本發(fā)明涉及一種生物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種快速構(gòu)建擴增子文庫的融合引物組合。
背景技術(shù)：
：下一代測序(next-generationsequencing，NGS)由于高通量、高靈敏度、高度自動化等特性，近年來在疾病的研究和診斷治療中越來越多地被應(yīng)用。NGS技術(shù)能實現(xiàn)多基因平行檢測，比傳統(tǒng)檢測方法節(jié)省樣本，且靈敏度更高，能更真實還原腫瘤變異全景。但LifeNGS平臺中傳統(tǒng)的構(gòu)建擴增子文庫的方法步驟繁瑣，需要經(jīng)過PCR擴增、消化、加接頭、純化等步驟，需要花費約5h；并且由于多步驟操作中需要開蓋，因此文庫易被污染，文庫損失率高；另外在傳統(tǒng)的構(gòu)建擴增子文庫的方法中，單個樣品建立文庫的成本較高，為200-1000元/例。公開于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種快速構(gòu)建擴增子文庫的融合引物組合。使用該融合引物組合可以簡便、快速的經(jīng)1步PCR構(gòu)建擴增子文庫，且由于在PCR起始時就引入barcode，使得樣本及文庫間交叉污染的可能性大大降低，并能簡化實驗場地分區(qū)的要求，該融合引物組合還能將單個樣品建立文庫的成本控制在30元/例。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：一種用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合，包括：根據(jù)目標擴增子設(shè)計的上游融合引物和根據(jù)目標擴增子設(shè)計的下游融合引物，其中：所述根據(jù)目標擴增子設(shè)計的上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接頭序列(A序列)、barcode序列、第二接頭序列和根據(jù)目標擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列；所述根據(jù)目標擴增子設(shè)計的下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接頭序列(trP1序列)和根據(jù)目標擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述第一接頭序列包括SEQID:1序列，SEQID:1序列的核苷酸序列為CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，用于構(gòu)建同一個DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合中，上游融合引物中的barcode序列相同；用于構(gòu)建不同DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合中，上游融合引物中的barcode序列不同。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述第二接頭序列包括核苷酸序列GAT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述第三接頭序列包括SEQID:2序列，SEQID:2序列的核苷酸序列為CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)任意一種目標擴增子設(shè)計的上游融合引物和根據(jù)任意一種目標擴增子設(shè)計的下游融合引物的濃度均為100μM。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，當同一個PCR反應(yīng)中的目標擴增子的數(shù)量＞1時，所述根據(jù)目標擴增子設(shè)計的上游融合引物為根據(jù)每一種目標擴增子設(shè)計的上游融合引物的組合，所述根據(jù)目標擴增子設(shè)計的下游融合引物為根據(jù)每一種目標擴增子設(shè)計的下游融合引物的組合。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)任意一種目標擴增子設(shè)計的上游融合引物和根據(jù)該目標擴增子設(shè)計的下游融合引物的摩爾比為1:1。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述DNA樣品為基因組DNA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，基因組DNA提取自組織樣本或福爾馬林固定石蠟包埋樣本。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述目標擴增子包括選自下組22種目標擴增子中的至少一個：ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:3所示：TAAGGGACAAGCAGCCACACCCCATTCTTGAGGGGCTGAGGTGGAAGAGACAGGCCCGGAGGGGTGAGGCAGTCTTTACTCACCTGTAGATGTCTCGGGCCATCCCGAAGTCTCCAATCTTGGCCACTCTTCCAGGGCCTGGACAGGTCAAGAGGCAGT；ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:4所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGTCTCCCCCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGCTCACCCCAATGCAGCGAACAATGTTCTGGTGGTTGAATTTGCTGCAGAGCAGAGAGGGATGTAACCAAAATTAACTGAGCTGAGTCTGG；BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:5所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAG；EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:6所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGG；EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:7所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGT；EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:8所示：GAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACAC；EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:9所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTA；ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:10所示：CATACCCTCTCAGCGTACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCG；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:11所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTGTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCCATCAATTACTACTTGCTTCCTGTAGGAATCCTGAGAAGGGAGAAACACAGTCTGGATTATTACAGTGCA；KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:12所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTT；MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:13所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGGTAAGTCACATCAGTTCCC；MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:14所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCTGTTTTAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGATGCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCT；MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:15所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAGTTCTTTCTTTTGCACAGGGCATTTTGGTTGTGTATATCATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGTAAGTGGCATTTTATTTAACCATGGAGTATACTTTTGTGGTTTGCAAC；MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:16所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACAAAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGTCAGATGTG；NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:17所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGGTTTCACCATCTATAACCACTTGTTTTCTGTAAGAATCCTGGGGGTG；NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:18所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGCGGGCTACCACTGGGCCTCACCTCTATGGTGGGATCATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCACCTGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAG；PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:19所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAACTGAATTTGGCTGATCTCAGCATGTT；PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:20所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATTG；TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:21所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTACTCAGGATAGGAAAAGAG；TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:22所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTAGGAGATAACACAGGCCCAAGA；TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:23所示：CCCCAGTTGCAAACCAGACCTCAGGCGGCTCATAGGGCACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAAATTTCCTTCCACTCGGATAAGATGCTGAGGAGGGGCCAGACCTAAGAGCAATCAGTGAGGAATCAGAGG；TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:24所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGGGGGTGTGGAATCAACCCACAGCTGCACAGGGCAGGTCTTGGCCAGTTGGCAAAACATCTTGTTGAGGGCAGGGGAGTACTG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:25所示：ACTGCCTCTTGACCTGTCC；根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:26所示：TAAGGGACAAGCAGCCACAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:27所示：CCAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGG；根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:28所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:29所示：CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTC；根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:30所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:31所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTG；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:32所示：CCAGGGACCTTACCTTATACACC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:33所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCC；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:34所示：ACACAGCAAAGCAGAAACTCAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:35所示：GAAGCCACACTGACGTGC；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:36所示：GTGTTCCCGGACATAGTCCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:37所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACA；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:38所示：TAAACAATACAGCTAGTGGGAAGGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:39所示：CATACCCTCTCAGCGTACCC；根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:40所示：CGGACATGGTCTAAGAGGCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:41所示：TGCACTGTAATAATCCAGACTGTGT；根據(jù)KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:42所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:43所示：AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA；根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:44所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:45所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATT；根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:46所示：GGGAACTGATGTGACTTACCCT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:47所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGC；根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:48所示：AGCTCGGTAGTCTACAGATTCATTT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:49所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAG；根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:50所示：GTTGCAAACCACAAAAGTATACTCCA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:51所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTC；根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:52所示：CACATCTGACTTGGTGGTAAACTT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:53所示：CACCCCCAGGATTCTTACAGAAAA；根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:54所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:55所示：CTGAGTACAAACTGGTGGTGGT；根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:56所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:57所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAG；根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:58所示：AACATGCTGAGATCAGCCAAATTC