完全被樣品溶解。隨后輕輕倒出上清液。這會非故意地再懸浮沉 淀物的一部分，隨后將其離心以沉淀剩余的固體。除了它的病毒和內(nèi)毒素除去能力以外，這 凸顯了本發(fā)明的提高細(xì)胞收獲物澄清質(zhì)量的能力。它也凸顯了用至少2%的尿囊素濃度進(jìn) 行初步試驗(yàn)的實(shí)用性。它進(jìn)一步凸顯了以下重點(diǎn)：尿囊素的溶解度可能受樣品組分影響，結(jié) 果是最終通過實(shí)驗(yàn)確定尿囊素的過飽和濃度，盡管它的已知的在水中的溶解度可能提供有 用的初步指導(dǎo)。
[0093] 實(shí)施例14.通過加入尿囊素澄清大腸桿菌裂解物。用微流化儀在16, OOOx g，將 20克大腸桿菌糊狀物在250mL 50mM Hepes (pH 7.0)中勻漿化。然后將勻漿物在15, OOOx g離心1小時(shí)，以除去最大的微粒物質(zhì)。這產(chǎn)生褐色渾濁上清液。將干燥的尿囊素直接加入 上清液中至5% w/v的終濃度。將混合物渦旋約1分鐘，然后使其沉降。不溶物在幾分鐘 內(nèi)沉降，剩下光學(xué)上閃爍的澄清上清液，其含有超過90%的存在于原始勻漿物中的蛋白產(chǎn) 物。將上清液容易地穿過0. 22微米膜濾器，其中在尿囊素處理之前的上清液實(shí)際上在接觸 后堵塞濾器。本實(shí)施例凸顯了尿囊素的顯著改善經(jīng)處理的樣品的過濾性的能力。
[0094] 實(shí)施例15.有機(jī)添加劑對尿囊素親和步驟的影響。通過尿囊素親和，用與0.01% 依沙吖啶組合的1%尿囊素處理含有細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物（其含有單克隆 IgG)。使樣品（在約7. 2的pH和約13. 5mS的電導(dǎo)率，這些條件對應(yīng)于所謂的生理?xiàng)l件） 穿過用色譜介質(zhì)填充的柱，所述色譜介質(zhì)包括等量的金屬親和配體TREN(BioWorks TREN hi-sub)和疏水配體（Macroprep T-butyl)。在前一步驟以后的抗體回收率是99%。DNA 減少了 3. 51og，病毒減少了 4-51og。另外，經(jīng)處理的樣品是閃爍澄清的，具有約2. ONTU的 濁度，從而指示微粒的接近完全除去。
[0095] 實(shí)施例16.遵循實(shí)施例15的形式，但是在一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中增加尿囊素的量，包 括2%、4%和8%?？贵w回收率以大致線性方式與尿囊素的量成反比地下降。盡管在1% (實(shí)施例15)的回收率為99%，但是在8%的回收率為約87%。
[0096] 實(shí)施例17.通過尺寸排阻色譜法，分析了如在實(shí)施例15和16中所述處理的IgG。 結(jié)果表明，聚集體含量隨著尿囊素增加而大致線性下降，但是聚集體含量的下降大于在實(shí) 施例16中注意到的抗體損失。在遵循實(shí)施例15的聚集體含量為約5%的情況下，它下降至 在8%尿囊素時(shí)的約1. 3%。膜澄清的缺乏尿囊素的細(xì)胞收獲物的聚集體含量為約19%。 還觀察到，遞增量的尿囊素優(yōu)先減少較高分子量的聚集體。本實(shí)施例凸顯了本發(fā)明的以下 功能特征：過飽和的尿囊素優(yōu)先結(jié)合較高分子量的生物靶標(biāo)。它也凸顯了以下重要啟發(fā)觀 點(diǎn)：可以調(diào)節(jié)用于處理特定生物靶標(biāo)的尿囊素的實(shí)際量，以有利于聚集體除去或抗體回收 率。
[0097] 實(shí)施例18.將尿囊素和依沙吖啶加入補(bǔ)充了 5%血清的單克隆IgM上清液中，至分 別為1% (過飽和）和0.02%的終濃度。通過離心使上清液澄清，然后流過填充的色譜床 (20mL上清液/mL填充