本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
背景技術(shù)：
IL15為白介素15，通常情況下用于NK細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和CD8細(xì)胞的先天免疫力和后天獲得應(yīng)性免疫力的激活過程，作為免疫調(diào)節(jié)劑可以增強(qiáng)體內(nèi)免疫細(xì)胞(如：T細(xì)胞和NK細(xì)胞)的免疫活性。IL15可以結(jié)合IL15受體，比如：IL15受體α又名CD215，IL15受體β又名CD122和IL2受體γ又名CD132，陽(yáng)性細(xì)胞。IL15的作用方式通過結(jié)合親和力最高的CD215分子形成一個(gè)IL15-CD215復(fù)合物，隨后這個(gè)復(fù)合物會(huì)把IL15呈遞給CD122或者CD132陽(yáng)性的免疫細(xì)胞(如：T細(xì)胞和NK細(xì)胞)進(jìn)而激活CD122或者CD132陽(yáng)性的免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)控和調(diào)節(jié)作用。
Chenoweth MJ等在《Journal of Immunology:baltimore,Md:》，2012，188(9):4149中發(fā)表了“IL-15Can Signal via IL-15Ra,JNK,and NF-kB To Drive RANTES Production by Myeloid Cells”，其公開報(bào)道過IL15可以刺激CD45+CD215+細(xì)胞分泌RANTES，但是該研究未能聯(lián)系IL15通過作用于CD45+CD215+細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
P Marra等在《Cancer Research》，2014Sep 1；74(17):4908-21.doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-0637發(fā)表了“IL15RA Drives Antagonistic Mechanisms of Cancer Development and Immune Control in Lymphocyte-Enriched Triple-Negative Breast Cancers”，其中公開報(bào)道IL15可以激活CD215陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)抑制CD215陽(yáng)性凋亡最終促進(jìn)CD215陽(yáng)性細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是該研究未能聯(lián)系IL15通過作用于CD215陽(yáng)性細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
H Kuniyasu等在《Clinical Cancer Research》，2003，9(13):4802-10中發(fā)表了“Production of Interleukin 15by Human Colon Cancer Cells Is Associated with Induction of Mucosal Hyperplasia,Angiogenesis,and Metastasis”，其中公開報(bào)道了表達(dá)IL15的腫瘤細(xì)胞能促進(jìn)血管生成最終增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但是該研究未能聯(lián)系IL15通過作用于CD215陽(yáng)性細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
Moutih Rafei等在《Blood》，2007 109:2234-2242中發(fā)表了“AGMCSF and IL-15fusokine leads to paradoxical immunosuppression in vivo via asymmetrical JAK/STAT signaling through the IL-15receptor complex”，公開了將IL15和GM-CSF融合形成一個(gè)新的復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是該研究未能聯(lián)系IL15通過作用于CD215陽(yáng)性細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，通過IL15細(xì)胞因子促進(jìn)CD45+CD215+細(xì)胞分泌促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞因子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括如下步驟：將腫瘤細(xì)胞與CD45+CD215+細(xì)胞和IL15細(xì)胞因子共培養(yǎng)；
其中，所述腫瘤細(xì)胞為前列腺癌細(xì)胞。
本發(fā)明中IL15通過刺激CD45+CD215+細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IGF1，而IGF1作用于前列腺癌細(xì)胞，最終促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，通過將CD45+CD215+細(xì)胞和IL15細(xì)胞因子與前列腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，能夠明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，
根據(jù)本發(fā)明，所述CD45+CD215+細(xì)胞來自于小鼠體內(nèi)，優(yōu)選為第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，本發(fā)明中所述第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-來自于專利201310089275.2。
本發(fā)明中，所述CD45+CD215+細(xì)胞的制備方法是常規(guī)的流式細(xì)胞儀分選方法，具體步驟如下：
1)脫頸處死第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，隨后浸泡在75％的酒精里面消毒殺菌15分鐘；
2)在無菌環(huán)境取出小鼠的脾臟后在75％的酒精里浸泡消毒殺菌5分鐘；
3)取出脾臟在無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)里洗去多余的75％酒精；
4)將脾臟置于100目的篩網(wǎng)，在3-5mL的PBS中研磨，制備成單細(xì)胞懸液；
5)把脾臟細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，300g離心5分鐘；
6)棄上清加3-5mL的紅細(xì)胞裂解液(eBioscience)，室溫裂解5分鐘；
7)加5mL PBS中和紅細(xì)胞裂解液，300g離心5分鐘；
8)棄上清，根據(jù)說明書孵育CD215-PE(eBioscience)和CD45-APC抗體(eBioscience)30分鐘，再用10mLPBS洗去多余的抗體；
9)在分選型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)里分選出CD45+CD215+細(xì)胞,分選出來的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸作為備用樣本細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)過不同CD45+CD215+細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在含有IL15培養(yǎng)基共培養(yǎng)的結(jié)果，所述CD45+CD215+細(xì)胞與所述腫瘤細(xì)胞的比例為(300-600):1，例如可以是300:1、310:1、320:1、330:1、340:1、350:1、360:1、370:1、380:1、390:1、400:1、410:1、420:1、430:1、450:1、460:1、480:1、500:1、520:1、530:1、550:1、560:1、580:1或600:1，優(yōu)選為(360-500):1，進(jìn)一步優(yōu)選為450:1。
