本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及影響水稻開花期和粒型的烯醇化酶基因OsENO2-2的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻作為重要的糧食作物一直被人們所重視。開花期作為重要的農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量有著密切的聯(lián)系，很多開花期調(diào)控基因直接或間接地影響水稻株高、穗數(shù)、一次枝梗數(shù)及二次枝梗數(shù)等農(nóng)藝性狀。因?yàn)檩^長的生育期往往伴隨著更高的株高和更多的分蘗，所以在作物產(chǎn)量的研究中，經(jīng)常把長生育期和高產(chǎn)聯(lián)系在一起。

開花時(shí)間的調(diào)控是水稻產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵影響因素，其中日照長短是影響水稻開花的一個(gè)重要因素。大部分的水稻品種都是以光照時(shí)間13.5小時(shí)/黑暗條件下10.5h為長短日照的臨界日照長度，日照長度少于13.5小時(shí)則屬于短日照，短日照能夠促進(jìn)水稻開花(Florigen in rice:complex gene network for florigen transcription,florigen activation complex,and multiple functions.Current opinion inplant biology,2013)。Heading date1(Hd1)是水稻中與擬南芥的CONSTANS(CO)同源的基因，它在調(diào)控水稻開花的過程中有著雙重作用，在短日照條件下促進(jìn)開花而在長日照條件下抑制水稻開花(Hd1,a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice,is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS.The Plant cell,2000)。Heading date 3a(Hd3a)是水稻中與擬南芥基因FLOWERING LOCUS T(FT)同源的基因(Hd3a protein is a mobileflowering signal in rice.Science,2007)。Hd1在短日照條件下促進(jìn)Hd3a的表達(dá)，但是在長日照條件下，Hd1是由光敏色素B轉(zhuǎn)換為Hd3a的阻抑物(The molecular basis of diversity in the photoperiodic flowering responses of Arabidopsis and rice.Plant physiology,2004)。同時(shí)Hd1的表達(dá)受到Oryza sativa GIGANTEA(OsGI)的調(diào)控，后者是水稻開花節(jié)律鐘中的關(guān)鍵基因(Adaptation of photoperiodic control pathways produces short-day flowering in rice.Nature,2003)。另外一方面，水稻中存在不依賴Hd1的光誘導(dǎo)途徑。Early heading date1(Ehd1)是受短日照促進(jìn)開花因子OsMADS51促進(jìn)表達(dá)的一個(gè)B型反應(yīng)調(diào)節(jié)子，它可以促進(jìn)Hd3a、RFT1(另外一個(gè)水稻中的FT同源基因)和OsMADS14的表達(dá)，主要是短日照開花調(diào)控的正調(diào)控因子(OsMADS51is a short-day flowering promoter that functions upstream of Ehd1,OsMADS14,and Hd3a.Plant physiology,2007)。而在長日照條件下Ehd1則被Ehd2/OsId1/RID1(Rice Indeterminate1)以及OsMADS50正調(diào)控，被Ghd7(Grain number,plant height and heading date7)負(fù)調(diào)控(Florigen in rice:complex gene network for florigen transcription,florigen activation complex,and multiple functions.Current opinion in plant biology,2013)，Ehd1促進(jìn)Hd3a和RFT1的表達(dá)，從而促進(jìn)MADS14和MADS15的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)水稻開花(A gene network for long-day flowering activates RFT1encoding a mobile flowering signal in rice.Development,2009)。Ehd1和Ghd7的表達(dá)可以通過對日照時(shí)間的微調(diào)控來調(diào)控Hd3a和RFT1的轉(zhuǎn)錄(Florigen in rice:complex gene network for florigen transcription,florigen activation complex,and multiple functions.Current opinion in plant biology,2013)?？偟膩碚f，水稻光周期調(diào)控的主要路徑目前研究得比較清楚，但是其中一些關(guān)鍵基因的調(diào)控機(jī)制研究目前并不完善。

水稻種子的胚乳占精米的90％以上，是水稻直接被食用的部分，也是水稻籽粒大小的決定性因素，胚乳的發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。所以研究與水稻胚乳發(fā)育相關(guān)的基因在實(shí)際生產(chǎn)上也有很重要的意義。

