專利名稱：一種白介素－4突變基因il－4－13121及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)，具體地說是一種白介素-4突變基因IL-4(13D121E)及其制備和應(yīng)用(該突變基因和細(xì)胞毒素的融合基因IL-4(13D121E)-PE38KDEL)。
背景技術(shù)：
IL-4是激活的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。人類成熟的IL-4是一條由129個氨基酸構(gòu)成的多肽鏈，分子量為1.4kDa(Yokota，T.，Otsuka，T.，Mosmann，T.，Banchereau，J.，DeFrance，T.，Isolation and characterization of a human interleukin cDNAclone，homologous to mouse B-cell stimulatory factor 1，thatexpresses B-cell-and T-celt-stimulating activities.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986，83(16)，5894-5898)。
研究表明，IL-4受體(IL-4R)在許多腫瘤細(xì)胞的表面表達(dá)量很高，而在正常組織細(xì)胞表面，IL-4表達(dá)量很少或沒有，利用這一區(qū)別，可以將IL-4R作為腫瘤治療的靶子，將IL-4和細(xì)胞毒素分子連接得到融合基因。其中，IL-4可以引導(dǎo)整個免疫毒素分子到達(dá)IL-4R的部位，經(jīng)一系列作用后，毒素分子可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮殺傷作用。
IL-4R有三種存在方式。I型IL-4R由兩條肽鏈組成，IL-4Rα和IL-2Rγ，主要存在于T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血癌細(xì)胞表面。II型IL-4R由IL-4Rα和IL-13Rα1組成，存在于大多數(shù)實體瘤細(xì)胞表面，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、愛滋病相關(guān)的卡波西肉瘤、頭頸癌、腎細(xì)胞瘤等。III型IL-4R由IL-4Rα、IL-2Rγ和IL-13Rα1共同組成，主要存在于B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞表面。
細(xì)胞毒素是指超抗原(如葡萄球菌腸毒素A)，核糖體延伸因子-2抑制劑(如綠膿桿菌外毒素A(PEA)，白喉毒素DT，蓖麻毒素等)及其突變體。綠膿桿菌外毒素A(PEA)為單鏈蛋白，全長為613個氨基酸，目前有多種形式的突變體。
最近幾年用于抗腫瘤的導(dǎo)向藥物的研究，有IL-4和綠膿桿菌外毒素A的融合蛋白，用于治療一些實體瘤，如括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和卡波西肉瘤(Raj K.Puri，Development of a RecombinantInterlekin-4-Pseudomonas Exotoxin for Therapy Glioblastoma.Toxicologic Pathology.vol.27.nol.pp.53-57，1999)；IL-4和白喉桿菌毒素的融合蛋白也有報道(Daniel A.Vallera，Ni Jin，James M.R.Baldrica，et.al.Retrovital Immunotoxin Gene Therapy of Acute melogenousleukemia in Mice Using Cytotoxic T Cells Transduced with anInterleukin 4/Diphtheria Toxin Gene.Cancer Research.60，976-984，F(xiàn)ebruary15，2000)盡管如此，該類免疫毒素對正常組織仍有一定毒副作用，這主要是因為少量的IL-4仍有可能與正常組織結(jié)合，因此，進(jìn)一步提高IL-4對腫瘤細(xì)胞的親和力和選擇性是解決這一問題的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種親和力高、選擇性強的白介素-4突變基因IL-4(13D121E)及其制備和應(yīng)用；IL-4(13D121E)是一種新的突變基因，其表達(dá)可用于抗腫瘤靶向藥物。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種白介素-4突變基因IL-4(13D121E)，具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列。
白介素-4突變基因IL-4(13D121E)的制備，以人的IL-4基因為模板，通過三輪overlap PCR進(jìn)行基因重組和點突變。第一輪PCR反應(yīng)擴增出相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37，(其中GGNGG為-Gly-Gly-Asn-Gly-Gly-)；第二輪PCR反應(yīng)在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸處引入一個點突變(13Thr→Asp)；第三輪PCR反應(yīng)在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第121位氨基酸處引入一個點突變(121Arg→Glu)。
白介素-4突變基因IL-4(13D121E)常用于和細(xì)胞毒素連接獲得融合基因；所述細(xì)胞毒素是指超抗原(如葡萄球菌腸毒素A)，核糖體延伸因子-2抑制劑(如綠膿桿菌外毒素A(PEA)，白喉毒素DT，蓖麻毒素等)，或它們的其突變體；根據(jù)細(xì)胞毒素的性質(zhì)，白介素-4突變體可位于融合基因的N端或者C端。
一種綠膿桿菌外毒素A突變基因PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO2中堿基序列。
