觀察，每隔 2~3天全量補液。
[0054] 實施例3抗原的提取
[0055] 將實施例1收集的血漿取出，采用截留分子量為50kDa的超濾管（型號： Amicon-Ultra-15,購至Millipore公司）濃縮血衆(zhòng)中的蛋白，具體為：
[0056] 1、將超濾管用Milli-Q水欲清洗兩遍，除去超濾膜中微量的甘油；
[0057] 2、向Amieon⑧Ultra超過濾裝置中加入不超過15mL的血漿樣本；
[0058] 3、將蓋好蓋子的過濾裝置放入離心機中；
[0059] 4、5000g離心15~60分鐘，收集濃縮后的液體。
[0060] 5、將濃縮后的濾液再用截留分子量為10kDa的超濾管（型號：Amic〇n-Ultra-15， 購至Millipore公司）繼續(xù)濃縮（濃縮步驟如1~4)，最后將超濾膜上的蛋白沖洗下來，即 得到含有抗原的蛋白濃縮液。
[0061] 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（購至碧云天公司）檢測，結果表明，獲得蛋白的濃 度為 2. 115mg/mL。
[0062] 實施例4DC細胞的刺激和成熟
[0063] 以X-VIV0 15培養(yǎng)基培養(yǎng)DC至第5天，加入實施例3制得的含有抗原的蛋白濃縮 液，37°C，5% C02，飽和濕度培養(yǎng)48小時。獲得負載前列腺抗原的DC細胞。
[0064] 對比例1現有技術制備負載前列腺抗原的DC細胞
[0065] -、分離單個核細胞：
[0066] 1、取前列腺癌患者的外周血，將抗凝管中的外周血轉移到離心管中，400~500g 離心5~10min，離心結束后將上層血漿收集于另一支離心管中，用于實施例3。
[0067] 2、將下層血細胞轉移到50mL離心管中，以0. 01mol/L PBS液按1:1稀釋吹打均 勻，加入淋巴細胞分離液，離心機2000r/min,離心30min。
[0068] 3、吸取單核細胞，以PBS洗滌后細胞沉淀加入5ml的含有10%自體血清 RPMI-1640培養(yǎng)基，37°C，5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0069] 二、單個核細胞向DC細胞分化
[0070] 1、取出分離并培養(yǎng)2h的單個核細胞備用。顯微鏡下觀察可見瓶底有致密的細胞 層，說明單核細胞已貼壁。超凈工作臺內打開細胞培養(yǎng)瓶，以吸管吸棄培養(yǎng)基，并以預熱的 10%自體血清RPMI-1640培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中輕輕搖晃以去除未貼壁的細胞，重復3次。
[0071] 2、培養(yǎng)瓶內加入4ml培養(yǎng)基，同時加入終濃度為40ng/ml的IL-4,及40ng/ml的 GM-CSF，加入青霉素-鏈霉素以防止細菌污染。放入培養(yǎng)箱37°C相對濕度90 %，5 % 0)2條 件下繼續(xù)培養(yǎng)。
[0072] 3、細胞培養(yǎng)24h后再次換液。取懸浮的細胞繼續(xù)在GM-CSF和IL-4的刺激下培養(yǎng)， 此后細胞培養(yǎng)每三天換液一次，獲得DC細胞
[0073] 三、DC細胞的刺激和成熟
[0074] 1、培養(yǎng)第6天加入腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，促進DC細胞的成熟。
[0075] 實施例5負載前列腺抗原的DC細胞的增殖能力測定
[0076] 將實施例4和對比例1制得的負載前列腺癌抗原的DC細胞分別以X-VIV0 15培 養(yǎng)基重懸，并進行細胞計數；
[0077] 將DC細胞以2 X 103/ml的密度接種到96孔板中，實施例4和對比例1制備的細 胞各接種28個孔，每孔100 μ 1細胞懸液；
[0078] 37 °C，5 % C02，飽和濕度培養(yǎng)培養(yǎng)24h后，實施例3和對比例1分別取4個復孔消 化后進行細胞計數；
[0079] 以后每日取4個復孔消化后進行細胞計數，連續(xù)檢測7天。
[0080] 將所得的細胞數繪制成生長曲線（見圖1)。
[0081] 結果顯示，實施例4制備的細胞增殖能力顯著優(yōu)于（p〈0. 05)對比例1.