根據(jù)本發(fā)明，所述CD45+CD215+細(xì)胞的接種密度為(1-5)×104/mL，例如可以是1×104/mL、1.2×104/mL、1.5×104/mL、2×104/mL、2.5×104/mL、3×104/mL、3.5×104/mL、4×104/mL、4.5×104/mL或5×104/mL，優(yōu)選為(1-3)×104/mL，進(jìn)一步優(yōu)選為2×104/mL。
根據(jù)本發(fā)明，所述IL15細(xì)胞因子的接種密度為50-600ng/mL，例如可以是50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、230ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、280ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、380ng/mL、400ng/mL、420ng/mL、450ng/mL、480ng/mL、500ng/mL、520ng/mL、550ng/mL、580ng/mL或600ng/mL，優(yōu)選為100-500ng/mL。
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素雙抗(P/S)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基、體積比為10％胎牛血清、體積比為1％青霉素/鏈霉素雙抗和20ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的溫度為35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優(yōu)選為37℃。
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的濕度為90-98％，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，優(yōu)選為92-97％，進(jìn)一步優(yōu)選為95％。
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的CO2濃度為2-10％，例如可以是2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，優(yōu)選為3-6％，進(jìn)一步優(yōu)選為5％；
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為110-150h，例如可以是110h、112h、115h、120h、122h、125h、128h、130h、132h、135h、138h、140h、142h、145h、148h或150h，優(yōu)選為115-130h，進(jìn)一步優(yōu)選為120h。
根據(jù)本發(fā)明，所述共培養(yǎng)的過程需要每1-4天進(jìn)行半換液，例如可以是1天、2天、3天或4天，優(yōu)選為1-3天進(jìn)行半換液，進(jìn)一步優(yōu)選為2天進(jìn)行半換液。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法包括如下步驟：
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入25-35個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)用1640培養(yǎng)基、體積比為10％胎牛血清、體積比為1％青霉素/鏈霉素雙抗、20ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子組成的培養(yǎng)基重懸的CD45+CD215+細(xì)胞，控制密度在(1-5)×104/mL；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入重懸的CD45+CD215+細(xì)胞560-650μL和IL15細(xì)胞因子50-600ng/mL；
(4)在溫度35-40℃、濕度90-98％和CO2濃度2-10％下進(jìn)行培養(yǎng)110-150h，培養(yǎng)期間每1-4天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用CD45+CD215+陽(yáng)性細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后，前列腺癌細(xì)胞數(shù)量顯著增長(zhǎng)，相比于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，前列腺癌細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)了1倍以上；
(2)本發(fā)明的方法可用于前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，為腫瘤細(xì)胞用于其他研究奠定了基礎(chǔ)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明方法共培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。
實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1：制備CD45+CD215+細(xì)胞
所述CD45+CD215+陽(yáng)性細(xì)胞的制備方法如下：
1)脫頸處死第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，隨后浸泡在75％的酒精里面消毒殺菌15分鐘；
2)在無菌環(huán)境取出小鼠的脾臟后在75％的酒精里浸泡消毒殺菌5分鐘；
3)取出脾臟在無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)里洗去多余的75％酒精；
4)將脾臟置于100目的篩網(wǎng)，在3-5mL的PBS中研磨，制備成單細(xì)胞懸液；
5)把脾臟細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，300g離心5分鐘；
6)棄上清加3-5mL的紅細(xì)胞裂解液(eBioscience)，室溫裂解5分鐘；
7)加5mL PBS中和紅細(xì)胞裂解液，300g離心5分鐘；
8)棄上清，根據(jù)說明書孵育CD215-PE(eBioscience)和CD45-APC抗體(eBioscience)30分鐘，再用10mLPBS洗去多余的抗體；
9)在分選型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)里分選出CD45+CD215+細(xì)胞,分選出來的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸作為備用樣本細(xì)胞。
實(shí)施例2：前列腺癌細(xì)胞與CD45+CD215+細(xì)胞和IL15細(xì)胞因子共培養(yǎng)
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入30個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)用1640培養(yǎng)基、體積比為10％FBS、體積比為1％P/S、20ng/mL GM-CSF組成的培養(yǎng)基重懸的CD45+CD215+細(xì)胞，控制密度在2×104/mL；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入重懸的CD45+CD215+細(xì)胞600μL和IL15細(xì)胞因子500ng/mL；
(4)在溫度37℃、濕度95％和CO2濃度5％下進(jìn)行培養(yǎng)120h，培養(yǎng)期間每2天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。