白介素-4突變基因IL-4(13D121E)和綠膿桿菌外毒素A突變基因的融合基因IL-4(13D121E)-PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO3中堿基序列；其制備是以IL-4(13D121E)和PE38KDEL突變基因為基礎(chǔ)，通過連接物5′AGCTCACATATGGCCGAG 3′制得融合基因；IL-4基因在融合基因的5′端，PEA基因在融合基因的3′端，即IL-4的C端通過肽連接物與PEA的N端相連接；Linker相對應(yīng)的肽為SSHMAE，-Ser-Ser-His-Met-Ala-Glu-。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.白介素-4突變基因IL-4(13D121E)為人工制備的一種新基因，屬首次制得的基因，該基因與其它分子組成融合基因后不影響本身的IL-4的活性位點發(fā)揮作用。
2.IL-4(13D121E)-PE38KDEL為人工制備的一種新的融合基因，屬首次制得的基因，該基因的表達(dá)可用于抗腫瘤靶向藥物的研究。
3.IL-4(13D121E)-PE38KDEL表達(dá)的融合蛋白與IL-4R的親和力高，并可以選擇性地與I型IL-4R結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號，從而殺傷表面含有I型IL-4R的T、B淋巴細(xì)胞、血癌細(xì)胞。
4.應(yīng)用本發(fā)明，可進(jìn)一步提供直接用于生產(chǎn)融合蛋白IL-4(13D121E)-PE38KDEL的工程菌株。
5.本發(fā)明提供了一種制備IL-4(13D121E)和細(xì)胞毒素的融合基因的方法，據(jù)此方法可以制得幾種新的與IL-4R親和力高的IL-4(13D121E)和細(xì)胞毒素的融合基因，該基因可以選擇性地殺傷T淋巴細(xì)胞。


圖1為白介素-4突變基因IL-4(13D121E)測序圖。
圖2為白介素-4突變基因IL-4(13D121E)和綠膿桿菌外毒素A融合基因IL-4(13D121E)-PE38KDEL在大腸桿菌種表達(dá)電泳圖其中1為中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，2為對照，3為本發(fā)明實例工程菌，A為誘導(dǎo)帶。
具體實施例方式
實施例1一種白介素-4突變基因IL-4(13D121E)，具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列ATGGACACAA CTGAGAAGGA AACCTTCTGC AGGGCTGCGA CTGTGCTCCG GCAGTTCTAC 60AGCCACCATG AGAAGGACAC TCGCTGCCTG GGTGCGACTG CACAGCAGTT CCACAGGCAC120AAGCAGCTGA TCCGATTCCT GAAACGGCTC GACAGGAACC TCTGGGGCCT GGCGGGCTTG180AATTCCTGTC CTGTGAAGGA AGCCAACCAG AGTACGTTGG AAAACTTCTT GGAAAGGCTA240AAGACGATCA TGGAAGAGAA ATATTCAAAG TGTTCGTCCG GAGGTAACGG CGGTCACAAG300TGCGATATCA CCTTACAGGA GATCATCAAA GATTTGAACA GCCTCACAGA GCAGAAGACT360CTGTGCACCG AGTTGACCGT AACAGACATC TTTGCTGCCT CCAAG405(1)SEQ ID NO1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度405堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源白介素-4(human interleukin 4)(2)IL-4突變基因IL-4(13D121E)的制備以人的IL-4基因為模板，通過三輪overlap PCR進(jìn)行基因重組和點突變(參考文獻(xiàn)Kadowaki H，kadowaSci T，Wondisford FE et al.Use ofpolymerase chain reaction catalysed by Taq DNA polymerse forsite-specific mutagenesis.Gene，1989，76161-166.Vallette F，MegeE，Reiss A.Construction of mutant and chimeric genes using thepolymerase chain reaction.Nucleic Acids Res，1989，17723-733.)。
第一輪overlap PCR，以天然的人IL-4基因為模板，通過3個PCR反應(yīng)進(jìn)行IL-4基因重組。
第1個PCR反應(yīng)采用引物a和b擴增出相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的氨基酸1～37IL-4F a5′TGTTCGTCCGGAGGTAACGGCGGTCACAAGTGCGATATCAC 3′IL-4R b5′CTCAGTTGAGCTCTTGGAGGCAGCAAAGATGTCTGT 3′第2個PCR反應(yīng)采用引物c和d擴增出相當(dāng)于天然人IL-4成熟蛋白基因5′端開始的氨基酸38～129IL-4F c5′TGCTGCCGCCATGGACACAACTGAGAAGGAAACC 3′IL-4R d5′CTTGTGACCGCCGTTACCTCCGGACGAACACTTTGAATATTTCT 3′將上述兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合、變性、退火后，加入Taq酶反應(yīng)補成雙鏈DNA，此雙鏈DNA相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37；以此雙鏈DNA為模板，用引物b、c進(jìn)行第3個PCR擴增出IL-4重組體。
