一種sit1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SIT1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)水稻類受體激酶突變基因SIT1KE，其導(dǎo)入植物中可以提高植物耐鹽性，且比野生型SIT1基因的耐鹽性高。證明該突變基因具有耐鹽性，為提高農(nóng)作物抗鹽性上提供了重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價值。
【專利說明】一種SIT1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種SITl突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鹽脅迫是目前世界上影響作物產(chǎn)量的最主要的非生物因素。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的不完全統(tǒng)計(jì)，我國鹽堿地面積占耕地總面積的20%以上，且由于灌溉方式不當(dāng)及淡水資源匱乏等原因，這個比例還在不斷增長。研究作物耐鹽機(jī)制對于增加作物種植面積，提高糧食
產(chǎn)量具有非常重要的意義。
[0003]植物在遭受外界鹽脅迫時，植物會做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)，目前關(guān)于這一方面的報道主要集中在離子通道及其調(diào)控子以及轉(zhuǎn)錄因子等基因上，比如朱健康教授實(shí)驗(yàn)室所報道的經(jīng)典的S0S(Salt Overly Sensitive)系統(tǒng)，大致由三個主要的組成部分S0S1，S0S2，S0S3構(gòu)成，該系統(tǒng)通過磷酸化的調(diào)節(jié)植物Na離子的外排。還有另一類經(jīng)典的基因家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT1，第一 HKT蛋白在小麥中被克隆出來發(fā)現(xiàn)該基因能夠具有選擇性的親和鈉離子和鉀離子，但是在 擬南芥中AtHKTl卻并不像小麥HKT —樣具有較高的離子選擇性，而是在參與調(diào)節(jié)擬南芥地上和地下部分中的鈉離子平衡過程中，而在水稻中鑒定出的0sHKT2.1則是在根中調(diào)節(jié)了在低鉀的情況下的鈉離子的攝入發(fā)揮作用。而在轉(zhuǎn)錄因子方面科學(xué)家們已經(jīng)鑒定出了許多和鹽脅迫相關(guān)的各類轉(zhuǎn)錄因子，比如一些鋅指蛋白、MYB、AP2/ERF、WRKY和NAC類的轉(zhuǎn)錄因子都是報道比較多的調(diào)節(jié)鹽響應(yīng)的幾大類轉(zhuǎn)錄因子，比如Zatl2，ZFP179,ZFP182，SNACl，SNAC2, SERFl等基因。還有極少數(shù)關(guān)于植物耐鹽性的報道是關(guān)于位于細(xì)胞表面的負(fù)責(zé)信號感知的類受體激酶的比如OsSIKl，Srlk，AtLecRK2，鹽脅迫信號經(jīng)過一系列的中間傳遞過程，誘導(dǎo)下游脅迫響應(yīng)基因表達(dá)，使植物產(chǎn)生耐鹽反應(yīng)。植物類受體激酶是植物中最為龐大的基因家族之一，關(guān)于此類基因的研究已成為植物學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。植物類受體激酶蛋白主要由三部分組成:結(jié)構(gòu)多樣的胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜域和保守的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。根據(jù)植物類受體激酶胞外結(jié)構(gòu)域的不同，植物類受體激酶家族被分為多個亞家族。自從20多年前第一個植物類受體激酶在玉米中被發(fā)現(xiàn)以后，越來越多的類受體激酶被克隆出來，并被證明參與了從植物生長發(fā)育到參與逆境反應(yīng)，如植物的自交不親和過程，激素信號的接收和傳遞，生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，抗病反應(yīng)等植物生長發(fā)育的各個方面。
[0004]已有結(jié)果表明類受體激酶很有可能作為細(xì)胞表面的鹽脅迫信號的感應(yīng)分子來發(fā)揮作用。因此，研究植物類受體激酶在植物耐鹽反應(yīng)中的作用，對于闡明植物的抗鹽機(jī)制是十分重要的。該基因及其點(diǎn)突變形式的發(fā)現(xiàn)以及對其功能的研究對于闡述植物耐鹽性的機(jī)理提供了新的線索并對基因工程育種方面提供了新的材料和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種SITl突變蛋白及其編碼基因。[0006]本發(fā)明的SITl突變蛋白，是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008](b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]上述經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010]編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011]上述DNA分子是如下⑴-⑶中任一種的DNA分子:
[0012](1)編碼區(qū)為序列表中的序列2所示的DNA分子；
[0013](2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)的蛋白的DNA分子；
[0014](3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0015]上述嚴(yán)格條件為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1% SDS中漂洗；
