本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種突變的COL4A5基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：Alport綜合征(alportsyndrome，AS)是一種以進(jìn)行性腎功能減退和腎小球基底膜結(jié)構(gòu)異常伴神經(jīng)性耳聾和眼病為臨床特征的遺傳性腎病。目前認(rèn)為AS有三種遺傳方式：X連鎖顯性遺傳(XL；約占80％)，常染色體隱性遺傳(AR；約占15％)和常染色體顯性遺傳(AD；極少數(shù))，分別由編碼Ⅳ型膠原不同α鏈的基因COL4A5(或COL4A5和COL4A6)、COL4A3和(或)COL4A4突變所致。X連鎖遺傳致病基因有COL4A5(或COL4A5和COL4A6)，COL4A5定位于Xq22，是與AS聯(lián)系最緊密的基因，自第一個(gè)COL4A5突變發(fā)現(xiàn)以來，已有400多種基因突變在歐洲、亞洲地區(qū)和美國相繼報(bào)道，突變類型多種多樣。COL4A6和COL4A5基因頭對頭相鄰位于X染色體上，有學(xué)者認(rèn)為單獨(dú)的COL4A6基因突變不會(huì)導(dǎo)致AS的發(fā)生。目前還沒有發(fā)現(xiàn)COL4A6基因單獨(dú)的變異的情況，COL4A6基因突變均伴有COL4A5基因異常，出現(xiàn)AS伴彌漫性平滑肌瘤。常染色體遺傳致病基因有COL4A3和(或)COL4A4。這些患者既可為該基因突變的復(fù)合雜合子或純合子，又可為雜合子。文獻(xiàn)報(bào)告的所檢測得到的COL4A3基因突變均為點(diǎn)突變，且突變位置分布于整個(gè)基因、無明顯的熱點(diǎn)突變，突變類型多種多樣。已報(bào)道的在AR的AS家系中發(fā)現(xiàn)的COL4A4基因突變也均為點(diǎn)突變，且突變位置分布于整個(gè)基因、無明顯的熱點(diǎn)突變，突變類型多種多樣。由于AS具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，傳統(tǒng)的Sanger基因檢測方法需要消耗大量的時(shí)間與成本。因此，開發(fā)高效、快捷、經(jīng)濟(jì)、可同時(shí)對多個(gè)已知致病基因進(jìn)行突變檢測的方法對其臨床診斷非常重要。明確受檢人的致病基因和突變，實(shí)現(xiàn)對AS的準(zhǔn)確診斷、個(gè)性化治療以及產(chǎn)前診斷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對AS，提供一種突變的基因COL4A5。本發(fā)明的另一目的在于提供該基因在制備AS診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于檢測Alport綜合征的突變的COL4A5基因，COL4A5基因的突變使編碼的IV型膠原α5第1371位絲氨酸突變?yōu)榻K止子，導(dǎo)致截短的IV型膠原α5鏈。所述的突變的COL4A5基因，野生型COL4A5基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因編號(hào)為：ENSG00000188153，突變的COL4A5基因在物理位置107925013處堿基C缺失，導(dǎo)致移碼框偏移，產(chǎn)生了提前的終止子，其他部分與野生型相同。一種突變的IV型膠原蛋白α5鏈，野生型IV型膠原蛋白α5鏈在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因轉(zhuǎn)錄本編號(hào)為：NM_033380.2，突變的IV型膠原蛋白α5鏈在該野生型蛋白的第1371位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榻K止子,其他部分與野生型相同。本發(fā)明所述的突變的COL4A5基因或者所述的突變的IV型膠原蛋白α5鏈在制備Alport綜合征疾病檢測試劑或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。所述的檢測試劑優(yōu)選：引物或引物對、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多種。所述的檢測設(shè)備進(jìn)一步優(yōu)選包括含有檢測突變的COL4A5基因的基因芯片的檢測平臺(tái)。一種檢測Alport綜合征的試劑盒，所述的試劑盒包括：(a)檢測COL4A5基因物理位置為107925013核苷酸位點(diǎn)的試劑；或檢測IV型膠原α5鏈第1371位氨基酸位點(diǎn)的試劑；(b)說明書。所述的試劑優(yōu)選引物或引物對、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多種。所述的試劑進(jìn)一步優(yōu)選基于深度測序?yàn)槠脚_(tái)的基因芯片雜交探針。其中，檢測COL4A5基因物理位置為107925013處核苷酸位點(diǎn)的雜交探針序列可以自行設(shè)計(jì),也可以直接委托商業(yè)機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)合成。這些探針序列的設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。