第一輪PCR條件IL-4ab段第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；60.0℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
IL-4cd段第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；63.0℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
cpIL-4第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；61.5℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
第二輪overlap PCR，以第一輪PCR產(chǎn)物IL-4基因重組體為模板，通過3個PCR反應(yīng)進(jìn)行IL-4點突變，此點突變位置相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第13個氨基酸。
第1個PCR反應(yīng)采用引物e和f，擴增出IL-4基因重組體5′端開始的氨基酸到相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第13個氨基酸IL-4F e5′TCCCGGCCGCCATGGACACA 3′Nco I酶切位點
IL-4R f5′GTTCAAATCTTTGATGATCTCCTG 3′第2個PCR反應(yīng)采用引物g和h，擴增出相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第13個氨基酸到IL-4基因重組體3′端的氨基酸IL-4F g5′CATCAAAGATTTGAACAGCCTCACA 3′IL-4R h5′GCGTTGGGAGCTCTTGGAGGCA 3′Sac I酶切位點將上述兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合、變性、退火后，加入Taq酶反應(yīng)補成雙鏈DNA，此雙鏈DNA所表達(dá)蛋白在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸處含有一個點突變，由Thr突變?yōu)锳sp；以此雙鏈DNA為模板，用引物e、h進(jìn)行第3個PCR擴增出IL-4突變體(13Thr→Asp)。
第二輪PCR條件cpIL-4(13D)前第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；55.3℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
cpIL-4(13D)前第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；53.5℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
cpIL-4(13D)總第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；59.2℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
第三輪overlap PCR，以第二輪PCR產(chǎn)物IL-4基因突變體為模板，通過3個PCR反應(yīng)進(jìn)行IL-4點突變，此點突變位置相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第121個氨基酸。
第1個PCR反應(yīng)采用引物e和i，擴增出IL-4基因突變體5′端開始的氨基酸到相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第121個氨基酸IL-4F e5′TCCCGGCCGCCATGGACACA 3′Nco I酶切位點IL-4R i5′TTTCTCTTCCATGATCGTCTTTAGCC 3′第2個PCR反應(yīng)采用引物j和h，擴增出相當(dāng)于天然IL-4成熟蛋白基因5′端開始的第121個氨基酸到IL-4基因突變體3′端的氨基酸IL-4F j5′GATCATGGAAGAGAAATATTCAAAG 3′IL-4R h5′GCGTTGGGAGCTCTTGGAGGCA 3′Sac I酶切位點將上述兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合、變性、退火后，加入Taq酶反應(yīng)補成雙鏈DNA，此雙鏈DNA所表達(dá)蛋白在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第121位氨基酸處含有一個點突變，由Arg突變?yōu)镚lu；以此雙鏈DNA為模板，用引物e、h進(jìn)行第3個PCR擴增出IL-4突變體(121Arg→Glu)，即IL-4突變基因IL-4(13D121E)。
第三輪PCR條件cpIL-4(13D121E)前第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；58.1℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
cpIL-4(13D121E)前第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；53.0℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
cpIL-4(13D121E)總第一階段94℃，5分鐘；第二階段94℃，1分鐘；59.2℃，45秒；72℃，20秒；共30個循環(huán)；第三階段72℃，5分鐘。
用Nco I和Sac I進(jìn)行雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切的pGEM-T載體用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，得到的重組質(zhì)粒命名為pGEM-IL-4(13D121E)，該質(zhì)粒含有IL-4突變基因IL-4(13D121E)。感受態(tài)細(xì)胞的制備，CaCl2轉(zhuǎn)化方法，質(zhì)粒DNA的提取鑒定參考《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，E.F.費里奇，T.曼尼阿蒂斯，科學(xué)出版社1998年版。