目前的研究發(fā)現(xiàn)水稻淀粉合成的主要場所是淀粉體和葉綠體，光合作用提供其合成原料。水稻籽粒中淀粉的生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的生物化學(xué)過程。葉片光合作用后的產(chǎn)物首先以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)降矸酆铣傻闹饕鞴倥呷榧?xì)胞，轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖(G-1-P)后進(jìn)入造粉體體內(nèi)，分別在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉脫支酶的作用下形成直鏈淀粉和支鏈淀粉(Progress in Key Enzymes of Starch Synthesis in Rice.Chinese Agricultural Science Bulletin,2009)。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成途徑中很重要的酶，超表達(dá)或者反義抑制此酶會(huì)分別使淀粉的含量增加或者減少(One of two different ADP-glucose Pyrophosphorylase Genes from Potato responds strongly to elevated levels of sucrose.Molecular Genetic Genet,1990)。水稻中含有兩個(gè)編碼AGPase大亞基的基因和4個(gè)編碼AGPase小亞基基因，這些基因在淀粉合成的不同時(shí)期發(fā)揮著作用。淀粉合成酶分為兩種，分別是游離于造粉體基質(zhì)中的可溶性淀粉合成酶(SSS)和與淀粉結(jié)合存在的結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)。水稻中總共有5種淀粉合成酶，分別是GBSS、SSSⅠ、SSSⅡ、SSSⅢ和SSSⅣ。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合態(tài)的淀粉合成酶主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。例如，Wx基因編碼的GBSSⅠ是調(diào)控直鏈淀粉合成的關(guān)鍵(水稻蠟質(zhì)基因分子特性的研究.植物生理學(xué)報(bào),1991)。除此之外，淀粉分支酶和脫支酶也會(huì)影響淀粉的發(fā)育(Progress in Key Enzymes of Starch Synthesis in Rice.Chinese Agricultural Science Bulletin,2009)?？傊?，淀粉的合成過程受到多種酶的調(diào)控。

水稻中烯醇化酶基因OsENO2-2目前為止還未見有相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本研究組通過對水稻中烯醇化酶基因OsENO2-2的克隆以及相關(guān)功能研究，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)λ鹃_花時(shí)間有調(diào)控作用，并且對水稻種子的大小也有調(diào)控作用，揭示了該基因在水稻產(chǎn)量方面具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的第一方面，提供一種影響水稻開花期和粒型的烯醇化酶基因OsENO2-2，該基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子而得到基因OsENO2-2的cDNA的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種包括上述cDNA多核苷酸的正義序列或反義序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的第二方面，提供基因OsENO2-2在水稻選育中的應(yīng)用，所述水稻選育為長日照條件下延長水稻開花時(shí)間、增加水稻粒型，從而提高產(chǎn)量。

本發(fā)明的第三方面，提供一種影響水稻開花期和粒型的烯醇化酶基因OsENO2-2轉(zhuǎn)基因植株的檢測試劑盒，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以待檢轉(zhuǎn)基因水稻cDNA為模板，利用所述引物對擴(kuò)增，檢測OsENO2-2基因的表達(dá)量，所述引物對為：

OsENO2-2-QF:5’-GGCCAAGATGCCACAAATGT-3’(SEQ ID NO.2)

OsENO2-2-QR:5’-TTGCCTGTGTAGCCAGCCTTA-3’(SEQ ID NO.3)

Actin-QF：5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’(SEQ ID NO.4)

Actin-QR：5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’(SEQ ID NO.5)

若轉(zhuǎn)基因植株OsENO2-2基因的表達(dá)量與對照中花11相比顯著升高，則說明是轉(zhuǎn)基因陽性植株。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下：