一種以深度測序?yàn)槠脚_(tái)篩查AS患者中COL4A5基因突變的方法，包括以下步驟：(1)建立AS患者家系臨床與遺傳資源庫，收集AS家系的臨床資料及血液標(biāo)本，提取基因組DNA；(2)設(shè)計(jì)用于檢測COL4A5基因突變的雜交探針，并將其整合到基因芯片上；(3)利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序；(4)對測序結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化的生物信息學(xué)分析，篩選到一個(gè)新的AS致病突變?yōu)镃OL4A5；NM_033380.2c.4112delC；p.Ser1371*。在基因水平上，該突變是位于X染色體上COL4A5基因的物理位置為107925013(Ensemble數(shù)據(jù)庫)處的堿基C缺失；在RNA水平上，該突變導(dǎo)致COL4A5基因編碼的RNA第4112位的堿基C缺失；在蛋白水平上，COL4A5基因編碼蛋白第1371位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榻K止子。其中，步驟(2)所述的基因芯片優(yōu)選Roche-NimbleGen公司生產(chǎn)的基因芯片。步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序優(yōu)選利用美國Illumina公司的Hi-seq2000儀器完成。步驟(3)步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序優(yōu)選利用美國Illumina公司的Hi-seq2000儀器完成。步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序優(yōu)選流程為：將基因組DNA片段化，在DNA末端標(biāo)記“A”并與IlluminaPE接頭-寡核苷酸混合物相連接；連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫，并將DNA文庫與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗脫、純化，獲得編碼序列；創(chuàng)建配對末端，在IlluminaHiSeqTM2000平臺(tái)上對目標(biāo)序列進(jìn)行測序。有益效果1.AS是常見的、嚴(yán)重的導(dǎo)致終末期腎病的疾病。挖掘AS的新致病突變和新致病基因有利于進(jìn)一步探索AS的分子遺傳學(xué)病因，是充分利用我國的腎臟病科的AS資源，造福AS患者的現(xiàn)實(shí)需要，是后基因組時(shí)代最重要的研究方向之一。本專利旨在探索AS的遺傳學(xué)病因，從而幫助了解發(fā)病機(jī)制、輔助臨床診斷、產(chǎn)前診斷和轉(zhuǎn)基因治療。2.大量研究證實(shí)，IV型膠原基因的突變能夠引起AS,本專利的候選基因涵蓋了4個(gè)已知致病的基因(COL4A3，COL4A4和COL4A5和COL4A6)，這些基因均是由申請人在多年從事遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)上查閱大量文獻(xiàn)所篩選出的，通過本發(fā)明方法的到進(jìn)一步明確了這些基因不同類型的突變與AS的關(guān)系。3.AS具有顯著的遺傳異質(zhì)性，目前已知致病基因3個(gè)，仍存在大量未知的致病突變，應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)研究顯然具有很大的局限性。本發(fā)明提供了AS新的致病基因的致病位點(diǎn)，為該疾病的診斷提供了新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。附圖說明圖1挖掘致病基因新突變的技術(shù)路線圖2深度測序流程圖3家系圖圖4測序峰圖具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)方法：1.AS遺傳資源庫的建立。1.1收集以下三類AS患者的臨床資料及血液標(biāo)本：1.1.13代或超過3代的X染色體連鎖顯性遺傳的AS家系。1.1.2收集X染色體連鎖顯性遺傳的小家系。1.1.3收集無家族史的IV型膠原蛋白α5鏈染色陰性的散發(fā)病例。1.2提取基因組DNA：采用TIANamp血液DNA抽提試劑盒(TiangenBiotechCo.Ltd,Beijing,China)，按照廠家提供的protocol從采集到的病人外周血中提取病人的基因組DNA。2.挖掘AS已知致病基因COL4A5的新突變。2.1設(shè)計(jì)并定制AS相關(guān)基因捕獲芯片：2.1.1候選基因的選擇：該基因捕獲芯片涵蓋了目前文獻(xiàn)已報(bào)道的導(dǎo)致AS的四個(gè)基因：COL4A3、COL4A4、COL4A5和COL4A6，其在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因編號(hào)如下表所示?；蚧蚓幪?hào)COL4A3ENSG00000169031COL4A4ENSG00000081052COL4A5ENSG00000188153COL4A6ENSG00000197565注：以上信息均來自Ensemble數(shù)據(jù)庫(www.ensembl.org)，可輸入基因編碼檢索基因詳細(xì)信息及基因序列。