將轉(zhuǎn)化子接種于5ml液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)，培養(yǎng)13小時后，離心，收集菌體，送至上海博亞生物工程公司進(jìn)行測序；對轉(zhuǎn)化子的測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pGEM-IL-4(13D121E)含有405bp的IL-4突變基因，其堿基序列與設(shè)計一致。
實施例2一種白介素-4突變基因IL-4(13D121E)和綠膿桿菌外毒素A的融合基因IL-4(13D121E)-PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO3中堿基序列ATGGACACAA CTGAGAAGGA AACCTTCTGC AGGGCTGCGA CTGTGCTCCG GCAGTTCTAC 60AGCCACCATG AGAAGGACAC TCGCTGCCTG GGTGCGACTG CACAGCAGTT CCACAGGCAC120AAGCAGCTGA TCCGATTCCT GAAACGGCTC GACAGGAACC TCTGGGGCCT GGCGGGCTTG180AATTCCTGTC CTGTGAAGGA AGCCAACCAG AGTACGTTGG AAAACTTCTT GGAAAGGCTA240AAGACGATCA TGGAAGAGAA ATATTCAAAG TGTTCGTCCG GAGGTAACGG CGGTCACAAG300TGCGATATCA CCTTACAGGA GATCATCAAA GATTTGAACA GCCTCACAGA GCAGAAGACT360CTGTGCACCG AGTTGACCGT AACAGACATC TTTGCTGCCT CCAAGAGCTC ACATATGGCC420GAGGGCGGCA GCCTGGCCGC GCTGACCGCG CACCAGGCTT GCCACCTGCC GCTGGAGACT480TTCACCCGTC ATCGCCAGCC GCGCGGCTGG GAACAACTGG AGCAGTGCGG CTATCCGGTG540CAGCGGCTGG TCGCCCTCTA CCTGGCGGCG CGGCTGTCGT GGAACCAGGT CGACCAGGTG600ATCCGCAACG CCCTGGCCAG CCCCGGCAGC GGCGGCGACC TGGGCGAAGC GATCCGCGAG660CAGCCGGAGC AGGCCCGTCT GGCCCTGACC CTGGCCGCCG CCGAGAGCGA GCGCTTCGTC720
CGGCAGGGCA CCGGCAACGA CGAGGCCGGC GCGGCCAACG CGGGCCCGGC GGACAGCGGC 780GACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACT GGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGAC 840GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAAC TGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC 900CGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTC GTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCG 960GCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGC GCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGG1020CGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCG CTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAA1080CCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGT GCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCG1140AGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTG ACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAG1200GTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCG CTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAG1260GAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTC GGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTG1320ATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGC AACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGC1380ATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCC CTGCCGGACT ACGCTAGCCA GCCCGGCAAA1440CCGCCGAAAG ATGAACTG 1458(1)SEQ ID NO3的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度1458堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源白介素-4(human interleukin 4)，綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(2)融合基因IL-4(13D121E)-PE38KDEL的制備采用酶切連接的方法構(gòu)建IL-4(13D121E)-PE38KDEL融合基因。
