為空白對照組(下同)，在17種咪唑型離子液體中，有 4 種能夠提高香草醛的產(chǎn)率，分別是[MMIm] [MeSO4]、[EMIm] [MeSO4]、[BMIm] [MeSO4]、 [Me (OEt) 3MIm] [Tf2N]，它們相對于空白對照組的產(chǎn)率分別是115. 6%、107. 7%、105. 5%、 111.2%。這4種咪唑型離子液體中，有3種都是以[MeSO4]作為陰離子的，說明[MeSO 4]對 香草醛產(chǎn)率的提高起了主導作用；另外，香草醛的產(chǎn)率還與咪唑陽離子的側鏈長度呈反比 關系，即咪唑陽離子的側鏈長度越長，產(chǎn)率越低。
[0036] 如圖2所示，在17種銨鹽離子液體中，有6種能提高香草醛的產(chǎn)率，分別是 [Choline] [Cl]、[Choline] [H2PO4]、[NMe3] [MeSO3]、[NBu4] [MeSO3]、[NMe3] [H2PO4]及[ETM] [Tf2N]，它們相對于空白對照組的產(chǎn)率分別是118. 5%、110. 2%、105. 2%、112. 0%、116. 4%、 114. 8%〇
[0037] 如圖3所示，磷鹽離子液體[PBu4] [Ac]能夠提高香草醛的產(chǎn)率，它相對于空白對 照組的產(chǎn)率為105. 7%。
[0038] 實施例2 a、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，37°C、220rpm振蕩反應12h得到種 子液，種子培養(yǎng)基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，調(diào)整pH至7.0; b、 反應結束后，取2ml種子液接入50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩反應16h得到 菌液，發(fā)酵培養(yǎng)基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 lg(pH7.0)。
[0039] c、取10ml菌液5000rpm離心10min，棄上清，獲得濕菌體； d、 往濕菌體中加入IOml緩沖溶液，重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 246g異丁香酷和IOOul 深度低共熔溶劑的錐形瓶中，蓋上橡膠塞，30°C、200rpm振蕩反應72h ; e、 反應結束后，加入IOml 95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分混 勾后 7000rpm 離心 IOmin ; f、 取離心后的上清液，用95%乙醇稀釋10倍，過濾后進行HPLC檢測。
[0040] HPLC檢測采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脫（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，進樣量 IOul，波長 270nm。
[0041] 如圖4和圖5所示，除了 1種DES (ChCl/U (1:1，摩爾比，下同））的產(chǎn)率略低于 空白對照組外，其余23種DESs都能明顯提高香草醛產(chǎn)率。其中，可提高香草醛產(chǎn)率的膽 堿醋酸鹽型 DESs 為 ChAc/U (2:1)、ChAc/U (I: I)、ChAc/U (1:2)、ChAc/A (2:1)、ChAc/A (l:l)、ChAc/A (l:2)、ChAc/G (2:l)、ChAc/G (l:l)、ChAc/G (l:2)、ChAc/EG (2:1) 、ChAc/ EG (1:1)或ChAc/EG (1:2)，并且大部分的膽堿醋酸鹽型DESs使相對產(chǎn)率達到120%以上， 最高可達140%以上；添加膽堿氯鹽型DESs的產(chǎn)率普遍在120%左右，可提高香草醛產(chǎn)率 的膽堿氯鹽型 DESs 為 ChCl/U (2:l)、ChCl/U (l:2)、ChCl/A (2:l)、ChCl/A (l:l)、ChCl/ A (l:2)、ChCl/G (2:l)、ChClG (l:l)、ChCl/G (l:2)、ChCl/EG (2:1)、ChCl/EG (1:1)或 ChCl/EG (1:2)。說明在使用CGMCC1347全細胞催化異丁香酚生成香草醛的應用上，DESs的 少量添加即可提高香草醛的產(chǎn)率，膽堿醋酸鹽型DESs明顯優(yōu)于膽堿氯鹽型DESs。
[0042] 實施例3 a、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，37°C、220rpm振蕩反應12h得到種 子液，種子培養(yǎng)基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，調(diào)整pH至7.0; b、 反應結束后，取2ml種子液接入50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩反應16h得到 菌液，發(fā)酵培養(yǎng)基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 Ig (ρΗ7·0); c、 取IOml菌液5000rpm離心10min，棄上清，獲得濕菌體； d、 用緩沖溶液重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 246g異丁香酚和一定量尿素的錐形瓶中，添 加緩沖溶液使反應體系達到l〇ml。蓋上橡膠塞，30°C、200rpm振蕩反應72h ; e、 反應結束后，加入IOml 95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分混 勾后 7000rpm 離心 IOmin ; f、 取離心后的上清液，用95%乙醇稀釋10倍，過濾后進行HPLC檢測。
[0043] HPLC檢測采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脫（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，進樣量 IOul，波長 270nm。
[0044] 如圖6所示，香草醛的產(chǎn)率與反應體系中尿素的含量有關，體系中含有5. 4%(質(zhì)量 分數(shù)）的尿素時，香草醛的產(chǎn)率最高，相對產(chǎn)率可達170%以上。另外，在實施例3中的無機 氮源同樣可以是除尿素之外的其他氮源。