2.1.2轉(zhuǎn)錄本的選擇：針對不同基因選擇特定的轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)基因均含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在選擇轉(zhuǎn)錄本時(shí)，我們的原則是：首先考慮擁有CCDS編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本，若一個(gè)基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本均編碼蛋白，則首選含氨基酸數(shù)最多的蛋白相對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，若多個(gè)轉(zhuǎn)錄本氨基酸含量相同，則進(jìn)一步選擇含堿基數(shù)最多的轉(zhuǎn)錄本。據(jù)以上原則，我們所篩選出的IV型膠原基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄本分別是：基因轉(zhuǎn)錄本編號(hào)COL4A3NM_000091.4COL4A4NM_000092.4COL4A5NM_033380.2COL4A6NM_001847.2注：以上信息均來自Ensemble數(shù)據(jù)庫(www.ensembl.org)，可輸入轉(zhuǎn)錄本編碼檢索轉(zhuǎn)錄本詳細(xì)信息。2.1.3雜交探針的設(shè)計(jì)：申請人根據(jù)挑選出的不同轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)雜交探針，并由Roche-NimbleGen公司定制。雜交探針的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：(1)探針覆蓋所有候選基因的目標(biāo)區(qū)域，即外顯子區(qū)域以及外顯子和內(nèi)含子拼接處(外顯子上下游各100個(gè)bp)；(2)去除重復(fù)序列：對于在基因組出現(xiàn)的高度重復(fù)序列以及在人類基因組中出現(xiàn)2-5倍的較低頻率的重復(fù)片段，我們予以去除，避免捕獲其他同源基因，增加假陽性，從而降低檢測效率。申請人將所有候選基因的目標(biāo)區(qū)域與人類基因組DNA序列進(jìn)行比對，共刪除了2.5％的重復(fù)序列；(3)在探針設(shè)計(jì)過程中，我們對臨近的外顯子進(jìn)行了特定的整合，其相鄰探針整合標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)相鄰?fù)怙@子的綜合目標(biāo)區(qū)域(即前個(gè)外顯子的上游100bp起至后一個(gè)外顯子的下游100bp止)總和小于600bp，即將其整合為一個(gè)探針，以求通過一對探針完成多對外顯子區(qū)域的捕獲；(4)當(dāng)所設(shè)計(jì)探針序列小于250bp時(shí)，在其兩端各包含上下游100bp的內(nèi)含子的基礎(chǔ)上，分別再增加相同堿基數(shù)的內(nèi)含子，使探針大小達(dá)到250bp。設(shè)計(jì)用于篩選AS致病基因COL4A5的雜交探針序列(Configuration:0200162535,Hoffmann-LaRoche)。2.2目標(biāo)區(qū)域捕獲及深度測序(見圖2)：首先將基因組DNA片段化，并在DNA末端標(biāo)記“A”，與IlluminaPE接頭-寡核苷酸混合物相連接，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫。然后將DNA文庫與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗脫、純化，獲得編碼序列。最后創(chuàng)建配對末端，在IlluminaHiSeqTM2000平臺(tái)上對目標(biāo)序列進(jìn)行測序。2.3對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出候選致病基因：2.3.1采用Mosaik軟件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/Mosaik)處理Illumina原始測序數(shù)據(jù)(配對末端數(shù)據(jù))，產(chǎn)生.bam類型文件。將.bam文件輸入GATK，利用GATK檢測單核苷酸變異體(singlenucleotidevariant)和小的插入或缺失(insertion/deletions)，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，便于下游的生物信息學(xué)分析，最后產(chǎn)生.vcf類型文件。2.3.2將患者的測序結(jié)果在包括dbSNP132(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.)，HapMap計(jì)劃(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000GenomeProject(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)以及ExomeVariantServer(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在內(nèi)的五個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫中篩查，濾過所有已知的SNP位點(diǎn)；2.3.3將患者的測序結(jié)果所對應(yīng)的基因序列進(jìn)行比較和分析，優(yōu)先分析插入/缺失突變、無義突變和錯(cuò)義突變，結(jié)果可分為三類，包括已知突變、其它基因的新突變和COL4A5基因的新突變。