申請人克隆得到水稻烯醇化酶基因OsENO2-2，其cDNA的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。將該基因的完整編碼序列(Coding sequence)構(gòu)建到超表達(dá)載體PU1301(見圖1)，獲得轉(zhuǎn)化載體pU1301-OsENO2-2后直接轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株在長日照條件下開花時(shí)間推遲(見圖2)，種子變大(見圖3)。在轉(zhuǎn)基因植株中檢測開花相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中部分開花相關(guān)基因表達(dá)量較野生型變化顯著(見圖4)，同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因植株胚乳中淀粉合成相關(guān)基因也發(fā)現(xiàn)較野生型有顯著變化(見圖5)。表明本發(fā)明的烯醇化酶基因OsENO2-2可以通過調(diào)控水稻開花相關(guān)基因以及淀粉合成相關(guān)基因來調(diào)控水稻開花時(shí)期和水稻種子的大小。

本發(fā)明通過研究水稻烯醇化酶基因OsENO2-2的超表達(dá)植株具有開花時(shí)間推遲、種子變大的表型，進(jìn)而闡明此基因?qū)λ鹃_花時(shí)間以及淀粉發(fā)育的影響。這對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的研究有著重要的指導(dǎo)意義，為水稻品質(zhì)改良和新品種的選育提供新的方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明構(gòu)建的超量表達(dá)載體PU1301示意圖；

圖2為OsENO2-2基因在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量檢測圖，

WT為中花11陰性對照，OX-1，OX-2，OX-3，OX-4，OX-5，OX-6，OX-8為轉(zhuǎn)基因陽性植株，OX-7為轉(zhuǎn)基因陰性植株；

圖3為OsENO2-2基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的開花時(shí)間表型及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析示意圖，

WT代表陰性對照；OX代表抑制轉(zhuǎn)基因陽性植株；**代表P-Value值小于0.01；

圖4為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株及獲得性突變體在持續(xù)光照14小時(shí)的條件下生長35天后檢測開花相關(guān)基因的表達(dá)，

WT代表陰性對照；OX代表抑制轉(zhuǎn)基因陽性植株；

圖4A表示RFT1在兩種材料中的表達(dá)量；圖4B表示RID1在兩種材料中的表達(dá)量；圖4C表示Hd1在兩種材料中的表達(dá)量；圖4D表示Hd3a在兩種材料中的表達(dá)量；圖4E表示Ehd1在兩種材料中的表達(dá)量；圖4F表示OsGI在兩種材料中的表達(dá)量；圖4G表示Ghd7在兩種材料中的表達(dá)量；

圖5為OsENO2-2基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株種子形態(tài)，

WT代表陰性對照；OX代表超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株；

圖6為OsENO2-2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株胚乳中淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)量檢測，

WT代表陰性對照；OX代表抑制轉(zhuǎn)基因陽性植株。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

【實(shí)施例1】OsENO2-2基因全長cDNA的擴(kuò)增

對本發(fā)明所需要的基因OsENO2-2(基因登錄號LOC_Os06g04510.2)，主要通過RT-PCR方法(參見：J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)進(jìn)行擴(kuò)增，得到OsENO2-2基因全長序列。具體操作如下：

1)抽提來自水稻品種中花11的幼苗葉片的RNA，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)；

2)RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下：

①配制混合液1：總RNA 4μg，DNaseI 2U,10×DNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑)處理水(0.01％DEPC)到10μl，混勻后將混合液1在37℃放置20分鐘以除去DNA；

②20分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘；

③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)；

④將在冰上冷卻的混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘；

⑤配制混合液2：混合液1 10μl，5×first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巰基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC處理水0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)；

⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴3分鐘；

⑦-20℃保存反應(yīng)最終產(chǎn)物。

上述反應(yīng)中用到的試劑全部購自Invitrogen公司。

3)然后根據(jù)RGAP數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)公布的OsENO2-2基因的全長cDNA序列，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增片段。PCR用到的體系為20μl，具體配法為：cDNA第一鏈模板1μl，10×PCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，正向引物和反向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③60℃30秒，④72℃60秒，⑤從②－④循環(huán)35次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。擴(kuò)增出全長序列。

用來克隆OsENO2-2全長的引物如下所示：

OsENO2-2-F(正向引物):

5’---GGGGGTACCATGGTTCAACAGCTTGATGGAA---3’

OsENO2-2-R(反向引物):