[0016]含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017]上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0018]在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體為pCAMBIA1300-35S::MH載體，重組載體為將序列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII雙酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0019]pCAMBIA1300-35S::MH載體為將序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300載體的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)得到的載體。
[0020]擴(kuò)增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021]上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]上述應(yīng)用中,所述耐逆性為耐鹽性；
[0023]所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性；
[0024]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
[0025]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026]本發(fā)明提供的方法，為將上述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0027]上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；
[0028]所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
[0029]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)水稻類受體激酶突變基因SITIke，其導(dǎo)入植物中可以提高植物耐鹽性，且比野生型SITl基因的耐鹽性高。證明該突變基因具有耐鹽性，為提高農(nóng)作物抗鹽性上提供了重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價值。【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為SITl擬南芥超表達(dá)突變體的耐鹽性分析圖【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]實(shí)施例1、SITl突變基因SITIke及其過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0034]1、SITl基因的獲得
[0035]提取日本晴水稻葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用引物5' GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3'和 5' GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2034bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，具有序列表序列I所示的核苷酸，為SITl去除終止密碼子的基因。
[0036]2、SITl突變基因SITIke的獲得
[0037]I)過表達(dá)SITl基因重組載體
[0038]pCAMBIA1300-35S::MH載體為將序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300載體的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)得到的載體。 [0039]以cDNA 作為模板，用 5 ' GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3 '和5 ' GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3'進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 2034bp 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表序列I自5’末端第I位一 2022位核苷酸。
[0040]用XbaI和BglII雙酶切上述PCR產(chǎn)物，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的PCAMBIA1300-35S::MH載體連接，得到重組載體pCAMBIA1300_35S::SIT1 — 7M6H，為過表達(dá)SITl基因重組載體。
[0041]經(jīng)過測序，該載體為將序列表序列I自5’末端第I位一 2022位核苷酸插入PCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0042]2) SITl激酶點(diǎn)突變載體
[0043]序列I自5’末端第I位-2022位核苷酸為去終止密碼子的SITl。
[0044]將此片段利用Gateway方法連入pENTRTM/SD/D-T0P0載體，得到重組載體pENTR?/SD/D-T0P0-SIT1。
[0045]設(shè)計(jì)SITIke點(diǎn)突變引物，參照Transgene點(diǎn)突變試劑盒方法用重組載體pENTR?/SD/D-T0P0-SIT1生產(chǎn)含SITIke的重組載體。
[0046]SITIkeA突變引物如下:
[0047]5’ GTGGAGATTGCAGTGGAGAAGGTATCCCACG3’ 和
[0048]5’ CCACTGCAATCTCCACTCGGGATACCAGTA3’
[0049]用XbaI和BglII雙酶切含SITIke的重組載體，回收2034bp的片段，與經(jīng)過同樣酶切的載體 PCAMBIA1300-35S::MH 連接，得到 pCAMBIA1300_35S:: SIT1KE_7M6H。經(jīng)過測序，該載體為將序列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII雙酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0050]序列表中序列2所示的核苷酸為SITl突變基因SITIke，該基因編碼的蛋白SITIke的氨基酸序列為序列表中序列3。