(5)培養(yǎng)120小時(shí)后，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；
(6)加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
(7)孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。
實(shí)施例3：前列腺癌細(xì)胞與CD45+CD215+細(xì)胞和IL15細(xì)胞因子共培養(yǎng)
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入25個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)用1640培養(yǎng)基、體積比為10％FBS、體積比為1％P/S、20ng/mL GM-CSF組成的培養(yǎng)基重懸的CD45+CD215+細(xì)胞，控制密度在1×104/mL；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入重懸的CD45+CD215+細(xì)胞650μL和IL15細(xì)胞因子50ng/mL；
(4)在溫度35℃、濕度90％和CO2濃度2％下進(jìn)行培養(yǎng)150h，培養(yǎng)期間每4天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。
(5)培養(yǎng)120小時(shí)后，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；
(6)加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
(7)孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。
測(cè)量得到的吸光值與實(shí)施例2一致，后續(xù)試驗(yàn)都采用實(shí)施例2的方法制備的腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例4：前列腺癌細(xì)胞與CD45+CD215+細(xì)胞和IL15細(xì)胞因子共培養(yǎng)
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入35個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)用1640培養(yǎng)基、體積比為10％FBS、體積比為1％P/S、20ng/mL GM-CSF組成的培養(yǎng)基重懸的CD45+CD215+細(xì)胞，控制密度在5×104/mL；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入重懸的CD45+CD215+細(xì)胞560μL和IL15細(xì)胞因子600ng/mL；
(4)在溫度40℃、濕度98％和CO2濃度10％下進(jìn)行培養(yǎng)120h，培養(yǎng)期間每1天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。
(5)培養(yǎng)120小時(shí)后，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；
(6)加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
(7)孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。
測(cè)量得到的吸光值與實(shí)施例2一致，后續(xù)試驗(yàn)都采用實(shí)施例2的方法制備的腫瘤細(xì)胞。
對(duì)比例1：前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入30個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)配置1640培養(yǎng)基、體積比為10％FBS、體積比為1％P/S、20ng/mL GM-CSF組成的培養(yǎng)基；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入步驟(2)所述培養(yǎng)基600μL；
(4)在溫度37℃、濕度95％和CO2濃度5％下進(jìn)行培養(yǎng)120h，培養(yǎng)期間每2天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。
(5)培養(yǎng)120小時(shí)后，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；
(6)加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
(7)孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。
對(duì)比例2：前列腺癌細(xì)胞與IL15細(xì)胞因子共培養(yǎng)
(1)共培養(yǎng)的前一天在96孔板內(nèi)種入30個(gè)前列腺癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)；
(2)配置1640培養(yǎng)基、體積比為10％FBS、體積比為1％P/S、20ng/mL GM-CSF組成的培養(yǎng)基；
(3)培養(yǎng)前挑選出孔內(nèi)前列腺癌細(xì)胞數(shù)量為25-35的孔用于共培養(yǎng)，加入步驟(2)所述培養(yǎng)基600μL和IL15細(xì)胞因子500ng/mL；
(4)在溫度37℃、濕度95％和CO2濃度5％下進(jìn)行培養(yǎng)120h，培養(yǎng)期間每2天采用新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行半換液；
(5)培養(yǎng)120小時(shí)后，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；
(6)加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；
(7)孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。
對(duì)比例3：前列腺癌細(xì)胞與CD45+CD215+細(xì)胞共培養(yǎng)
對(duì)比例3與實(shí)施例2的不同僅在于步驟(3)不加入IL15細(xì)胞因子，其他的培養(yǎng)方法和條件都與實(shí)施例2相同。
將實(shí)施例2和對(duì)比例1-3培養(yǎng)后的結(jié)果進(jìn)行紫外分光光度計(jì)分析，具體的檢測(cè)步驟為：將培養(yǎng)120小時(shí)后的培養(yǎng)液，用無菌PBS輕輕涮洗前列腺癌細(xì)胞；加入100μL CCK8試劑，于溫度37℃，濕度95％和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)；孵育結(jié)束后，檢測(cè)450nm的吸光值。結(jié)果如圖1所示，可以看出實(shí)施例2的吸光值最大，并且實(shí)施例2的吸光值為對(duì)比例1和對(duì)比例的2倍，說明實(shí)施例2中的前列腺癌細(xì)胞數(shù)是對(duì)比例1和對(duì)比例2中前列腺癌細(xì)胞的2倍。
綜上所述，當(dāng)采用CD45+CD215+陽(yáng)性細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞在含有IL15的培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)后，前列腺癌細(xì)胞數(shù)量顯著增長(zhǎng)。相比于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)和前列腺癌細(xì)胞與含有IL15的培養(yǎng)基培養(yǎng)和前列腺癌細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)了1倍以上。
申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。