本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一類(lèi)在早期發(fā)育過(guò)程中除造血干細(xì)胞以外具備全能細(xì)胞特點(diǎn)的另一類(lèi)多能干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化潛能，可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，在脊髓損傷、糖尿病足以及免疫性疾病中得到廣泛應(yīng)用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由于來(lái)源廣泛，取材方便，對(duì)供著無(wú)不利影響，且不涉及倫理道德限制問(wèn)題，具備廣泛的臨床應(yīng)用前景。

目前已有的多種干細(xì)胞培養(yǎng)基，多為通用型干細(xì)胞培養(yǎng)基，并不僅用于單一特定的干細(xì)胞培養(yǎng)，多用于各種類(lèi)干細(xì)胞培養(yǎng)。然而由于各類(lèi)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，不同干細(xì)胞品種培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)條件不盡相同，如果通用培養(yǎng)基無(wú)法滿(mǎn)足單一類(lèi)型干細(xì)胞的生長(zhǎng)需求，可能引起該種類(lèi)干細(xì)胞存活率降低，生長(zhǎng)受抑，增殖緩慢，細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)性狀等的改變，進(jìn)而無(wú)法滿(mǎn)足干細(xì)胞的臨床應(yīng)用需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。解決現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存在的分離獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存活率降低，增殖緩慢，細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)性狀等易發(fā)生改變，無(wú)法滿(mǎn)足干細(xì)胞的臨床應(yīng)用需求的問(wèn)題。

本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，由無(wú)血清基本培養(yǎng)基和添加成分組成；所述添加成分為人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和細(xì)胞因子組合；所述細(xì)胞因子組合為表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、IL-3和IL-6。

根據(jù)需要，本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以由以液體形式存在的所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基和以固體形式存在的所述添加成分構(gòu)成，也可以是向以液體形式存在的所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基中添加了所述添加成分后形成的液體培養(yǎng)基。

在所述添加成分中，所述人胰島素、所述人血清白蛋白、所述轉(zhuǎn)鐵蛋白和所述細(xì)胞因子組合的質(zhì)量配比可為(2-10)μg：(0.1-1)mg：(2-10)μg：(6-110)ng。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述添加成分中，所述人胰島素、所述人血清白蛋白、所述轉(zhuǎn)鐵蛋白和所述細(xì)胞因子組合的質(zhì)量配比具體為5μg：0.5mg：5μg：56ng。

在所述細(xì)胞因子組合中，所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、所述血小板衍生生長(zhǎng)因子、所述IL-3和所述IL-6的質(zhì)量配比可為(1-5)：(1-5)：(2-50)：(2-50)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞因子組合中，所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、所述血小板衍生生長(zhǎng)因子、所述IL-3和所述IL-6的質(zhì)量配比具體為3：3：20：30。

當(dāng)本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基為向以液體形式存在的所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基中添加了所述添加成分后形成的液體培養(yǎng)基時(shí)，所述培養(yǎng)基中，所述人胰島素的濃度可為2-10μg/mL；所述人血清白蛋白的濃度可為0.1-1mg/mL；所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度可為2-10μg/mL；所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度可為1-5ng/mL；所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度可為1-5ng/mL；所述IL-3的濃度可為2-50ng/mL；所述IL-6的濃度可為2-50ng/mL。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基中，所述人胰島素的濃度具體為5μg/mL；所述人血清白蛋白的濃度具體為0.5mg/mL；所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度具體為5μg/mL；所述表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度具體為3ng/mL；所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度具體為3ng/mL；所述IL-3的濃度具體為20ng/mL；所述IL-6的濃度具體為30ng/mL。

所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基可選自如下中任一：α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、IMDM/F12培養(yǎng)基。其中，以所述α-MEM培養(yǎng)基為最優(yōu)選。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基具體為向所述α-MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為5μg/mL的人胰島素、終濃度為0.5mg/mL的人血清白蛋白、終濃度為5μg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為3ng/mL的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、終濃度為3ng/mL的血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、終濃度為20ng/mL的IL-3和終濃度為30ng/mL的IL-6后得到的培養(yǎng)基。

本發(fā)明還保護(hù)所述用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備方法。

本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備方法，具體包括如下(A)或(B)的步驟：

(A)將以液體形式存在的所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基單獨(dú)包裝，得到包裝A；將以固體形式存在的組成所述添加成分中的各物質(zhì)按照前文所述的質(zhì)量配比混合并包裝，得到包裝B；所述包裝A和所述包裝B即構(gòu)成所述用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

(B)向以液體形式存在的所述無(wú)血清基本培養(yǎng)基中添加所述添加成分，使組成所述添加成分中的各物質(zhì)在所述培養(yǎng)基中的濃度為前文所述的濃度，即得到所述用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