[0082] 實施例6負載前列腺抗原的DC細胞的表面標志物表達
[0083] 實施例5細胞培養(yǎng)7天后，流式細胞術檢測實施例4和對比例1制得的負載前列 腺抗原的DC細胞的表面標志物CD86 :具體方法為：
[0084] 取1X106個DC細胞；250g離心5min去上清；用含10%FBS的PBS溶液清洗2次； 避光加入CD86抗體2. 5 μ L室溫孵育30min ;用含10% FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞并過濾；
[0085] 上流式細胞儀進行檢測，檢測結果如圖2-a~圖2-b。
[0086] 由圖2可知，實施例4制得DC細胞的⑶86+的表達率為97. 1 % (圖2-a)，而對比 例1制得DC細胞的⑶86+的表達率為87% (圖2-b)，明顯低于本專利DC細胞的⑶86+的 表達率（p〈〇. 05)，且差異具有統計學意義。
[0087] 實施例7負載前列腺抗原的DC細胞腫瘤疫苗的制備
[0088] 將實施例4制得的負載前列腺抗原的DC細胞以生理鹽水重懸，至細胞密度為 2 X 105/ml，加入質量分數為2 %的BSA。制得DC細胞腫瘤疫苗。
[0089] 對比例2負載前列腺抗原的DC細胞腫瘤疫苗的制備
[0090] 將對比例1制得的負載前列腺抗原的DC細胞以生理鹽水重懸，至細胞密度為 5 X 105/ml，加入質量分數為5 %的BSA。制得DC細胞腫瘤疫苗。
[0091 ] 實施例8DC細胞疫苗治療PBMC殺傷前列腺癌細胞的效果觀察
[0092] 對實施例1和對比例4制得的DC疫苗和成熟的CIK細胞分別進行PC-3細胞（由 暨南大學生物醫(yī)藥研究基地惠贈）、DU145細胞（由暨南大學生物醫(yī)藥研究基地惠贈）和 LNCAP細胞（由暨南大學生物醫(yī)藥研究基地惠贈）這三種前列腺癌細胞株的殺傷活性檢測。 方法為：
[0093] 以CCK-8法測細胞殺傷率。PC-3細胞、DU145細胞和LNCAP細胞作為靶細胞，分別 將實施例7和對比例2制得的疫苗以1:10的比例與CIK細胞共培養(yǎng)48h，成為效應細胞。
[0094] 打開超凈工作臺，將培養(yǎng)瓶中的靶細胞取出，貼壁生長的細胞可使用0. 25%胰酶 消化，吸管吹打成為細胞懸液，將之移入離心管l〇〇〇r/min，離心10min。棄上清，細胞沉 淀重懸，臺盼藍活細胞計數后調整至1X10 6/ml。
[0095] 吸取100 μ L靶細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板，按效靶比1:10,1:20,1:40加入效應細 胞，總體積調整為200 μ L。同時每個細胞濃度設置單純靶細胞孔與單純效應細胞孔，每樣 設3個復孔.
[0096] 3)放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h后每孔加入CCK-8 10 μ 1，繼續(xù)孵育2h后上酶標儀， 450nm讀取0D值，計算殺傷率：
[0097] 殺傷率=[1-(共培養(yǎng)孔0D值-刺激細胞孔0D值）]/靶細胞孔0D值X 100 %。
[0098] 結果如表1 :
[0099] 表1對前列腺癌細胞的殺傷效果
[0101] *示具有顯著性差異，ρ〈0· 05, **示具有顯著性差異，ρ〈0· 01
[0102] 如表1，與對比例2相比，本發(fā)明實施例7提供的疫苗對前列腺癌細胞的殺傷效果 更好，效果具有統計學意義。
[0103] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種負載前列腺癌抗原的DC細胞制備方法，其特征在于，包括： 步驟1 :分離自外周血中CD14+細胞； 步驟2 :使所述CD14+細胞分化為DC細胞； 步驟3 :分離前列腺癌患者血漿中分子量為lOkDa~50kDa的蛋白； 步驟4 :以所述分子量為lOkDa~50kDa的蛋白刺激所述DC細胞，制得負載前列腺癌 抗原的DC細胞。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中所述分子量為lOkDa~ 50kDa的蛋白為PSA。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中所述刺激所用分子量為 lOkDa~50kDa的蛋白濃度為 50μg/mL~60μg/mL。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中所述刺激的時間為48h。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述分離采用磁珠法。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述分化的誘導劑為 GM-CSF和IL-4。7. 權利要求1~6任一項所述制備方法制備的負載前列腺癌抗原的DC細胞。8. -種DC細胞腫瘤疫苗，其特征在于，包括權利要求1~6任一項所述方法的負載前 列腺癌抗原的DC細胞。9. 根據權利要求8所述的DC細胞腫瘤疫苗，其特征在于，還包括生理鹽水和BSA。10. 權利要求8~9任一項所述的DC細胞腫瘤疫苗作為治療前列腺癌的藥物的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞免疫領域，尤其涉及一種負載前列腺癌抗原的DC細胞及一種DC細胞腫瘤疫苗。本發(fā)明通過超濾富集前列腺癌患者血漿中分子量為10kDa～50kDa的蛋白，該蛋白中主要包括PSA；將該蛋白用于刺激DC細胞成熟，使DC細胞負載前列腺癌抗原，負載前列腺抗原后的DC細胞增殖效果更好，且能夠刺激CIK細胞對前列腺癌細胞株產生殺傷作用，且該效果優(yōu)于現有技術制備的DC細胞腫瘤疫苗。因此，本發(fā)明提供方法制備的負載前列腺抗原的DC細胞能夠制備腫瘤疫苗用于治療前列腺癌。
【IPC分類】A61P35/00, A61K39/00, C12N5/0784
【公開號】CN105316291
【申請?zhí)枴緾N201510888991
【發(fā)明人】陳海佳, 葛嘯虎, 王一飛, 羅二梅, 張維敏
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年12月4日