5’---GGGGGTACCTTAGTACGGCTCCACAGGGG---3’

4)將擴(kuò)增出的全長連接到T/A克隆載體pGEMT-vector(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)上用T7和SP6引物測序驗(yàn)證。最終得到的OsENO2-2基因的全長cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-1062位所示。

【實(shí)施例2】超表達(dá)載體PU1301-OsENO2-2的構(gòu)建

具體步驟如下：

1)將帶有OsENO2-2片段(如序列表SEQ ID NO：1中第1-1062位所示)的T/A克隆用KpnI單酶切，回收目標(biāo)條帶，與KpnI單酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒PU1301(見圖1)連接，pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26,a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37:517-527)基礎(chǔ)上改造的，是攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠贈(zèng)。內(nèi)切酶KpnI和連接所使用的T4連接酶均購自寶生物工程大連有限公司，用法及用量按照該公司提供的產(chǎn)品說明書。

2)連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見儀器說明書)導(dǎo)入大腸桿菌DH10B(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(購自羅氏生物公司產(chǎn)品)的LA(LA配方參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)LA抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)。

3)將LA抗性培養(yǎng)基上長出的單菌落在超凈工作臺接種于滅菌的10ml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基，然后在37℃搖床上培養(yǎng)16-18小時(shí)。按照(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)所述的方法抽提質(zhì)粒，用KpnI單酶切和PCR檢測，根據(jù)插入片段的大小獲得陽性的超表達(dá)質(zhì)粒載體將其命名為PU1301-OsENO2-2。

4)把步驟3)的超表達(dá)載體PU1301-OsENO2-2通過電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻(xiàn)和使用的電壓參數(shù)按照本實(shí)施例步驟2)的方法進(jìn)行)導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(購自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室)菌株中，將轉(zhuǎn)化后的菌株命名為T-OsENO2-2。

【實(shí)施例3】雙元Ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽性和表達(dá)量檢測：

具體步驟如下：

1)將T-OsENO2-2向水稻受體品種“中花11”(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照Hiei等人報(bào)道的方法(Hiei等,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282)進(jìn)行。所獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植株命名為OsENO2-2-n，其中n＝1,2,3…代表轉(zhuǎn)基因的不同家系。

2)取T0代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。然后用PCR方法對T0代轉(zhuǎn)化植株用潮霉素引物進(jìn)行陽性檢測。潮霉素引物的序列如下：Hn-F5'-agaagaagatgttggcgacct-3'，Hn-R 5'-gtcctgcgggtaaatagctg-3'(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)總體積為20μl，具體配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0.4μl，TAQ酶0.2μl加去離子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃2.5分鐘，⑤從②－④循環(huán)32次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。因?yàn)槌泵顾鼗驗(yàn)檗D(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出潮霉素基因特異帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽性植株。對T0代陽性植株收種子(T1代)，為T1代的大田種植和性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。

3)為了檢測超表達(dá)植株中的目標(biāo)基因的表達(dá)量，申請人采用Real-time PCR的方法對轉(zhuǎn)基因T0代植株進(jìn)行了表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)所用的總RNA來自分蘗期的水稻葉片，RNA抽提用的試劑是采用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒說明書)；按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測OsENO2-2的表達(dá)量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見說明書。PCR儀為美國ABI公司的7500，PCR參數(shù)為95℃預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個(gè)循環(huán)。Real-time-PCR所用引物序列為：

OsENO2-2-QF:5’-GGCCAAGATGCCACAAATGT-3’

OsENO2-2-QR:5’-TTGCCTGTGTAGCCAGCCTTA-3’

Actin-QF：5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’

Actin-QR：5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’

最終得到的T0代轉(zhuǎn)基因植株中OsENO2-2表達(dá)結(jié)果見圖2。OX-1到OX-8為最終得到的8個(gè)轉(zhuǎn)基因家系，其中OX-7為轉(zhuǎn)基因陰性植株，Realtime-PCR結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因材料中，OsENO2-2的表達(dá)與野生型中花11相比，上升倍數(shù)低的如OX-4較野生型上升了約3倍，上升倍數(shù)高的如OX-1上升了約35倍左右，多數(shù)家系上升至少15倍，說明超表達(dá)效果很好。