另外，所述用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

(a)培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

(b)提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力；

(c)提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力；

(d)提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化成脂能力；

(e)提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化成骨能力。

在本發(fā)明中，最初被培養(yǎng)的所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選為原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具體為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、IL-3和IL-6，各類(lèi)因子低濃度聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同促進(jìn)MSC的增殖作用，并延緩MSC在培養(yǎng)過(guò)程中的老化現(xiàn)象，使MSC在傳到第15代以上時(shí)，仍可以保持較好的增殖及分化能力，保持原有的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，特別是在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面達(dá)到甚至優(yōu)于含血清培養(yǎng)基或其他無(wú)血清培養(yǎng)基的效果。另外，本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基不含外源性血清，極大地避免了含血清培養(yǎng)基由于所添加血清批次間不穩(wěn)定，或可能由于含有的異源性蛋白引起細(xì)胞毒性等的風(fēng)險(xiǎn)。

與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基和其他無(wú)血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于：無(wú)需進(jìn)行培養(yǎng)瓶包被，操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞增殖速率高，且保持了良好的干細(xì)胞幼稚形態(tài)和特性，并具有良好的細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能，降低了成本。

附圖說(shuō)明

圖1為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖能力比較結(jié)果。

圖2為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的成脂誘導(dǎo)分化潛能和成骨誘導(dǎo)分化潛能比較結(jié)果。

圖3為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例1制備的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)后細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

α-MEM培養(yǎng)基：Hyclone公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為SH30265.01B。

人胰島素：Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為I3536。

人血清白蛋白：Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為A9731。

轉(zhuǎn)鐵蛋白：Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為T(mén)8158。

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)：R&D公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為#.236-EG。

血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)：R&D公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為#220-BB。

IL-3：R&D公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為#203-IL。

IL-6：R&D公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為#206-IL。

實(shí)施例1、本發(fā)明用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備

本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，由無(wú)血清基本培養(yǎng)基和添加成分組成；所述添加成分為人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和細(xì)胞因子組合；所述細(xì)胞因子組合為表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-3和IL-6。其具體制備過(guò)程如下：

向無(wú)血清基本培養(yǎng)基——α-MEM培養(yǎng)基中加入人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、IL-3和IL-6，使人胰島素的終濃度為5μg/mL、人血清白蛋白的終濃度為0.5mg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白的終濃度為5μg/mL、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為3ng/mL、血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為3ng/mL、IL-3的終濃度為20ng/mL、IL-6的終濃度為30ng/mL，即得到本發(fā)明用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

實(shí)施例2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖能力比較

一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得及檢測(cè)

本發(fā)明所用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于足月妊娠分娩胎兒臍帶(捐贈(zèng)者知情且同意)。對(duì)P1代(即原代)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行ABO/RH血型分型、HLA分型、微生物學(xué)檢測(cè)，HIV，HBV，HCV，TP檢測(cè)，以上各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

二、供試培養(yǎng)基

培養(yǎng)基-I：本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基-II：α-MEM培養(yǎng)基+10％體積百分比的FBS。

培養(yǎng)基-III：市售無(wú)血清培養(yǎng)基(StemPro MSC SFM人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)

基)，Invitrogen公司產(chǎn)品，貨號(hào)A10332-01。

三、比較人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖能力

將P1代(即原代)hUC-MSCs以5000個(gè)/ml的密度接種到T25培養(yǎng)瓶中，接種5mL，分別用培養(yǎng)基-I、培養(yǎng)基-II和培養(yǎng)基-III培養(yǎng)，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％匯合度時(shí)加入含0.25％(體積百分含量)Trypsin和0.04％(體積百分含量)EDTA的消化液進(jìn)行消化，計(jì)算細(xì)胞量，然后以5000個(gè)/ml的密度再次傳代培養(yǎng)，直至第9代，根據(jù)每個(gè)代次的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算每代的平均細(xì)胞群體倍增數(shù)目(Cumulative Population Doublings，CPDs)，繪制細(xì)胞群體倍增曲線。

CPDs＝lg(培養(yǎng)后細(xì)胞計(jì)數(shù)/培養(yǎng)前細(xì)胞計(jì)數(shù))/lg2

結(jié)果如圖1所示，由圖可見(jiàn)：培養(yǎng)基-I培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速率顯著大于其他兩類(lèi)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基-II與培養(yǎng)基-III)。這說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠提高細(xì)胞的增殖能力。

實(shí)施例3、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的成脂誘導(dǎo)分化潛能比較

一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得及檢測(cè)

