本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仿刺參的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育有利于快速建立純系，因此對(duì)于遺傳育種及基礎(chǔ)生物學(xué)的研究具有重要意義。在海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類方面，該領(lǐng)域的研究相對(duì)滯后，目前僅在近十種海洋經(jīng)濟(jì)貝類中進(jìn)行了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學(xué)方法滅活精子，從而誘導(dǎo)卵子的雌核發(fā)育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾，所以近年來有學(xué)者嘗試采用異源精子誘導(dǎo)來消除這種干擾，如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而，異源精子誘導(dǎo)依賴于物種的特異性，且受多種環(huán)境因素的影響，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激動(dòng)也往往不同步，而且如果滅活不充分的話，其實(shí)仍有精子污染的問題，因此限制了其在雌核發(fā)育中的應(yīng)用。
與傳統(tǒng)的同源或異源精子誘導(dǎo)法相比，電刺激誘導(dǎo)法在整個(gè)過程中不需要精子的參與，能徹底排除外源精子基因組的干擾，是理想的誘導(dǎo)方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動(dòng)物中被廣泛應(yīng)用并取得了很大的成功。其機(jī)制是采用電刺激的方式，使卵母細(xì)胞膜上形成可逆微孔，緩沖液中的鈣離子順細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度而進(jìn)入卵胞質(zhì)，引發(fā)鈣庫釋放鈣離子或者胞質(zhì)鈣離子的迅速轉(zhuǎn)移，從而模擬正常受精時(shí)鈣離子規(guī)律性的波動(dòng)現(xiàn)象啟動(dòng)卵子發(fā)育。但迄今為止，該方法在海洋生物雌核發(fā)育研究中，尚無報(bào)道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導(dǎo)仿刺參雌核發(fā)育，對(duì)其誘導(dǎo)參數(shù)及雌核發(fā)育過程中的細(xì)胞學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探索，旨在建立電刺激誘導(dǎo)仿刺參雌核發(fā)育的技術(shù)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明旨在建立電刺激誘導(dǎo)仿刺參雌核發(fā)育的技術(shù)方法。
一種仿刺參的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進(jìn)行電刺激處理；
所述電刺激緩沖液為Zimmerman氏緩沖液，具體成分為：0.1 mmol/L Ca(C2H3O2)2H2O，1 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L Mg(C2H3O2)2·4H2O，0.1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，1% BSA，0.28 mmol/L蔗糖；
所述電脈沖儀參數(shù)為場強(qiáng)0.8 kv/cm，電容3 μF，2次電脈沖。
所述電刺激時(shí)的卵子密度為11×104個(gè)/ml。
電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)方法為：經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持 20℃，培養(yǎng)密度為每個(gè)培養(yǎng)皿中每升約 2×105個(gè)卵子；培養(yǎng)初期每半小時(shí)輕輕攪動(dòng)海水一次，以后每 3~4h 攪動(dòng)一次，以促進(jìn)其孵化。
電刺激處理后 2 小時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的卵裂率，24 小時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎存活率；
卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%；
胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%。
本發(fā)明的方法簡單有效，經(jīng)電刺激誘導(dǎo)后，仿刺參的卵裂率可達(dá)到28%以上，胚胎存活率可達(dá)到98%以上。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
親本的暫養(yǎng)與精卵的收集
仿刺參取回后暫養(yǎng)于14℃循環(huán)海水中，雌雄個(gè)體分開暫養(yǎng)。投喂餌料。暫養(yǎng)期間每天升溫1℃，至16~17℃恒溫待產(chǎn)。采用光照刺激法獲得卵子，待卵子產(chǎn)出后，先用 300 目篩絹過濾卵子，然后用 500 目的篩絹過濾收集卵子，稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整卵子的密度。
仿刺參卵子的電刺激處理
卵子雌核發(fā)育的誘導(dǎo)：采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進(jìn)行電刺激處理。
所述電刺激緩沖液為Zimmerman氏緩沖液，具體成分為：0.1 mmol/L Ca(C2H3O2)2H2O，1 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L Mg(C2H3O2)2·4H2O，0.1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，1% BSA，0.28 mmol/L蔗糖。
所述電脈沖儀參數(shù)為場強(qiáng)0.8 kv/cm，電容3 μF，2次電脈沖。
所述電刺激時(shí)的卵子密度為11×104個(gè)/ml。
電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)
經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持 20℃，培養(yǎng)密度為每個(gè)培養(yǎng)皿中每升約 2×105個(gè)卵子；培養(yǎng)初期每半小時(shí)輕輕攪動(dòng)海水一次，以后每 3~4h 攪動(dòng)一次，以促進(jìn)其孵化。
電刺激處理后 2 小時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的卵裂率，24 小時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎存活率。
卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%
胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%
經(jīng)統(tǒng)計(jì)，上述電刺激誘導(dǎo)后，仿刺參的卵裂率為28.23%，胚胎存活率為98.23%。