[0051]序列表中序列I所示的核苷酸為SITl基因，該基因編碼的蛋白SITl的氨基酸序列為序列表中序列4。
[0052]SITl基因的序列I自5’末端第1156-1158位AAG突變?yōu)镚AG，得到序列2所示的SITIke ；
[0053]SITl蛋白的序列4自N’末端第386位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?，得到序?所示的SITIke0
[0054]實(shí)施例2、突變基因SITIke在提高植物耐逆性中的應(yīng)用
[0055]1、轉(zhuǎn)SITIke擬南芥的構(gòu)建
[0056]將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S:: SITIke — 7M6H轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到含有重組質(zhì)粒的GV3101 (提取質(zhì)粒測序鑒定，質(zhì)粒為PCAMBIA1300-35S:: SITIke — 7M6H)。
[0057]擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化:把調(diào)配好的含有農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入大小合適的燒杯或廣口罐頭瓶中，將已經(jīng)提前剪過角果和開放花蕾的擬南芥(擬南芥的品種col-Ο，以下簡稱野生型擬南芥)受體植株的整個地上部分都浸沒到轉(zhuǎn)化介質(zhì)中，浸泡5-6min ;取出擬南芥植株，將莖、葉、花上等多 余的水珠輕輕抖落，橫躺在平整的桌面或凳子上，等水珠基本干燥后置于干凈的塑料盒中，仍然維持橫躺的姿勢，并用黑色袋子覆蓋避光保溫，22°C光照培養(yǎng)室中恢復(fù)培養(yǎng)16-36h ;揭去黑袋,將擬南芥重新豎直放置,在22°C光照培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)；一般生長2-3周后，角果多數(shù)已經(jīng)飽滿，此時盡量少澆水和營養(yǎng)液，促進(jìn)種子成熟；種子成熟后，放于1.5ml Ep管中，加入適量干燥劑硅膠，常溫下短期保存，長期保存最好把干燥的種子置于_70°C冰箱，得到Tl代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥種子。
[0058]提取Tl 代轉(zhuǎn) SITIke 擬南芥葉片基因組 DNA，用 5’ -ATGCGGCGTCCCGAGCTAA-3’ 和5’ -CGCTCGAGGAATGTCA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2022bp的為陽性Tl代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥。
[0059]播種陽性Tl代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥?zhèn)鞔钡降玫絋3代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥。T3代純和植株通過western blot利用c_MYC抗體(sigma)檢測SITIke-MYC融合蛋白的表達(dá)。
[0060]采用同樣的方法將pCAMBIA1300-35S::SIT1 — 7M6H轉(zhuǎn)入擬南芥中，培養(yǎng)直到得到T3代轉(zhuǎn)SITl擬南芥。
[0061]2、SITIke在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用
[0062]將T3代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥株系4#、9#在含有10mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以野生型擬南芥Col和T3代轉(zhuǎn)SITl擬南芥為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
[0063]結(jié)果如圖1所示，A圖為表型圖，B圖為存活率統(tǒng)計(jì)圖，其中，SITl為T3代轉(zhuǎn)SITl擬南芥、SIT1ke9和SIT1ke4為T3代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥株系、col為野生型擬南芥；可以看出，
[0064]在正常條件下，各個株系無顯著差異；
[0065]在10mM NaCl脅迫下，與野生型擬南芥和T3代轉(zhuǎn)SITl擬南芥相比，點(diǎn)突變SIT1daT3代轉(zhuǎn)SITIke擬南芥SIT1KE9和SIT1KE4均表現(xiàn)出明顯的耐鹽抗性，轉(zhuǎn)SITIke擬南芥的存活率(為95%以上)高于野生型植物(約85%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于T3代轉(zhuǎn)SITl擬南芥SITl。
[0066]上述結(jié)果表明，SITIke可以提高植物鹽性，在植物耐鹽性方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一種的DNA分子: (1)編碼區(qū)為序列表中的序列2所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)的蛋白的DNA分子; (3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性； 所述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
9.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號】A01H5/00GK104031131SQ201410227807
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】孫穎, 王耕, 李晨輝, 艾連峰, 張勝偉 申請人:河北師范大學(xué)