一種熒光增強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種熒光增強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該探針?lè)肿拥姆肿邮綖椋篊21H14N4O2S，其結(jié)構(gòu)式如式（Ⅰ）所示：。本發(fā)明設(shè)計(jì)的硫化氫熒光探針，制備簡(jiǎn)單、合成路線(xiàn)成熟，能夠?qū)?xì)胞中的硫化氫進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)并可以熒光成像，可應(yīng)用于水環(huán)境和生物細(xì)胞體系中硫化氫的含量傳感檢測(cè)，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種熒光増強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光增強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析 化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫化氫（H2S)，在生物體內(nèi)由酶催化產(chǎn)生，并且在調(diào)節(jié)人的生理機(jī)能方面扮演著 重要的角色。例如，硫化氫可參與血紅蛋白改變;參與體內(nèi)亞硝基類(lèi)化合物的還原；調(diào)節(jié)體 內(nèi)多種酶的功能；調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌;舒張血管平滑肌;保護(hù)胃黏膜，減小壓力的 作用;硫化氫能夠有效清除過(guò)氧化氫、超氧陰離子、次氯酸、過(guò)氧亞硝基等。實(shí)驗(yàn)表明硫化氫 能夠有效地降低AP誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性。硫化氫與FPG表現(xiàn)為負(fù)比例關(guān)系，升高二型糖尿病 病人硫化氫濃度也許有助于降血糖。但是，生物體內(nèi)硫化氫失調(diào)則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，比如 老年癡呆癥，唐氏綜合癥，糖尿病，肝硬化等。所以實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)硫化氫的檢測(cè)具有極其重 要的意義。
[0003] h2s作為人體內(nèi)重要的信號(hào)分子，在生物體內(nèi)濃度變化較快，所以探針要有一定的 響應(yīng)速度，以實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)硫化氫的實(shí)時(shí)檢測(cè)。復(fù)雜的生物環(huán)境會(huì)干擾硫化氫檢測(cè)，尤其是 硫醇的干擾。同時(shí)生物體系內(nèi)還有多種陰離子，都可能對(duì)探針的效果產(chǎn)生影響，探針必須具 有高度的選擇性。此外，要實(shí)現(xiàn)水溶液中硫化氫的高效傳感和生物體內(nèi)細(xì)胞成像，所以設(shè)計(jì) 的硫化氫探針要有低的熒光背景和高的熒光響應(yīng)信號(hào)。
[0004] 目前，多數(shù)的硫化氫熒光探針選擇性不高，并且對(duì)硫化氫檢測(cè)顏色變化不明顯，對(duì) 硫化氫響應(yīng)的熒光信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)不高，很難實(shí)現(xiàn)檢測(cè)水溶液和細(xì)胞內(nèi)的硫化氫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)目前硫化氫分子熒光探針檢測(cè)所面臨的問(wèn)題和現(xiàn)狀，本發(fā)明通過(guò)分子設(shè)計(jì)， 合成出一種具有焚光信號(hào)強(qiáng)和高選擇性的硫化氫分子焚光探針。本專(zhuān)利基于硫化氫對(duì)疊氮 具有良好的還原性并結(jié)合激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)機(jī)理設(shè)計(jì)的硫化氫熒光探針，探 針對(duì)硫化氫具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)的響應(yīng)（熒光信號(hào)強(qiáng)度可以增強(qiáng)400多倍），具有良好的選 擇專(zhuān)一性。能夠?qū)λ芤褐泻图?xì)胞內(nèi)的硫化氫進(jìn)行熒光成像應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種熒光增強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針，其特征在于，所述探針?lè)肿拥姆肿邮綖椋?C21HWN4O2S，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
[0007] 一種上述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟： 1) 將leq的鄰甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱回流24小時(shí)，然 后分離提純得到化合物1-1;所述化合物1-1結(jié)構(gòu)式如下：
2) 將leq的化合物1-1，leq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加熱回流反應(yīng)過(guò)夜，分 離提純得到化合物1 -2;所述化合物1 -2結(jié)構(gòu)式如下：
3) 將leq化合物1-2與1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫回流反應(yīng)24小時(shí)后，分離 提純得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的結(jié)構(gòu)式如下：
4) 將leq化合物1-3溶于四氫呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫 反應(yīng)17小時(shí)，將反應(yīng)液用3M鹽酸溶液酸化，然后分離提純得到化合物1-4;所述化合物1-4結(jié) 構(gòu)式如下：