在本實(shí)施例中，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(文獻(xiàn)參見：Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282)報(bào)道的主要步驟，培養(yǎng)基以及使用的試劑主要參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)授權(quán)專利(專利號ZL200710053552.9，發(fā)明的名稱：水稻廣親和基因S5的分離克隆及應(yīng)用；專利公開日：2008年6月18日；公開號：CN101200725；專利授權(quán)日：2010年04月21日)，本發(fā)明實(shí)施例的步驟與上述文獻(xiàn)的不同之處在于：愈傷組織洗滌和選擇培養(yǎng)(抗性篩選)方法。本發(fā)明該階段的操作步驟是：

(1)用無菌水洗滌水稻愈傷組織至看不見農(nóng)桿菌。

(2)將愈傷組織浸泡在含400mg/L羧芐青霉素(CN)的無菌水中30分鐘。

(3)將該愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅菌好的濾紙上，使該愈傷組織不帶水。

(4)轉(zhuǎn)移愈傷組織至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周(第一次潮霉素的濃度為400毫克/升，第二次及以后潮霉素的濃度為250毫克/升)。

最終本發(fā)明總共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因水稻超表達(dá)材料T0代8株。

【實(shí)施例4】轉(zhuǎn)基因植株開花性狀調(diào)查和開花相關(guān)基因的表達(dá)分析

1)將本發(fā)明T0代陽性植株(即OsENO2-2基因表達(dá)量上升的植株)收種子(T1代)種入大田進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株均有不同程度的表型，具體表現(xiàn)為開花期推遲表型(圖3)，統(tǒng)計(jì)T1代1,2,3,7四個(gè)家系各20株以及中花11(ZH11)對照20株，四個(gè)家系分別與中花11(ZH11)對照進(jìn)行單因素?cái)?shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果如圖3，其中OX-1，OX-2，OX-3，OX-7代表轉(zhuǎn)基因不同家系，*代表差異顯著，P<0.05；**代表差極異顯著，P<0.01。具體見圖3。

2)為了驗(yàn)證OsENO2-2長日照條件下調(diào)控水稻開花時(shí)間，我們將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在長日照14小時(shí)的條件下在光照培養(yǎng)箱中處理35天后，每四小時(shí)取一次樣，取樣部位為植株最頂端3片葉子，抽提葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測開花相關(guān)基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用的總RNA來自所取的葉片，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測開花相關(guān)基因的表達(dá)量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見說明書。PCR儀為美國ABI公司的7500，PCR參數(shù)為95℃預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個(gè)循環(huán)。

表達(dá)結(jié)果見圖4所示，其中RFT1在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)量顯著降低，RID1，Hd3a、Ehd1、Hd1、OsGI、Ghd7表達(dá)量在野生型和超表達(dá)材料中基本沒有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明開花途徑上的重要基因RFT1受到OsENO2-2的調(diào)控，OsENO2-2在調(diào)控水稻開花過程中有著重要的作用。