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:59所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGAC；根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:60所示：CAATCCATTTTTGTTGTCCAGCC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:61所示：CTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATC；根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:62所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:63所示：TCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAG；根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:64所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:65所示：CCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC；根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:66所示：CCCCAGTTGCAAACCAGAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性上游引物序列如SEQID:67所示：CAGTACTCCCCTGCCCTCAA；根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴增子設(shè)計的特異性下游引物序列如SEQID:68所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述目標擴增子為以下22種：ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:3所示；ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:4所示；BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:5所示；EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:6所示；EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:7所示；EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:8所示；EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:9所示；ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:10所示；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:11所示；KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:12所示；MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:13所示；MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:14所示；MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:15所示；MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:16所示；NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:17所示；NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:18所示；PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:19所示；PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:20所示；TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:21所示；TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:22所示；TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:23所示；和TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴增子，其序列如SEQID:24所示。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物；根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物、和根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴增子設(shè)計的上游融合引物的摩爾比為2:1:1:4:1:1:2:4:2:1:2:2:1:4:4:2:2:4:2:2:4:2。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述融合引物組合進行PCR時的PCR反應(yīng)體系包括以下組分：PCR預(yù)混液10μl；DNA樣品1-8μl共20ng；用于構(gòu)建同一個DNA樣品的擴增子文庫的引物組合2μl；DNAase-freeH2O補足至20μl。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴增子文庫的融合引物組合在另一種實施方式中，所述PCR預(yù)混液為KAPAHiFiPCRKits。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、操作簡便，節(jié)省時間。本發(fā)明融合引物組合是基于PGM平臺的設(shè)計的用于快速構(gòu)建擴增子文庫的，現(xiàn)有商業(yè)化試劑盒對擴增子文庫進行準備過程中步驟繁瑣，本發(fā)明只涉及一輪PCR反應(yīng)及對應(yīng)產(chǎn)物純化步驟，將擴增子建庫的操作大大簡化，節(jié)省建庫時間，從文庫構(gòu)建到上機結(jié)束及生物信息學(xué)分析完成的整個流程可在32小時內(nèi)完成。2、有效杜絕樣本及文庫污染。操作流程的大大簡化使我們建庫過程更加的安全可靠，在PCR前就引入了Barcode，使得后續(xù)操作時不同樣本間的交叉污染的可能性極大降低，另外操作過程及步驟的減少有效的杜絕了建庫過程中有可能造成的文庫污染。3、簡化的生物信息學(xué)分析流程。該方法所得到的擴增子文庫結(jié)構(gòu)單一，數(shù)據(jù)可靠，所得文庫的DNA鏈組成簡單明了，后續(xù)的生物信息學(xué)分析更加的簡化。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例1中擴增子文庫構(gòu)建完成后檢測得到的擴增產(chǎn)物分布圖。圖2是本發(fā)明實施例1中所得文庫里22個擴增子的相關(guān)參數(shù)。具體實施方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應(yīng)當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。實施例1待測樣本為5份FFPE樣本(即：福爾馬林固定石蠟包埋樣本，F(xiàn)FPE代表Formalin-FixedandParrffin-Embedded)，其中3份為非小細胞肺癌患者的FFPE樣本，另外2份為非腫瘤患者的FFPE樣本。利用特異性設(shè)計的融合引物采用一步法對5份FFPE樣本構(gòu)建擴增子DNA文庫，具體過程如下：1、基因組DNA的提?。菏褂肣iagenFFPEDNAKit(離心柱型)試劑盒提取FFPE樣本中的基因組DNA，具體步驟參照試劑盒操作說明，將所得基因組DNA溶解于Tris-HCl緩沖液，NanoDrop檢測DNA提取質(zhì)量，用Qubit3.0檢測樣本DNA濃度后，將每份基因組DNA樣本稀釋到濃度為20ng/μl。2、構(gòu)建擴增子文庫所用融合引物序列信息如下：以下表格中引物名稱中以FB開頭的引物表示上游融合引物，以R開頭的引物表示下游融合引物，其中下游融合引物序列是幾組樣品通用的。上游融合引物中，核苷酸序列CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG表示第一接頭序列，GAT三個核苷酸表示第二接頭序列，第一接頭序列和第二接頭序列之間的序列為barcode序列，第二接頭序列之后的序列為特異性上游引物序列。下游融合引物中，CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT序列表示第三接頭序列，其余為特異性下游引物序列。按照下表合成各融合引物。3、形成PCR反應(yīng)體系，具體PCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系組分含量KAPAHiFiPCRKits10μl基因組DNA(本身濃度10ng/μl))2μl融合引物組合2μlDNAasefreeH2O補足余量總計20μl融合引物組合通過以下方法制備，將步驟2中合成的各融合引物加水溶解至濃度100μM，將帶有相同barcode序列標簽的上游融合引物混合得到上游融合引物組合，將帶有相同barcode序列標簽的下游融合引物按照與其相應(yīng)的上游融合引物等體積的方式混合得到下游融合引物組合，再將上游融合引物組合及下游融合引物組合等體積混合，5個barcode序列標簽分別對應(yīng)5組不同的待檢樣本。