5) 將leq水楊醛與leq鄰氨基苯硫酚，leq的Na2S205溶解在DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流反 應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)完全后，分離提純得到化合物2-1;所述化合物2-1的結(jié)構(gòu)式如下：
6)將leq化合物2-1與leq的化合物l-4，leq的DMAP，leq的DCC溶于二氯甲烷中，氮?dú)獗?護(hù)，室溫反應(yīng)8小時(shí)，分離提純得到目標(biāo)探針化合物FN3_H2S。
[0008] 所述步驟1)中分離提純方法為:反應(yīng)液中加入適量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3 次，鹽水洗2-3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。
[0009] 所述步驟2)中分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0010] 所述步驟3)中分離提純方法為：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無(wú) 水硫酸鈉干燥，柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0011] 所述步驟4)中分離提純方法為:用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無(wú)水 硫酸鈉干燥，柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0012] 所述步驟5)中分離提純方法為:反應(yīng)液倒入大量水中產(chǎn)生固體，然后減壓過(guò)濾，真 空干燥，得到純產(chǎn)品。
[0013] 所述步驟6)中分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0014] 上述的硫化氫熒光探針的合成路線(xiàn)如下：
本發(fā)明所述的硫化氫分子熒光探針的應(yīng)用，該熒光探針可以應(yīng)用于水環(huán)境和生物細(xì)胞 體系中硫化氫的含量傳感檢測(cè);所述的傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)，目視定性檢測(cè)，細(xì)胞成像檢 測(cè)。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：（1)探針的合成路線(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)單，且后處理過(guò)程容易；（2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn) 了硫化氫分子探針的快速檢測(cè)，具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。此外，用肉眼就可以 明顯的觀察到溶液顏色的變化和紫外燈下較強(qiáng)熒光變化，是一種具有生色傳感功能的熒光 探針。其顯著的顏色和熒光強(qiáng)度變化，使該探針展現(xiàn)了在水溶液中和生物細(xì)胞內(nèi)高選擇性， 高靈敏度檢測(cè)硫化氫分子，可進(jìn)行實(shí)時(shí)定性及定量的目視比色法檢測(cè)。故而，本發(fā)明是一種 簡(jiǎn)單，快速，靈敏的硫化氫分子特異性檢測(cè)試劑，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前 景。其性能將在實(shí)施例中結(jié)合附圖給予詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是實(shí)施例1中探針FN3-H2s的1H NMR圖譜； 圖2是探針FN3-H2S隨硫化鈉的加入熒光譜圖的變化情況； 圖3是探針FN3-H2S對(duì)不同離子和分子的選擇性熒光譜圖； 圖4是探針FN3-H2S對(duì)不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)； 圖5是探針FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液顏色的變化； 圖6是探針FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液用紫外燈照射后熒光強(qiáng)度的變化； 圖7是探針FN3-H2S對(duì)外源性硫化氫進(jìn)行生物細(xì)胞成像。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限 制，實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)于上述方案中化合物的號(hào)碼。
[0018] 實(shí)施例1 化合物FN3-H2s硫化氫熒光探針的合成 (1)化合物1-1的合成：
將鄰甲基苯甲酸(5.0g，36.7mmol，leq)溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱 回流24小時(shí)，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻，加入20mL水，用二氯甲燒萃取，水洗2-3 次，鹽水洗2-3次無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行分離，硅膠顆 粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:1，產(chǎn)量為89%。
[0019] ⑵化合物1-2的合成：
將化合物 1-1(1.97g，12mmol，leq)，NBS(2.35g，13.2mmol，leq)，AIBN(98.4mg， 0.6mmol，0.05 eq)溶于20mL乙腈中，加熱回流反應(yīng)過(guò)夜，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后， 減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比 為二氯甲烷/石油醚=1:1，產(chǎn)量為56%。
[0020] (3)化合物1-3的合成：