用Sac I和Nco I雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-IL-4(13D121E)，膠回收得到IL-4突變基因IL-4(13D121E)；用Sac I和HindIII雙酶切質(zhì)粒pMD-PE38KDEL(含綠膿桿菌外毒素A突變基因PE38KDEL)，得到綠膿桿菌外毒素A突變體(PE38KDEL)；用Nco I和HindIII雙酶切質(zhì)粒的大腸桿菌質(zhì)粒pET-32a(+)，膠回收雙酶切質(zhì)粒。
將上述三種雙酶切的膠回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，篩選得到的重組質(zhì)粒命名為pET32-IL-4(13D121E)-PE38KDEL，該重組質(zhì)粒含有IL-4(13D121E)-PE38KDEL融合基因。感受態(tài)細(xì)胞的制備，CaCl2轉(zhuǎn)化方法，質(zhì)粒DNA的提取鑒定參考《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，E.F.費里奇，T.曼尼阿蒂斯，科學(xué)出版社1998年版。
其中，此融合基因中，綠膿桿菌外毒素A突變基因PE38KDEL具有序列表SEQ ID NO2(參見序列表)中堿基序列(Chaudhary VK，Jinno Y，etal.Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxylterminus that is required for cytotoxicity.Proc Natl Acad Sci U SA.1990 Jan；87(1)308-12.Seetharam S，Chaudhary VK，et al.Increased cytotoxic activity of Pseudomonas exotoxin and twochimeric toxins ending in KDEL.J Biol Chem.1991 Sep15；266(26)17376-81.Brinkmann U，Pai LH，et al.B3(Fv)-PE38KDEL，a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a humancarcinoma in mice.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 Oct1；88(19)8616-20.)。
綠膿桿菌外毒素A突變基因PE38KDEL堿基序列GGCGGCAGCC TGGCCGCGCT GACCGCGCAC CAGGCTTGCC ACCTGCCGCT GGAGACTTTC 60ACCCGTCATC GCCAGCCGCG CGGCTGGGAA CAACTGGAGC AGTGCGGCTA TCCGGTGCAG120CGGCTGGTCG CCCTCTACCT GGCGGCGCGG CTGTCGTGGA ACCAGGTCGA CCAGGTGATC180CGCAACGCCC TGGCCAGCCC CGGCAGCGGC GGCGACCTGG GCGAAGCGAT CCGCGAGCAG240CCGGAGCAGG CCCGTCTGGC CCTGACCCTG GCCGCCGCCG AGAGCGAGCG CTTCGTCCGG300CAGGGCACCG GCAACGACGA GGCCGGCGCG GCCAACGCGG GCCCGGCGGA CAGCGGCGAC360GCCCTGCTGG AGCGCAACTA TCCCACTGGC GCGGAGTTCC TCGGCGACGG CGGCGACGTC420AGCTTCAGCA CCCGCGGCAC GCAGAACTGG ACGGTGGAGC GGCTGCTCCA GGCGCACCGC480CAACTGGAGG AGCGCGGCTA TGTGTTCGTC GGCTACCACG GCACCTTCCT CGAAGCGGCG540CAAAGCATCG TCTTCGGCGG GGTGCGCGCG CGCAGCCAGG ACCTCGACGC GATCTGGCGC600GGTTTCTATA TCGCCGGCGA TCCGGCGCTG GCCTACGGCT ACGCCCAGGA CCAGGAACCC660GACGCACGCG GCCGGATCCG CAACGGTGCC CTGCTGCGGG TCTATGTGCC GCGCTCGAGC720CTGCCGGGCT TCTACCGCAC CAGCCTGACC CTGGCCGCGC CGGAGGCGGC GGGCGAGGTC780GAACGGCTGA TCGGCCATCC GCTGCCGCTG CGCCTGGACG CCATCACCGG CCCCGAGGAG840GAAGGCGGGC GCCTGGAGAC CATTCTCGGC TGGCCGCTGG CCGAGCGCAC CGTGGTGATT900CCCTCGGCGA TCCCCACCGA CCCGCGCAAC GTCGGCGGCG ACCTCGACCC GTCCAGCATC960CCCGACAAGG AACAGGCGAT CAGCGCCCTG CCGGACTACG CTAGCCAGCC CGGCAAACCG 1020CCGAAAGATG AACTG1035(a)序列特征*長度1035堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(3)構(gòu)建表達(dá)IL-4(13D121E)-PE38KDEL融合基因的工程菌提取質(zhì)粒pET32-IL-4(13D121E)-PE38KDEL，轉(zhuǎn)化E.coliAD494(DE3)，挑取轉(zhuǎn)化子，接種于LB液體培養(yǎng)基，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用Nco I和HindIII對質(zhì)粒雙酶切，產(chǎn)生約1400bp的DNA片段，證實了該轉(zhuǎn)化子是所要的工程菌。
