本發(fā)明涉及一種酶的提取方法，具體是一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法。
背景技術(shù)：
乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。由于乙酰膽堿酯酶對于乙酰膽堿的高速水解作用，使得其近年來得到越來越多的研究人員的關(guān)注。乙酰膽堿酯酶在生物防治、農(nóng)藥殘留檢測、分子生物學(xué)以及各種神經(jīng)性疾病治療方面有廣泛的應(yīng)用。最近研究表明，氨基甲酸乙酯在一定程度上可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，因此乙酰膽堿酯酶有可能應(yīng)用在氨基甲酸乙酯的檢測上。
乙酰膽堿酯酶廣泛存在于各種動植物組織中，對于動物來說，主要集中在肝臟、血液和腦組織中?，F(xiàn)有的乙酰膽堿酯酶的提取方法普遍存在酶活性差的缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、100-200rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合15-20min，獲得第一混合液；
2)將第一混合液在0-4℃下靜置12-24小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、300-400rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿8-12min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、7500-8000rpm的條件下冷凍離心23-28min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得最終純化物；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟1)中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的3-5倍。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟1)中，所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.5-0.8％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟1)中，所述混合緩沖提取液的pH為7.2-7.6。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟5)中，體系pH為7.3。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟6)中，體系pH為7.5。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟7)中，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提取方法所獲得的乙酰膽堿酯酶的酶活性高，純度高，靈敏度高的優(yōu)點，且所制得的產(chǎn)品為粉末狀，易于存儲，具有廣闊的市場前景。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
實施例1
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、100rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合15min，獲得第一混合液，其中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的3倍；所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液；所述混合緩沖提取液的pH為7.2；
2)將第一混合液在0℃下靜置12小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、300rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿8min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、7500rpm的條件下冷凍離心23min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物，其中，Procainamide親和層析體系pH為7.3；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得產(chǎn)物，其中，SephadexG-200凝膠柱體系pH為7.5；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品，具體為，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。
實施例2
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、150rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合16min，獲得第一混合液，其中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的3倍；所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.6％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液；所述混合緩沖提取液的pH為7.3；
2)將第一混合液在0℃下靜置15小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、320rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿9min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、7600rpm的條件下冷凍離心24min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物，其中，Procainamide親和層析體系pH為7.3；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得產(chǎn)物，其中，SephadexG-200凝膠柱體系pH為7.5；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品，具體為，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。
實施例3
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、150rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合18min，獲得第一混合液，其中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的4倍；所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.7％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液；所述混合緩沖提取液的pH為7.4；
2)將第一混合液在2℃下靜置18小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、350rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿10min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、7800rpm的條件下冷凍離心25min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物，其中，Procainamide親和層析體系pH為7.3；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得產(chǎn)物，其中，SephadexG-200凝膠柱體系pH為7.5；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品，具體為，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。
實施例4
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、180rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合19min，獲得第一混合液，其中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的5倍；所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.7％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液；所述混合緩沖提取液的pH為7.5；
2)將第一混合液在4℃下靜置20小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、400rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿10min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、8000rpm的條件下冷凍離心26min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物，其中，Procainamide親和層析體系pH為7.3；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得產(chǎn)物，其中，SephadexG-200凝膠柱體系pH為7.5；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品，具體為，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。
實施例5
一種從馬血中提取乙酰膽堿酯酶的方法，步驟如下：
1)取新鮮馬血，加入混合緩沖提取液，在4℃冰浴、200rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌混合20min，獲得第一混合液，其中，所述混合緩沖提取液的加入量為所用的新鮮馬血體積的5倍；所述混合緩沖提取液中含有質(zhì)量百分比為0.8％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量為磷酸鹽緩沖液；所述混合緩沖提取液的pH為7.6；
2)將第一混合液在4℃下靜置24小時，獲得第二混合液；
3)將第二混合液在4℃冰浴、400rpm的轉(zhuǎn)速下勻漿12min，獲得第三混合液；
4)將第三混合液在4℃、8000rpm的條件下冷凍離心28min，取上清液，獲得第四混合液；
5)采用Procainamide親和層析法對第四混合液進(jìn)行純化處理，獲得初次純化物，其中，Procainamide親和層析體系pH為7.3；
6)采用SephadexG-200凝膠柱對初次純化物進(jìn)行純化處理，獲得產(chǎn)物，其中，SephadexG-200凝膠柱體系pH為7.5；
7)將最終純化物濃縮，干燥，即得產(chǎn)品，具體為，采用透析法于4℃下濃縮最終純化物，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。
采用本發(fā)明實施例1-5的提取方法對馬血進(jìn)行提取，采用乙酸-β-萘酯顯色法測定活力，所獲得的乙酰膽堿酯酶的活力為85.25-90.57U/mg。采用靛酚乙酸酯顯色法對獲得的乙酰膽堿酯酶進(jìn)行靈敏度測定，其檢出極限為10-15μg/mL。
本發(fā)明提取方法所獲得的乙酰膽堿酯酶的酶活性高，純度高，靈敏度高的優(yōu)點，且所制得的產(chǎn)品為粉末狀，易于存儲，具有廣闊的市場前景。
上面對本發(fā)明的較佳實施方式作了詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下作出各種變化。