將化合物1-2(1.18,4.53!11111〇1，169)溶于311^01^中，然后加入疊氮化鈉（35311^， 5.43mmol，1.2eq)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)24小時(shí)，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，乙酸乙酯 萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅 膠柱進(jìn)行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:2,產(chǎn)量為 82%〇
[0021] (4)化合物1-4的合成：
將化合物1_3(90〇11^，4.41]11]1〇1，169)溶于1〇1111^1'冊(cè)中，加入2 1111^甲醇，4 1]11^水，然后再 加入LiOH( 528mg，22mmol，5eq)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)17小時(shí)。用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全 后，將反應(yīng)液用3M鹽酸溶液酸化，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無(wú)水硫酸鈉 干燥，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑 配比為二氯甲烷/石油醚=1:2，產(chǎn)量為86%。
[0022] (5)化合物2-1的合成：
將水楊酸（961mg，7.87mmol, leq)和Na2S2〇5(1.5mg，7.87mmol, leq)溶于 10mL DMF中， 然后再加入鄰氨基苯硫酚（1. 〇g，7.87mmol，leq)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流反應(yīng)2-3小時(shí)，用TCL 板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻，將其倒入200mL水中，有固體產(chǎn)生，減壓過(guò)濾，真空干燥，得 到純產(chǎn)品。產(chǎn)量為92%。
[0023] (6)化合物FN3_H2S的合成：
將化合物 1-4(9 .lmg，0.528mmol，leq)，化合物2-1( 100mg，0.528mmol，leq)，DMAP (201mg，0.528mmol，leq, DCC(136mg，0.528mmol，leq)溶于5mL二氯甲烷中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室 溫反應(yīng)8小時(shí)，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，減壓旋干溶劑后得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行 分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:1，產(chǎn)量為81%。該探針 的 1H-NMR (400MHz，DMS〇-t/6)(見(jiàn)圖 1)δ 8.40 (d，/= 7.4 Hz, 1H)，8.31 (d，/= 7.5 Hz, 1H), 8.09 (d, /= 7.8 Hz, 1H), 7.83 (dd, /= 19.6, 7.6 Hz, 2H), 7.71 (dd, /= 15.9, 7.5 Hz, 3H), 7.58 (t, /= 7.5 Hz, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 1H), 7.44 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H) 實(shí)施例2 化合物FN3-H2S硫化氫熒光探針隨Na2S加入當(dāng)量的增加熒光譜圖的變化 取實(shí)施例1制備的FN3-H2S硫化氫熒光探針溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成lmmol/L儲(chǔ) 備液。從儲(chǔ)備液中取出40yL加入到5mL的離心管當(dāng)中，用PBS緩沖溶液(0. lmo 1 /L，pH=7.4) 與DMSO體積比為3 :1的溶液稀釋至4 mL，加入不同當(dāng)量（0-100 eq)的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液，以 410nm為激發(fā)光測(cè)量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，隨著Na 2S加入當(dāng)量的增 加熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。
[0024] 實(shí)施例3 化合物FN3-H2s熒光探針對(duì)不同分子或離子的選擇性 從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出40yL加入到5mL的離心管當(dāng)中，用PBS緩沖溶液 (0.1mol/L，pH=7.4)與DMS0體積比為3:1的溶液稀釋至4 mL，配制一系列探針溶液，分別加 入等摩爾量的競(jìng)爭(zhēng)分子和等摩爾量的硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一個(gè)溶液不加離子作為空白對(duì) 照，lh后以410nm為激發(fā)光檢測(cè)溶液的熒光發(fā)射光譜變化，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和 圖4可以發(fā)現(xiàn)，其他離子對(duì)化合物FN 3-H2S的熒光幾乎沒(méi)有影響，而硫化鈉溶液的加入使化 合物FN3-H 2S的熒光顯著增強(qiáng)。
[0025] 實(shí)施例4 化合物FN3-H2s熒光探針對(duì)硫化氫的可視化檢測(cè) 從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出40yL加入到5mL的離心管當(dāng)中，加入100摩爾當(dāng) 量的硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，硫化鈉可以使合物FN3-H2S熒光探針的PBS: DMS0體積比為3:1的緩沖 溶液溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從無(wú)色變成淺黃色（圖5)。伴隨著紫外燈下肉眼可 視的硫化氫誘導(dǎo)熒光探針發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光（圖6)，說(shuō)明是一種具有生色傳感功能的熒 光探針。
