一種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物中含有鹽酸丁螺環(huán)酮和一種從知母的干燥根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，鹽酸丁螺環(huán)酮和本發(fā)明提供的化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，可使滑膜細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期G1期，從而抑制滑膜細(xì)胞增殖，治療滑膜炎；治療效果優(yōu)于鹽酸丁螺環(huán)酮或化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用。鹽酸丁螺環(huán)酮與化合物(Ⅰ)組合物可開發(fā)成治療滑膜炎的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鹽酸丁螺環(huán)酮的新用途，具體涉及鹽酸丁螺環(huán)酮 的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸丁螺環(huán)酮片是一種新型抗焦慮藥物，它主要是通過激活腦內(nèi)五羥色胺(5-HT) 1A受體而改變焦慮情緒。
[0003] 膝關(guān)節(jié)滑膜炎是一種無菌型炎癥，是由于膝關(guān)節(jié)扭傷和多種關(guān)節(jié)內(nèi)損傷而引起 的?；さ墓δ墚惓?huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)液無法正常生成和吸收，膝關(guān)節(jié)就會(huì)產(chǎn)生積液。滑膜的形態(tài) 改變還會(huì)侵襲膝關(guān)節(jié)軟骨，不及時(shí)治療會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，存在很大的致殘危機(jī)。
[0004] 迄今為止，尚未見鹽酸丁螺環(huán)酮及其藥物組合物與滑膜炎的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽 酸丁螺環(huán)酮和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸丁螺環(huán)酮和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療滑膜 炎。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009] -種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物，包括鹽酸丁螺環(huán)酮、如權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0011] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將知母的干燥根莖粉碎，用75 ~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁 醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正 相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組 分；⑷步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓 濃縮得到化合物(I)。
[0013] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0015]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備治療滑膜炎的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 上述鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物在制備治療滑膜炎的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 本發(fā)明提供的鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物中含有鹽酸丁螺環(huán)酮和一種從知母的 干燥根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸丁螺環(huán)酮和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì) 滑膜炎具有治療作用;二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)滑膜炎的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療 滑膜炎的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0021 ]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0022]分離方法：（a)將知母的干燥根莖(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5L X 3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的 正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個(gè)柱體積）、45:1 (8個(gè)柱體積）、 25:1(10個(gè)柱體積）和15:1(8個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(10個(gè)柱體積）、15:1(8個(gè)柱體積） 和1:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (260mg，HPLC歸一化純度大于98% )。 [0023] 結(jié)構(gòu)確證:無色結(jié)晶，HR-ES頂S顯示[M+H]+為m/z 335.2174,結(jié)合核磁特征可得分 子式為〇2〇出()〇4，不飽和度為6。