同實(shí)施例2。

二、供試培養(yǎng)基

同實(shí)施例2。

三、比較人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的成脂誘導(dǎo)分化潛能

將P1代(即原代)hUC-MSCs以5000個(gè)/ml的密度接種到T25培養(yǎng)瓶中，接種5mL，分別用培養(yǎng)基-I、培養(yǎng)基-II和培養(yǎng)基-III培養(yǎng)，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％匯合度時(shí)加入含0.25％(體積百分含量)Trypsin和0.04％(體積百分含量)EDTA的消化液進(jìn)行消化，計(jì)算細(xì)胞量，然后以5000個(gè)/ml的密度再次傳代培養(yǎng)，直至第9代。將P9代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以4×10⁴細(xì)胞/孔，分別接種入12孔培養(yǎng)板中，待24h后細(xì)胞完全貼壁后，換以成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(Life Tecnology公司產(chǎn)品，貨號(hào)A10070-01)，每3天換液一次，第21天時(shí)用油紅O進(jìn)行成脂鑒定。

結(jié)果如圖2所示，由圖可見(jiàn)：培養(yǎng)基-I所培養(yǎng)的細(xì)胞其成脂分化潛能明顯優(yōu)于培養(yǎng)基-II和培養(yǎng)基-III。這說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠提高細(xì)胞的分化成脂能力。

實(shí)施例4、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的成骨誘導(dǎo)分化潛能比較

一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得及檢測(cè)

同實(shí)施例2。

二、供試培養(yǎng)基

同實(shí)施例2。

三、比較人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的成骨誘導(dǎo)分化潛能

將P1代(即原代)hUC-MSCs以5000個(gè)/ml的密度接種到T25培養(yǎng)瓶中，接種5mL，分別用培養(yǎng)基-I、培養(yǎng)基-II和培養(yǎng)基-III培養(yǎng)，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％匯合度時(shí)加入含0.25％(體積百分含量)Trypsin和0.04％(體積百分含量)EDTA的消化液進(jìn)行消化，計(jì)算細(xì)胞量，然后以5000個(gè)/ml的密度再次傳代培養(yǎng)，直至第5代。將P5代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以4×10⁴細(xì)胞/孔，分別接種入12孔培養(yǎng)板中，待24h后細(xì)胞完全貼壁后，換以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(Life Tecnology公司，貨號(hào)A10072-01)，每3天換液一次，分別取培養(yǎng)后第14、28天，做堿性磷酸酶鈣鈷法染色和鈣Von Kossa染色，確認(rèn)骨組織形成。

結(jié)果如圖2所示，由圖可見(jiàn)：培養(yǎng)基-I所培養(yǎng)的細(xì)胞其成骨分化潛能優(yōu)于培養(yǎng)基-II和培養(yǎng)基-III。這說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠提高細(xì)胞的分化成骨能力。

實(shí)施例5、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例1制備的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)后細(xì)胞表型檢測(cè)

一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得及檢測(cè)

同實(shí)施例2。

二、檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的細(xì)胞表型

將P1代(即原代)hUC-MSCs以5000個(gè)/ml的密度接種到T25培養(yǎng)瓶中，接種5mL，用實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％匯合度時(shí)加入含0.25％(體積百分含量)Trypsin和0.04％(體積百分含量)EDTA的消化液進(jìn)行消化，計(jì)算細(xì)胞量，然后以5000個(gè)/ml的密度再次傳代培養(yǎng)，直至第15代。

分別將P1代(即原代)hUC-MSCs和P15代hUC-MSCs經(jīng)PBS洗滌2～3遍后加入含0.25％(體積百分含量)Trypsin和0.04％(體積百分含量)EDTA的消化液進(jìn)行消化，1000r/min離心5min，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成濃度為10⁵個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，加入10μL特異性抗體(分別為用于檢測(cè)CD45、CD34、CD44和CD90的抗體)，在4℃下孵育30min，用PBS洗滌2～3遍，1000r/min離心5min，用500μL的PBS重懸細(xì)胞，加入帶有免疫熒光的抗體進(jìn)行孵育，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果如圖3所示，由圖可見(jiàn)：流式檢測(cè)結(jié)果顯示該臍帶MSC P1代細(xì)胞CD34^-CD44⁺的表達(dá)率為96.9％，CD45^-CD90⁺的表達(dá)率高達(dá)97.6％；而臍帶MSC P15代細(xì)胞CD34^-CD44⁺的表達(dá)率為94.1％，CD45^-CD90⁺的表達(dá)率為95.4％。結(jié)果表明，P15代的細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)率，與P1代細(xì)胞的表達(dá)率相比，并無(wú)明顯的改變，均為較高水平的表達(dá)。這說(shuō)明采用本發(fā)明實(shí)施例1制備的用于培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)15次傳代培養(yǎng)，能夠很好的維持細(xì)胞生物學(xué)特性不變。