Real-time PCR所用引物序列如下所示：

RFT1QF 5’-TGGTGTTCGTGCTGTTCCA-3’，

RFT1QR 5’-TTGTAGAGCTCGGCGAAGTTC-3’；

RID1QF 5’-CGACGACAATAGCTCGATCGC-3’，

RID1QR 5’-GTGCATGGTCACGGAGCCTT-3’；

Hd3a QF 5’-GCTCACTATCATCATCCAGCATG-3’，

Hd3a QR 5’-CCTTGCTCAGCTATTTAATTGCATAA-3’；

Hd1QF 5’-TCAG CAACAGCATATCT TTCTCATCA-3’，

Hd1QR 5’-TCTGGAATTTGGCTATACTATCACC-3’；

Ehd1QF 5’-GGATGCAAGGAAATCATGGA-3’，

Ehd1QR 5’-AATCCCATCGGAAATCTTGG-3’；

OsGI QF 5’-TGGAGAAAGGTTGTGGATGC-3’，

OsGI QR 5’-GATAGACGGCACTTCAGCAGAT-3’；

Ghd7QF 5’-AAATCCGGTACGCGTCCAG-3’，

Ghd7QR 5’-GACATAGGTGGATGGCGGTG-3’；

ActinQF 5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’，

ActinQR 5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’。

其中RFT1QF、RFT1QR是用于RFT1基因定量PCR檢測的引物；RID1QF、RID1QR是用于RID1基因定量PCR檢測的引物；Hd3a QF、Hd3a QR是用于Hd3a基因定量PCR檢測的引物；Hd1QF、Hd1QR是用于Hd1基因定量PCR檢測的引物；Ehd1QF、Ehd1QR是用于Ehd1基因定量PCR檢測的引物；OsGIQF、OsGI QR是用于OsGI基因定量PCR檢測的引物；Ghd7QF、Ghd7QR是用于Ghd7基因定量PCR檢測的引物；Actin QF、Actin QR是用于Actin基因定量PCR檢測的引物。

【實(shí)施例5】轉(zhuǎn)基因植株種子性狀調(diào)查和淀粉合成基因的表達(dá)分析

收取T2代超表達(dá)陽性植株以及野生型植株種子時(shí)發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)植株種子和野生型種子各取30粒時(shí)，超表達(dá)植株種子明顯大于野生型植株種子(圖5)，在野生型對照中花11和OsENO2-2超表達(dá)植株的雌配子授粉3天之后，取授粉3天的籽粒，按照實(shí)施例1中抽提RNA的方法抽提RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按照實(shí)施例3中Realtime-PCR的方法檢測淀粉合成基因的表達(dá)量。檢測結(jié)果見圖6，OsSSI、OsSSIIa、OsSSIIc、OsSSIIIa在超表達(dá)植株中表達(dá)量顯著增高，其他基因表達(dá)量在兩種材料中變化不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsENO2-2可以通過調(diào)控部分淀粉合成相關(guān)基因來調(diào)控水稻種子的大小。

Real-time PCR所用引物序列如下：

OsSSI-QF:5’-GGGCCTTCATGGATCAACC-3’

OsSSI-QR:5’-CCGCTTCAAGCATCCTCATC-3’

OsSSIIa-QF:5’-GCTTCCGGTTTGTGTGTTCA-3’,

OsSSIIa-QR:5’-CTTAATACTCCCTCAACTCCACCAT-3’

OsSSIIb-QF:5’-TAGGAGCAACGGTGGAAGTGA-3’

OsSSIIb-QR:5’-GTGAACGTGAGTACGTGACCAAT-3’

OsSSIIc-QF:5’-GACCGAAATGCCTTTTTCTCG-3’

OsSSIIc-QR:5’-GGGCTTGGAGCCTCTCCTTA-3’

OsSSIIIa-QF:5’-GCCTGCCCTGGACTACATTG-3’

OsSSIIIa-QR:5’-GCAAACATATGTACACGGTTCTGG-3’

OsSSIIIb-QF:5’-ATTCCGCTCGCAAGAACTGA-3’

OsSSIIIb-QR:5’-CAACCGCAGGATAACGGAAA-3’

OsSSIVa-QF:5’-GGGAGCGGCTCAAACATAAA-3’

OsSSIVa-QR:5’-CCGTGCACTGACTGCAAAAT-3’

OsSSIVb-QF:5’-ATGCAGGAAGCCGAGATGTT-3’

OsSSIVb-QR:5’-ACGACAATGGGTGCCAAGAT-3’。

其中OsSSI-QF、OsSSI-QR是用于OsSSI基因定量PCR檢測的引物；OsSSIIa-QF、OsSSIIa-QR是用于OsSSIIa基因定量PCR檢測的引物；OsSSIIb-QF、OsSSIIb-QR是用于OsSSIIb基因定量PCR檢測的引物；OsSSIIc-QF、OsSSIIc-QR是用于OsSSIIc基因定量PCR檢測的引物；OsSSIIIa-QF、OsSSIIIa-QR是用于OsSSIIIa基因定量PCR檢測的引物；OsSSIIIb-QF、OsSSIIIb-QR是用于OsSSIIIb基因定量PCR檢測的引物；OsSSIVa-QF、OsSSIVa-QR是用于OsSSIVa基因定量PCR檢測的引物；OsSSIVb-QF、OsSSIVb-QR是用于OsSSIVa基因定量PCR檢測的引物。