4、進行PCR程序，PCR儀使用Appliedbio-system的2720ThermalCycler，PCR反應(yīng)程序如下：5、PCR反應(yīng)結(jié)束后，用BeckmanCoulter公司的AgencourtAMPureXPKit(貨號A63880/A63881/A63882)進行純化。操作步驟如下：1)提前30分鐘取出AgencourtAMPureXPKit，充分渦旋后，室溫靜置。2)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將磁珠再次充分渦旋，向體系中加入20ul磁珠，反復(fù)吹打5次以上或充分渦旋，室溫靜置5分鐘。3)將EP管轉(zhuǎn)移至置于磁力架上，靜置5分鐘至溶液澄清后，用移液槍小心除去上清，注意不要觸碰磁珠。4)每管加入100ul新鮮配置的80％乙醇溶液，EP管置于磁力架上緩慢旋轉(zhuǎn)2圈，靜置5m，棄去上清。5)重復(fù)4步一次。6)將EP管打開，室溫靜置，使液體揮發(fā)干凈，以磁珠表面無光澤為準，注意不要過分干燥磁珠。7)從磁力架上取下EP管，加入30ulPCR級純化水，渦旋混勻后，室溫靜置10分鐘。8)將上步的EP管置于磁力架上2分鐘或直至溶液澄清后，用移液槍在遠離磁石的一面小心吸取上清液，注意不要觸碰磁珠。至此，擴增子文庫構(gòu)建完成，圖1為文庫構(gòu)建完成后Agilent2200TapeStationSystems檢測得到的擴增產(chǎn)物分布圖，橫坐標為片段長度，縱坐標為信號強度(FU)，lower峰為25bp位置marker，upper峰為1500bp位置marker，如圖1所示經(jīng)PCR擴增后所得PCR產(chǎn)物集中在200-260bp范圍內(nèi)，圖1說明實驗結(jié)果和實驗設(shè)計相符合，可以判斷所構(gòu)建文庫的大小及文庫濃度。6、上機測序及結(jié)果分析上述通過融合引物一步法獲得的擴增子文庫，使用IonPGM平臺的318芯片，進行擴增子測序，每個文庫的數(shù)據(jù)量為250～500Mbps。所得測序結(jié)果如圖2所示，可以進一步對22擴增子的各擴增子是否進行了擴增以及各擴增子的擴增均一性進行分析。測序的結(jié)果經(jīng)過數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析之后得到檢測基因的突變情況。數(shù)據(jù)處理過程包括測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、質(zhì)控、序列比對(參考基因組為NCBIGRCh37/Hg19)、突變位點分析等過程，通過數(shù)據(jù)處理分析后得到檢測樣本的突變信息。實際收集的樣本檢測情況如下：5份受檢者的FFPE樣本中，2份正常人樣本未檢測到腫瘤相關(guān)突變，3份腫瘤患者的FFPE樣本檢測結(jié)果中，Sample1檢測到p.V157F突變，sample2檢測到c.181C>A和p.Q61K突變，sample3檢測到p.L858R突變。該結(jié)果和sanger檢測的結(jié)果一致。充分說明了本發(fā)明的實際應(yīng)用性和良好特異性。前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。SEQUENCELISTING<110>北京泛生子醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司<120>一種快速構(gòu)建擴增子文庫的融合引物組合<130>P163149DD1F<160>68<170>PatentInversion3.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2cctctctatgggcagtcggtgat23<210>3<211>159<212>DNA<213>人ALK基因的Chr2:29432588-29432707擴增子<400>3taagggacaagcagccacaccccattcttgaggggctgaggtggaagagacaggcccgga60ggggtgaggcagtctttactcacctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatct120tggccactcttccagggcctggacaggtcaagaggcagt159<210>4<211>159<212>DNA<213>人ALK基因的Chr2:29443616-29443730擴增子<400>4cggaggaaggacttgaggtctccccccgccatgagctccagcaggatgaaccggggcagg60gattgcaggctcaccccaatgcagcgaacaatgttctggtggttgaatttgctgcagagc120agagagggatgtaaccaaaattaactgagctgagtctgg159<210>5<211>163<212>DNA<213>人BRAF基因的Chr7:140453091-140453197擴增子<400>5cctcaattcttaccatccacaaaatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccac60tccatcgagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcat120gaagaaatatatctgaggtgtagtaagtaaaggaaaacagtag163<210>6<211>169<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55241604-55241726擴增子<400>6tgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagcttgtggagcctcttacacccagtgga60gaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaa120gtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataaggtaaggtccctgg169<210>7<211>161<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55242398-55242513擴增子<400>7acaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaagg60tgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagc120caacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgt161<210>8<211>166<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55248970-55249096擴增子<400>8gaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggccagcgtgga60caacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcac120gcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacac166<210>9<211>163<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55259505-55259621擴增子<400>9ccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaa60gaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcct120gacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttta163<210>10<211>155<212>DNA<213>人ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082擴增子<400>10cataccctctcagcgtacccttgtccccaggaagcatacgtgatggctggtgtgggctcc60ccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacag120cttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccg155<210>11<211>150<212>DNA<213>人KRAS基因的Chr12:25380261-25380363擴增子<400>11agtcctcatgtactggtccctcattgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaat60atccaagagacaggtttctccatcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagg120gagaaacacagtctggattattacagtgca150<210>12<211>172<212>DNA<213>人KRAS基因的Chr12:25398183-25398310擴增子<400>12aaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaa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