[0026] 實(shí)施例5 化合物FN3_H2S熒光探針對(duì)細(xì)胞外源性硫化氫熒光成像 我們將本發(fā)明探針應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中對(duì)外源性的硫化氫進(jìn)行熒光成像應(yīng)用。具體操作 步驟如下:將5μΜ探針DMS0溶液加入到育有HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液(2mL)中在二氧化碳培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)30 min后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行藍(lán)通道成像，結(jié)果見(jiàn)圖7。首先進(jìn)行明場(chǎng)成像，可以看到 細(xì)胞大致的輪廓（圖7a)。然后用405nm的激光進(jìn)行激發(fā)成像，探測(cè)器接受范圍為425nm-475nm，通過(guò)藍(lán)通道進(jìn)行熒光成像可以觀察到在未加入似以前，幾乎觀察不到細(xì)胞有熒光發(fā) 射（圖7b)。然而向體系中加入Na 2S 20μΜ的水溶液后，等待30 min后，再用405nm的激光進(jìn)行 激發(fā)可以觀察到細(xì)胞內(nèi)有明顯的藍(lán)光發(fā)出（圖7e)，說(shuō)明此熒光探針可以對(duì)外源性的硫化氫 進(jìn)行熒光成像。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光增強(qiáng)型硫化氫分子熒光探針，其特征在于，所述探針?lè)肿拥姆肿邮綖椋?C21HwN4O2S，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：2. -種權(quán)利要求1所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步 驟： 1) 將Ieq的鄰甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱回流24小時(shí)，然 后分離提純得到化合物1-1;所述化合物1-1結(jié)構(gòu)式如下：2) 將Ieq的化合物1-1，Ieq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加熱回流反應(yīng)過(guò)夜，分 離提純得到化合物1 -2;所述化合物1 -2結(jié)構(gòu)式如下：3) 將Ieq化合物卜2與1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫回流反應(yīng)24小時(shí)后，分離 提純得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的結(jié)構(gòu)式如下：4) 將Ieq化合物1-3溶于四氫呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫 反應(yīng)17小時(shí)，將反應(yīng)液用3M鹽酸溶液酸化，然后分離提純得到化合物1-4;所述化合物1-4結(jié) 構(gòu)式如下：5) 將Ieq水楊醛與Ieq鄰氨基苯硫酚，Ieq的Na2S2O5溶解在DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流反 應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)完全后，分離提純得到化合物2-1;所述化合物2-1的結(jié)構(gòu)式如下：6)將Ieq化合物2-1與Ieq的化合物1-4, Ieq的DMAP，Ieq的DCC溶于二氯甲烷中，氮?dú)獗?護(hù)，室溫反應(yīng)8小時(shí)，分離提純得到目標(biāo)探針化合物FN3-H2S。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中 分離提純方法為:反應(yīng)液中加入適量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，鹽水洗2-3次，無(wú)水硫 酸鈉干燥，然后柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中 分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中 分離提純方法為：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱色譜 分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中 分離提純方法為：用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱色譜分 離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中 分離提純方法為:反應(yīng)液倒入大量水中產(chǎn)生固體，然后減壓過(guò)濾，真空干燥，得到純產(chǎn)品。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟6)中 分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。9. 一種權(quán)利要求1所述的硫化氫分子熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光探針可以 應(yīng)用于水環(huán)境和生物細(xì)胞體系中硫化氫的含量傳感檢測(cè);所述的傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)， 目視定性檢測(cè)，細(xì)胞成像檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105884713SQ201610264719
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月26日
【發(fā)明人】林偉英, 任明光, 鄧貝貝
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)