取AD494(DE3)工程菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；次日，以1％接種量轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基；當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時，加入1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，于37℃表達(dá)4小時；1ml發(fā)酵液的菌體離心，懸于1倍SDS樣品加樣液，沸水浴煮10分鐘，12000g離心2分鐘，取15μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白的表達(dá)。
結(jié)果在工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳譜中有一明顯表達(dá)帶，見圖2，分子量約64000dalton(由于pET-32a(+)載體表達(dá)蛋白N端含有一個硫氧還蛋白，此硫氧還蛋白分子量為11000dalton，故得到的融合蛋白分子量為約為64000dalton)；紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描顯示此表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的30％。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>一種白介素-4突變基因IL-4-13121及其制備和應(yīng)用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>人〔Homo sapiens〕<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(405)<223>
<400>1atggacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 60agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac120aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg180aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta240aagacgatca tggaagagaa atattcaaag tgttcgtccg gaggtaacgg cggtcacaag300tgcgatatca ccttacagga gatcatcaaa gatttgaaca gcctcacaga gcagaagact360ctgtgcaccg agttgaccgt aacagacatc tttgctgcct ccaag405<210>2<211>1035<212>DNA<213>綠膿桿菌〔Pseudomonas aeruginosa〕<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(1035)<223>
ggcggcagcc tggccgcgct gaccgcgcac caggcttgcc acctgccgct ggagactttc 60acccgtcatc gccagccgcg cggctgggaa caactggagc agtgcggcta tccggtgcag120cggctggtcg ccctctacct ggcggcgcgg ctgtcgtgga accaggtcga ccaggtgatc180cgcaacgccc tggccagccc cggcagcggc ggcgacctgg gcgaagcgat ccgcgagcag240ccggagcagg cccgtctggc cctgaccctg gccgccgccg agagcgagcg cttcgtccgg300cagggcaccg gcaacgacga ggccggcgcg gccaacgcgg gcccggcgga cagcggcgac360gccctgctgg agcgcaacta tcccactggc gcggagttcc tcggcgacgg cggcgacgtc420agcttcagca cccgcggcac gcagaactgg acggtggagc ggctgctcca ggcgcaccgc480caactggagg agcgcggcta tgtgttcgtc ggctaccacg gcaccttcct cgaagcggcg540caaagcatcg tcttcggcgg ggtgcgcgcg cgcagccagg acctcgacgc gatctggcgc600ggtttctata tcgccggcga tccggcgctg gcctacggct acgcccagga ccaggaaccc660gacgcacgcg gccggatccg caacggtgcc ctgctgcggg tctatgtgcc gcgctcgagc720ctgccgggct tctaccgcac cagcctgacc ctggccgcgc cggaggcggc gggcgaggtc780gaacggctga tcggccatcc gctgccgctg cgcctggacg ccatcaccgg ccccgaggag840gaaggcgggc gcctggagac cattctcggc tggccgctgg ccgagcgcac cgtggtgatt900ccctcggcga tccccaccga cccgcgcaac gtcggcggcg acctcgaccc gtccagcatc960cccgacaagg aacaggcgat cagcgccctg ccggactacg ctagccagcc cggcaaaccg 1020ccgaaagatg aactg1035<210>3<211>1458<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(1458)<223>