SEQUENCE LISTING

<110> 江漢大學(xué)

<120> 影響水稻開花期和粒型的烯醇化酶基因OsENO2-2及其應(yīng)用

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atggttcaac agcttgatgg aacctccaac aactggggct ggtgcaaaca aaagcttgga 60

gcaaatgcta ttcttgctgt ttcacttgct gtgtgcaaag caggagccat ggtgaagaag 120

attccccttt accagcacat tgcaaatctt gctggaaaca agactctcgt gctgcctgta 180

cccgctttca atgtgatcaa tggaggatcc catgctggaa acaaacttgc catgcaggag 240

ttcatgatcc tccctactgg tgcatcctct ttcaaggagg ccatgaagat gggagttgag 300

gtgtaccacc acttgaagag tataatcaag aaaaagtatg gccaagatgc cacaaatgtg 360

ggggatgaag gtggctttgc tcctaacatt caggaaaaca aagagggcct cgaactgttg 420

aaggccgcaa tagctaaggc tggctacaca ggcaaagtgg tcataggaat ggatgttgca 480

gcttctgaat tttacagtga aaaggacaag acttacgatc ttaacttcaa ggaggataac 540

aacgacggtt cacacaaaat ttcaggtgac agcctgaaag atgtgtacaa gtcctttgtt 600

tctgagtacc ctattgtgtc gatcgaagat ccattcgatc aggatgactg ggctacctat 660

gccaagctta ctgatgagat tggacagcaa gtgcagattg ttggggatga ccttcttgtt 720

actaatccca caagggttgc caaggcaatt agtgaaaaga cttgcaatgc tcttctcttg 780

aaggtgaatc aaataggctc agttactgag agcattgagg ctgttagaat gtccaagcgt 840

gctggatggg gagtgatggc aagccatagg agtggtgaga cagaggatac cttcattgct 900

gacctctcag ttggtctgtc tacgggtcaa attaagacag gagctccctg tcggtcagag 960

cgtctggcta aatacaacca gctgctcagg atagaagaag agctgggcga tgctgcagtt 1020

tacgctggag aaaaattcag agcccctgtg gagccgtact aa 1062

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggccaagatg ccacaaatgt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgcctgtgt agccagcctt a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtatgccag tggtcgtacc a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccagcaaggt cgagacgaa 19

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggggtacca tggttcaaca gcttgatgga a 31

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggggtacct tagtacggct ccacagggg 29

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agaagaagat gttggcgacc t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcctgcggg taaatagctg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggtgttcgt gctgttcca 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgtagagct cggcgaagtt c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgacgacaat agctcgatcg c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgcatggtc acggagcctt 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctcactatc atcatccagc atg 23

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccttgctcag ctatttaatt gcataa 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcagcaacag catatctttc tcatca 26

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tctggaattt ggctatacta tcacc 25

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggatgcaagg aaatcatgga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aatcccatcg gaaatcttgg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tggagaaagg ttgtggatgc 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gatagacggc acttcagcag at 22

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaatccggta cgcgtccag 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacataggtg gatggcggtg 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gggccttcat ggatcaacc 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccgcttcaag catcctcatc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcttccggtt tgtgtgttca 20

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cttaatactc cctcaactcc accat 25

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

taggagcaac ggtggaagtg a 21

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtgaacgtga gtacgtgacc aat 23

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gaccgaaatg cctttttctc g 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gggcttggag cctctcctta 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcctgccctg gactacattg 20

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcaaacatat gtacacggtt ctgg 24

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

attccgctcg caagaactga 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

caaccgcagg ataacggaaa 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggagcggct caaacataaa 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccgtgcactg actgcaaaat 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

atgcaggaag ccgagatgtt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

acgacaatgg gtgccaagat 20