[0045] 實施例4 a、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，37°C、220rpm振蕩反應12h得到種 子液，種子培養(yǎng)基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，調(diào)整pH至7.0; b、 反應結束后，取2ml種子液接入50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩反應16h得到 菌液，發(fā)酵培養(yǎng)基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 Ig (ρΗ7·0); c、 取IOml菌液5000rpm離心10min，棄上清，獲得濕菌體； d、 用IOml緩沖溶液重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 246g異丁香酚的錐形瓶中。蓋上橡膠塞， 30°C、200rpm 振蕩反應 72h ; e、 反應結束后，加入IOml 95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分混 勾后 7000rpm 離心 IOmin ; f、 取離心后的上清液，用95%乙醇稀釋10倍，過濾后進行HPLC檢測。
[0046] HPLC檢測采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脫（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，進樣量 IOul，波長 270nm。
[0047] 如圖7所示，圖譜的基線平穩(wěn)，只有兩個明顯的峰，分別是產(chǎn)物一香草醛 (6. 645min)和底物一異丁香酚（11.859min)，且區(qū)分度高、峰型好。說明CGMCC1347確實能 夠高特異性地轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛。
[0048] 本發(fā)明中，各專用名詞的簡稱及全稱如下：
【主權項】
1. 一種全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，包括步驟： 51、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，32~40°C、100~300rpm振蕩反應 6~36h得到種子液； 52、 反應結束后，取2ml種子液接入30~70ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，32~40°C、100~300rpm振蕩 反應12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm離心5~20min，棄上清，獲得濕菌體； 54、 往濕菌體中加入5~15ml緩沖溶液，重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 1~0. 5g異丁香酷的錐 形瓶中，蓋上橡膠塞，25~35°C、100~300rpm振蕩反應48~96h ; 55、 反應結束后，加入5~15ml95%乙醇以終止反應，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分 混勾后 5000~8000rpm 離心 IOmin ; 56、 取離心后的上清液，用乙醇稀釋，過濾后得到香草醛。
2. 根據(jù)權利要求1所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述步驟S4中， 錐形瓶中還添加有50~150ul離子溶劑。
3. 根據(jù)權利要求2所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述離子溶劑 為離子液體或深度低共熔溶劑。
4. 根據(jù)權利要求3所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述離子液體 為咪唑型離子液體、銨鹽離子液體或磷鹽離子液體。
5. 根據(jù)權利要求4所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述咪唑型離 子液體為[MMIm] [MeSO4]、[EMIm] [MeSO4]、[BMIm] [MeSO4]或[Me(OEt)3MIm] [Tf2N];所述銨 鹽離子液體為[Choline] [Cl]、[Choline] [H2PO4]、[NMe3] [MeSO3]、[NBu4] [MeSO3]、[NMe3] [H2PO4]或[ETM] [Tf2N];所述磷鹽離子液體為[PBu4] [Ac] 〇
6. 根據(jù)權利要求3所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述深度低共 熔溶劑為膽堿醋酸鹽型DESs或膽堿氯鹽型DESs。
7. 根據(jù)權利要求6所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述膽堿醋酸 鹽型 DESs 為 ChAc/U、ChAc/A、ChAc/G 或 ChAc/EG。
8. 根據(jù)權利要求6所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述膽堿氯鹽 型 DESs 為 ChCl/U、ChCl/A、ChCl/G 或 ChCl/EG。
9. 根據(jù)權利要求1所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述步驟S4中， 錐形瓶中還添加有無機氮源。
10. 根據(jù)權利要求9所述的全細胞催化合成香草醛的方法，其特征在于，所述無機氮源 為尿素。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種全細胞催化合成香草醛的方法，本發(fā)明的反應體系中，通過添加離子溶劑或無機氮源，使得香草醛的產(chǎn)率得到大幅提升，同時通過選用高特異性的菌株CGMCC1347，其高特異性地轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香草醛，減少了副產(chǎn)物的生成，降低了后期分離純化的成本。
【IPC分類】C12P7-24
【公開號】CN104805135
【申請?zhí)枴緾N201510071566
【發(fā)明人】楊縝, 楊桃香
【申請人】深圳大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年2月11日