<400>3atggacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 60agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac120aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg180aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta240aagacgatca tggaagagaa atattcaaag tgttcgtccg gaggtaacgg cggtcacaag300tgcgatatca ccttacagga gatcatcaaa gatttgaaca gcctcacaga gcagaagact360ctgtgcaccg agttgaccgt aacagacatc tttgctgcct ccaagagctc acatatggcc420gagggcggca gcctggccgc gctgaccgcg caccaggctt gccacctgcc gctggagact480ttcacccgtc atcgccagcc gcgcggctgg gaacaactgg agcagtgcgg ctatccggtg540cagcggctgg tcgccctcta cctggcggcg cggctgtcgt ggaaccaggt cgaccaggtg600atccgcaacg ccctggccag ccccggcagc ggcggcgacc tgggcgaagc gatccgcgag660cagccggagc aggcccgtct ggccctgacc ctggccgccg ccgagagcga gcgcttcgtc720cggcagggca ccggcaacga cgaggccggc gcggccaacg cgggcccggc ggacagcggc780gacgccctgc tggagcgcaa ctatcccact ggcgcggagt tcctcggcga cggcggcgac840gtcagcttca gcacccgcgg cacgcagaac tggacggtgg agcggctgct ccaggcgcac900cgccaactgg aggagcgcgg ctatgtgttc gtcggctacc acggcacctt cctcgaagcg960gcgcaaagca tcgtcttcgg cggggtgcgc gcgcgcagcc aggacctcga cgcgatctgg 1020cgcggtttct atatcgccgg cgatccggcg ctggcctacg gctacgccca ggaccaggaa 1080cccgacgcac gcggccggat ccgcaacggt gccctgctgc gggtctatgt gccgcgctcg 1140agcctgccgg gcttctaccg caccagcctg accctggccg cgccggaggc ggcgggcgag 1200gtcgaacggc tgatcggcca tccgctgccg ctgcgcctgg acgccatcac cggccccgag 1260gaggaaggcg ggcgcctgga gaccattctc ggctggccgc tggccgagcg caccgtggtg 1320attccctcgg cgatccccac cgacccgcgc aacgtcggcg gcgacctcga cccgtccagc 1380atccccgaca aggaacaggc gatcagcgcc ctgccggact acgctagcca gcccggcaaa 1440
ccgccgaaag atgaactg
權(quán)利要求
1.一種IL-4突變基因IL-4-13121，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中堿基序列。
2.一種權(quán)利要求1所述IL-4突變基因IL-4-13121的制備，其特征在于以人的IL-4基因為模板，通過三輪overlap PCR進(jìn)行基因重組和點突變；第一輪PCR反應(yīng)擴增出相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37；第二輪PCR反應(yīng)在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸處引入一個點突變，即13Thr→Asp；第三輪PCR反應(yīng)在相當(dāng)于天然人IL-4分子成熟蛋白第121位氨基酸處引入一個點突變，即121Arg→Glu。
3.一種權(quán)利要求1所述IL-4突變基因IL-4-13121的應(yīng)用，其特征在于以IL-4(13D121E)和細(xì)胞毒素連接獲得融合基因，所述細(xì)胞毒素為超抗原、核糖體延伸因子-2抑制劑或它們的突變體。
4.按照權(quán)利要求3所述IL-4突變基因IL-4-13121的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞毒素為綠膿桿菌外毒素A突變基因，其具有序列表SEQ ID NO2中堿基序列。
5.按照權(quán)利要求3所述IL-4突變基因IL-4-13121的應(yīng)用，其特征在于所述獲得的融合基因具有序列表SEQ ID NO3中堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)，具體地說是一種白介素－4突變基因IL－4(13D121E)及其制備和應(yīng)用，突變基因IL－4(13D121E)具有序列表SEQID NO1中堿基序列；是以天然的人IL－4基因為基礎(chǔ)，利用重疊PCR，對其基因上的堿基進(jìn)行重組和點突變獲得。主要特點是表達(dá)的融合蛋白與IL－4R的親和力高，并可以選擇性地與I型IL－4R結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號，從而殺傷表面含有I型IL－4R的T、B淋巴細(xì)胞、血癌細(xì)胞，用于抗腫瘤靶向藥物的研究。
文檔編號C12P19/00GK1609226SQ20031010492
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者吳文芳, 崔京霞, 呂安國, 倪劍鋒 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所