2.4經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，鑒定致病基因：PCR法分別針對篩選出的突變位點(diǎn)及鄰近DNA序列在相應(yīng)家系中進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物序列采用Primer5(http://frodo.wi.mit.edu/)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。所用PCR的反應(yīng)體系(20μL體系)為：5*buffer4μL，25mMMgCl22μL，DNA1μL，上游引物F(SEQIDNO.1)1μL，下游引物R(SEQIDNO.2)1μL，10mMdNTP0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH2O10.5μL。PCR反應(yīng)程序：98℃5min，35個(gè)循環(huán)(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。3％瓊脂糖凝膠電泳檢測，與紫外線切膠儀下切取PCR產(chǎn)物凝膠并純化。對所有的PCR產(chǎn)物分別以正、反向引物送深圳華大基因公司測序。并對測序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，使用NCBI在線對比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假陽性結(jié)果，并篩選出在家族中共分離的突變位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：申請人對已收集的來自20個(gè)不同遺傳類型的AS家系的20位先證者通過上述目標(biāo)區(qū)域測序的方法檢測其致病基因，得到以下初始實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1和2)：表1表2aFr.1：Frequencyin1000genomedatabasebFr.2：FrequencyindbSNPdatabasecFr.3：EFrequencyinBGIin-housedatabasedefClassification:N.P(notpredicted),D(Damaging)andB(Benign)；US(uncertainsignificance).COL4A3referencetranscriptNM_000091.4；COL4A4referencetranscriptNM_000092.4；COL4A5referencetranscriptNM_033380ThecriteriaofclinicalsignificancearebasedonAmericanCollegeofMedicalGenetics注：以上突變位點(diǎn)為突變堿基在Ensemble數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的物理位置；突變類型中，Het代表雜合突變，Hom代表純合突變。以上述表格中COL4A5在IID18患者家系中的突變驗(yàn)證為例，詳細(xì)闡述突變驗(yàn)證相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.臨床資料1.1家系圖(見圖3)1.2家族中先證者臨床資料：24h尿蛋白8.52g，尿紅細(xì)胞100萬/ml，血肌酐1.31mg/dl,純音測聽雙耳均從500HZ起下降。腎組織免疫熒光IV型膠原染色α3、α5鏈均缺失。家系驗(yàn)證結(jié)果：我們從先證者及相關(guān)家庭成員的血液中提取基因組DNA，通過對先證者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，我們發(fā)現(xiàn)了COL4A5基因NM_033380.2(COL4A5):c.4112delC(p.S1371*)，該基因相關(guān)的突變從未在AS患者中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證證實(shí)該突變位點(diǎn)在該家族中表現(xiàn)為共分離(見圖4)，且我們在正常人對照中篩選未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變。根據(jù)我們所設(shè)計(jì)的篩選流程，借助我們所設(shè)計(jì)的基因芯片及深度測序技術(shù)，并經(jīng)過Sanger驗(yàn)證我們成功證實(shí)該突變位點(diǎn)COL4A5p.S1371*為新的AS致病位點(diǎn)。<110>中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院<120>一種突變的COL4A5基因及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物F<400>1ggacaagcacagcaagcaaa20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游引物R<400>2gatgggttgataggtgcagc20當(dāng)前第1頁1 2 3