一種負(fù)載前列腺癌抗原的dc細(xì)胞及一種dc細(xì)胞腫瘤疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫領(lǐng)域，尤其涉及一種負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞及一種DC 細(xì)胞腫瘤疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤。2004年WHO《泌尿系統(tǒng)及男性生 殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》中前列腺癌病理類型上包括腺癌（腺泡腺癌）、導(dǎo)管腺癌、尿 路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌。其中前列腺腺癌占95%以上，因此，通常我們所說(shuō)的前列腺 癌就是指前列腺腺癌。前列腺癌是老年男性常見(jiàn)疾病，近幾年前列腺癌在中國(guó)的診出率呈 顯著增高趨勢(shì)。
[0003] 近年來(lái)，隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)一些蛋白在前列腺癌患者 的體內(nèi)異常表達(dá)，例如：
[0004] 1979年Wang等首先從前列腺組織中分離出前列腺癌特異性抗原PSA。PSA的分子 量為34kDa，存在于前列腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和前列腺上皮細(xì)胞及分泌物中，當(dāng)人患上前列腺癌時(shí)，患 者血清中游離的PSA(F-PSA)及總PSA(T-PSA)值均明顯升高，以T-PSA升高更明顯，故游離 PSA與總PSA比值（F/T比值）下降。F/T比值可用于區(qū)別前列腺癌與前列腺增生癥。尤其 當(dāng)PSA水平限定在4~10 μ g/L范圍時(shí)，應(yīng)用F/T比值較PSA為優(yōu)。目前PSA已成為前列 腺癌最敏感的瘤標(biāo)，前列腺癌危險(xiǎn)性隨PSA升高而增大。因此，PSA對(duì)于前列腺癌的早期診 斷、臨床分期、術(shù)后療效觀察及隨訪具有重要的臨床意義。越來(lái)越多證據(jù)顯示：前列腺特異 性抗原（PSA)水平穩(wěn)定升高者發(fā)生前列腺癌的可能性更大，如果患者的PSA值升高迅速，那 么其癌癥類型更可能威脅生命。因此，將前列腺癌患者血清中的PSA分離濃縮出來(lái)具有十 分重大的意義。
[0005] 隨著研究的深入，還有更多的抗原蛋白在前列腺癌組織中被發(fā)現(xiàn)。
[0006] 樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞 (Antigenpresentingcell，APC)，能夠刺激初始的T細(xì)胞增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；還能夠呈遞 抗原給MHC-I類限制性⑶8+和MHC-II類限制性⑶4+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被 稱為"天然免疫佐劑"，因此在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的地位。近年來(lái)，以DC為基礎(chǔ)的免 疫治療在臨床應(yīng)用中得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
[0007] 現(xiàn)有的樹(shù)突狀細(xì)胞體外負(fù)載的抗原主要是腫瘤細(xì)胞株裂解物。但腫瘤細(xì)胞株在體 外傳代過(guò)程中表面抗原可能發(fā)生改變，制得疫苗的特異性不強(qiáng)，且制得DC細(xì)胞的增殖效果 較弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞 及一種DC細(xì)胞腫瘤疫苗，其DC細(xì)胞的增殖效果更好，疫苗的特異性增強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺 傷效果提尚。
[0009] 本發(fā)明提供的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞制備方法，包括：
[0010] 步驟1 :分離自外周血中⑶14+細(xì)胞；
[0011] 步驟2 :使⑶14+細(xì)胞分化為DC細(xì)胞；
[0012] 步驟3 :分尚前列腺癌患者血衆(zhòng)中分子量為10kDa~50kDa的蛋白；
[0013] 步驟4 :以分子量為lOkDa~50kDa的蛋白刺激所述DC細(xì)胞，制得負(fù)載前列腺癌 抗原的DC細(xì)胞。
[0014] 采用超濾的方式分離前列腺癌患者血漿中分子量為lOkDa~50kDa的蛋白。具體 為，首先截留前列腺癌患者的血漿中分子量小于50kDa的分子，經(jīng)濃縮后，棄除分子量小于 lOkDa的蛋白，即獲得該蛋白。
[0015] 前列腺癌患者血漿中分子量為lOkDa~50kDa的蛋白主要包括PSA。
[0016] 經(jīng)兩次超濾后，蛋白的濃度為2. 115mg/mL。
[0017] 作為優(yōu)選，前列腺癌患者的血漿為自體血漿。
[0018] 與健康人或其他癌癥患者相比，前列腺癌患者血漿中一些特殊的蛋白表達(dá)量增 高，本發(fā)明將這些蛋白富集并將它們負(fù)載在DC細(xì)胞上制備疫苗。
[0019] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟4中刺激所用分子量為lOkDa~50kDa的蛋白濃度為 50 μ g/mL ~60 μ g/mL〇
[0020] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟4中刺激的時(shí)間為48h。
[0021] 本發(fā)明以來(lái)自前列腺癌患者血漿的分子量為lOkDa~50kDa的蛋白刺激DC細(xì)胞 成熟。該蛋白主要包括PSA。以該蛋白刺激后的DC細(xì)胞增殖能力較好，細(xì)胞中CD86+的表 達(dá)率較高。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1中分離采用磁珠法。
[0023] 在一些實(shí)施例中，磁珠法分離⑶14+細(xì)胞具體為：分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞后， 以磁珠法分離⑶14+細(xì)胞。
[0024] 作為優(yōu)選，分離⑶14+細(xì)胞的血漿為自體血漿。
[0025] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟2中分化的誘導(dǎo)劑為GM-CSF和IL-4。
[0026] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)⑶14+細(xì)胞分化的GM-CSF的劑量為500~1000U/mL ;IL-4 的劑量為500~1000U/mL。
[0027] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)⑶14+細(xì)胞分化的培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng)基。
[0028] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)⑶14+細(xì)胞分化的時(shí)間為6-8天。
[0029] 在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)⑶14+細(xì)胞分化的條件為37°C，5% C02，飽和濕度。
[0030] 本發(fā)明提供方法制備的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞。
[0031] 以本發(fā)明提供方法制備的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞制備疫苗對(duì)PC-3細(xì)胞、 DU145細(xì)胞和LNCAP細(xì)胞的殺傷活性較高。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種DC細(xì)胞腫瘤疫苗，包括本發(fā)明提供方法制備的負(fù)載前列腺 癌抗原的DC細(xì)胞。
[0033] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明提供的DC細(xì)胞腫瘤疫苗還包括生理鹽水和BSA。
[0034] 將本發(fā)明提供的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞以生理鹽水重懸后，加入BSA防止細(xì) 胞集聚成團(tuán)，即可獲得DC細(xì)胞腫瘤疫苗。
[0035] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞腫瘤疫苗中，負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞的密度為 2-5 X 105/ml，BSA 的濃度為 2-5 %。
[0036] 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞腫瘤疫苗作為治療前列腺癌的藥物的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，以PC-3細(xì)胞、DU145細(xì)胞和LNCAP細(xì)胞為靶細(xì)胞，將本發(fā)明提供 的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后獲得效應(yīng)細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混 合培養(yǎng)計(jì)算殺傷率。結(jié)果顯示，與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)獲得的負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞相比， 本發(fā)明提供的DC細(xì)胞能夠更有效的殺傷靶細(xì)胞，殺傷率可達(dá)48%。
[0038] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，靶效比為40:1~10:1。
[0039] 本發(fā)明通過(guò)超濾富集前列腺癌患者血衆(zhòng)中分子量為10kDa~50kDa的蛋白，該蛋 白中主要包括PSA ;將該蛋白用于刺激DC細(xì)胞成熟，使DC細(xì)胞負(fù)載前列腺癌抗原，負(fù)載前 列腺抗原后的DC細(xì)胞增殖效果更好，且能夠刺激CIK細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞株產(chǎn)生殺傷作 用，且該效果優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)制備的DC細(xì)胞腫瘤疫苗。因此，本發(fā)明提供方法制備的負(fù)載前 列腺抗原的DC細(xì)胞能夠制備腫瘤疫苗用于治療前列腺癌。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1示實(shí)施例4和對(duì)比例1的獲得細(xì)胞的增殖曲線，其中示實(shí)施例4獲得 細(xì)胞的增殖曲線，、示對(duì)比例1獲得細(xì)胞的增殖曲線；
[0041] 圖2示實(shí)施例4和對(duì)比例1的細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)率，其中，圖2-a示實(shí)施例4的獲得 細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)率，其中，圖2-b示對(duì)比例1的獲得細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)率。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明提供了一種負(fù)載前列腺癌抗原的DC細(xì)胞及一種DC細(xì)胞腫瘤疫苗，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換 和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0043] 本發(fā)明采用的細(xì)胞、試劑或儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
[0044] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0045] 實(shí)施例1⑶14+細(xì)胞的分離
[0046] 1、取前列腺癌患者的外周血，將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離心管中，400~500g 離心5~lOmin，離心結(jié)束后將上層血漿收集于另一支離心管中，用于實(shí)施例3。
[0047] 2、將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。
[0048] 3、另取一支新的sepmate離心管（購(gòu)自STEM CELL公司），加入Ficoll淋巴細(xì)胞分 離液（購(gòu)自STEM CELL公司）12ml，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到s印mate離心管，600~800g 離心15~20min。
[0049] 4、離心后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗滌1次。
[0050] 5、用CD 14+分選試劑盒（購(gòu)自STEM CELL公司）將CD 14+細(xì)胞從上述單個(gè)核細(xì)胞 中分選出來(lái)。
[0051] 6、用X-VIV0 15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入500~1000U/ml的GM-CSF溶液、500~ 1000U/ml的IL-4溶液和一定量的自體血漿，將CD14+細(xì)胞培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中。
[0052] 實(shí)施例2⑶14+細(xì)胞的誘導(dǎo)
[0053] 用X-VIV0 15培養(yǎng)基重懸實(shí)施例1制得的⑶14+細(xì)胞至細(xì)胞密度為2-5 X 105/ml。 加入500~1000U/ml的GM-CSF溶液、500~1000U/ml的IL-4溶液和2-5%的自體血漿， 將CD14+細(xì)胞培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)CD14+細(xì)胞向DC細(xì)胞分化。定期進(jìn)行