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)5[^口111，口5^(1;[116-(15,50010^):!1-1(6.04， dd，J = 6.7，12.1Hz)，H-2(6.52，dd，J=12.1，9.5Hz)，H-3(7.13，d，J = 9.5Hz)，H-5a(3.23， d，J=15.6Hz)，H-5b(2.98，dd，J=15.6,9.3Hz)，H-6(5.06，dd，J = 9.3，1.4Hz)，H-7(1.87， m)，H-8(1.53，m)，H-9a(2.02，m)，H-9b(1.61，m)，H-10(1.96，m)，H-ll(1.77，m)，H-12(0.85， d，J = 5.9Hz)，H-13(1 · 13，d，J = 6.8Hz)，H-14(1.20，d，J = 6.8Hz)，H-2'（2.73，m)，H-3' (4.25，m)，H-4'（1.33，d，J = 6.1Hz)，H-5'（1 · 18，d，J = 7.4Hz);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)5c(ppm， pyridine-d5，125MHz):133.2(CH，1-C)，127.4(CH，2-C)135.3(CH，3-C)，122.5(C，4-C)， 28.3(CH2,5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，27.7(CH，8-C)，35.2(CH2,9-C)，42.8(CH，10-C)，26.4(CH，n-C)，22.1(CH 3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，171.2(C，15-C)， 209.4(C，r-C)，48.7(CH，2'-C)，70.3(CH，3'-C)，22.0(CH 3,4'-C)，13.7(CH3,5'-C)。紅外波 譜中的1756cnf1吸收帶與UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有α，β-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，紅 外波譜中的335301^1715(^ 1與1624CHT1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在羥基、酮基與α，β-不飽和 共輒體系。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有20個(gè)碳信號(hào)，包括五個(gè)甲基，兩個(gè)亞甲基，十個(gè)次 甲基(兩個(gè)連氧碳和三個(gè)烯烴碳），以及三個(gè)季碳(兩個(gè)羰基碳和一個(gè)烯烴碳），以上功能結(jié) 構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示五個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào) δΗ 0.85(3H，d，J = 5.9Hz)、1.13(3H，d，J = 6.8Hz)、1.20(3H，d，J = 6.8Hz)、1.33(3H，d，J = 6.1他）、1.18(3!1，(1，1 = 7.4抱），三個(gè)共輒烯烴質(zhì)子信號(hào)5116.04(1!1，(1(1，1 = 6.7，12.1抱）、 6.52(1!1，(1(1，1=12.1，9.5!^)與7.13(1!1，(1，1 = 9.5!^)，兩個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)5[15.06 (lH，dd，J = 9 · 3，1 · 4Hz)與4 · 25( lH，m) ,Η-1!! COSY譜中存在Η-1/Η-2/Η-3、Η2-5/Η-6/Η-7/Η-8/出-9/!1-10、!1-7/!1-11/出-12、!1-11/!1 3-13以及!1-8/出-14相關(guān)信號(hào)，結(jié)合腿8(：譜中顯示的 Η-2、Η2-9和Η-10與C-l，H-2、H2-5和Η-6與C-4相關(guān)信號(hào)可以構(gòu)建吉馬烷型倍半萜骨架。 COSY譜中H3-5'/H-2'/H-37H3-4'相關(guān)信號(hào)與HMBC譜中H-2'與C-Γ、C-3'和C-5' 以及H-3'與 C-2 '和C-4 '相關(guān)信號(hào)可以構(gòu)建0-3 ' -0-羥基-2 ' -甲基丁酮基片段，同時(shí)HMBC譜H-10與C-Γ 相關(guān)信號(hào)表明這一片段與吉馬烷型倍半萜骨架連接的位置。另外HMBC譜H-3、H2-5和H-6與 C-15相關(guān)信號(hào)暗示C-6與C-15之間存在一個(gè)內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。N0ESY譜中，假設(shè)H-8為β構(gòu)型，那么 Η-8與Η-10相關(guān)信號(hào)表明Η-10也為β構(gòu)型，因此，0-3 ' -0-羥基-2 ' -甲基丁酮基應(yīng)該為a構(gòu)型。 綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物 如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0024]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0026] 實(shí)施例2:藥理作用
[0027] 1.材料與方法
[0028] 1.1動(dòng)物
[0029]選用雄性Wistar大鼠（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重120g左 右。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031 ]鹽酸丁螺環(huán)酮購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實(shí)施例 1。11型膠原(美國Sigma公司）、不完全弗氏佐劑(Sigma公司）、RPMI-1640(GIBC0公司）。
[0032] 1.3儀器
[0033] 美國nurie C02培養(yǎng)箱(NU4750型）、日本奧林巴氏倒置熒光顯微鏡(CKX41型）、美 國Beckman Coulter流式細(xì)胞儀(EPICSXL型）、日本透射電鏡（日立H-7500型）。
[0034] 1.4大鼠模型制備及細(xì)胞分組
[0035]膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型的制備將Π 型膠原溶解于O.lmmol/L的冰乙酸 中（Π 型膠原的終濃度為2g/L)，4°C過夜。然后將其滴加至冷的等積不完全弗氏佐劑中充分 乳化。將該乳劑每只大鼠皮內(nèi)注射0.5ml，分背部4點(diǎn)和尾跟部1點(diǎn)。7天后同樣方法加強(qiáng)注射 1次。根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評(píng)分系統(tǒng)每天對(duì)每只大鼠關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)分，分為0~4分:0分，無紅腫； 1分，小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié) 以內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的指數(shù)累積計(jì)分，即為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)。
[0036]滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)致炎后第25天，脫白處死發(fā)病的大鼠，無菌條件下取得滑膜 組織，剪切成約1mm3的碎塊，0.5mg/ml的Π 型膠原酶37°C消化6~7h，1200r/m離心8min，加 入1640培養(yǎng)液【分為5組:模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、鹽酸丁螺環(huán)酮組、化合物（I)組、鹽酸丁 螺環(huán)酮與化合物（I)組合物組，每組均含10%胎牛血清；陽性對(duì)照組還含有1.〇 X l(T6m〇l/L 的甲氨蝶呤，鹽酸丁螺環(huán)酮組還含有2.0 X 10-6mol/L的鹽酸丁螺環(huán)酮，化合物（I)組還含有 2.0 X l(T6mol/L的化合物（I)，鹽酸丁螺環(huán)酮與化合物（I)組合物組還含有1.0 X l(T6mol/L 的鹽酸丁螺環(huán)酮和1. 〇 X l(T6m〇l/L的化合物（I)】，置于37°C5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，消化傳 代，用第3~5代細(xì)胞。
[0037] 1.5流式細(xì)胞儀檢測滑膜細(xì)胞周期
[0038]收集細(xì)胞，用roS重懸吹打成單細(xì)胞懸液，將其緩慢加到預(yù)冷的5ml 75%乙醇中，4 °C固定過夜；用ros將其濃度調(diào)整到5 X 106個(gè)/ml，然后取400μ1，加 RAase 20ml，37 °C水浴 30min;加 PI 100μΙ，避光染色20min，300目尼龍網(wǎng)過濾，上流式細(xì)胞儀。
[0039] 1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0040]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0041 ] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042]流式細(xì)胞儀周期分析結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性對(duì)照組G1期增加，S期減少，差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0.05);鹽酸丁螺環(huán)酮與化合物（I)組合物組G1期明顯增加(P〈0.01)， S期明顯減少（？〈〇.〇1);鹽酸丁螺環(huán)酮組和化合物（1)組61期增加（？〈〇.〇5)，3期減少0〈 0.05)〇
[0043]表1對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞周期的影響
[0045] 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)節(jié)損傷和組織重構(gòu)中，滑膜細(xì)胞既是靶細(xì)胞，也通過多種 途徑成為參與者，其功能的改變在疾病的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，成纖維樣滑膜細(xì)胞 是滑膜組織的主要成分，參與了關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)周圍的骨組織破壞，所以抑制成纖維 樣滑膜細(xì)胞增殖是治療RA的手段之一。
[0046] 上述結(jié)果表明，鹽酸丁螺環(huán)酮和本發(fā)明提供的化合物（I)聯(lián)合作用時(shí)，可使滑膜細(xì) 胞停滯在細(xì)胞周期G1期，從而抑制滑膜細(xì)胞增殖，治療滑膜炎;治療效果優(yōu)于鹽酸丁螺環(huán)酮 或化合物(I)單獨(dú)作用。鹽酸丁螺環(huán)酮與化合物(I)組合物可開發(fā)成治療滑膜炎的藥物。
[0047] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物，其特征在于：包括鹽酸丁螺環(huán)酮、如權(quán)利要求1所 述的化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的 載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附 載體或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物，其特征在于：所述劑型包括片 劑、膠囊劑、□服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將知 母的干燥根莖粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85 :1、45:1、25 :1和15:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比 為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療滑膜炎的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的鹽酸丁螺環(huán)酮的藥物組合物在制備治療滑膜炎的藥物中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P19/04GK105884720SQ201610260256
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】陳斌
【申請(qǐng)人】陳斌