本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一類來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化的潛能以及低免疫原性。在體外，間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為上皮、骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、心臟等多種組織細(xì)胞，具有促進(jìn)血管形成、保護(hù)神經(jīng)和細(xì)胞替代治療作用。在臨床造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入和免疫調(diào)控等方面，間充質(zhì)干細(xì)胞也具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

雖然間充質(zhì)干細(xì)胞來源比較豐富，如脂肪、臍血、臍帶、胎盤等組織均可作為其來源，但間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，在體內(nèi)原始濃度很少，為了滿足臨床治療的應(yīng)用，需要在體外進(jìn)行快速擴增培養(yǎng)，同時還需保持多向分化潛能和未分化狀態(tài)，即非分化性增殖成為間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入臨床階段亟待解決的問題。

目前，體外擴增間充質(zhì)干細(xì)胞最常使用的培養(yǎng)基大都含一定濃度的胎牛血清(FBS)。但是，F(xiàn)BS屬異種蛋白，成分比較復(fù)雜，在臨床應(yīng)用上存在潛在風(fēng)險。一些臨床研究使用人血清或血清衍生物來代替FBS培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，這些成份雖然來源于人不會引起異種蛋白的免疫，但這些人源成分化學(xué)成分不明確，不利用進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的深入研究，而且目前人血清、血小板資源來源少，對間充質(zhì)干細(xì)胞大規(guī)模擴增有一定局限性。因此，發(fā)展無血清培養(yǎng)基是干細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的必然趨勢。

目前市場上提出了些無血清培養(yǎng)基，其主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和取代血清的添加劑成分組成。但現(xiàn)有技術(shù)中的無血清培養(yǎng)基存在細(xì)胞貼壁性差，組分相對復(fù)雜，不支持原代細(xì)胞培養(yǎng)等問題。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基克服了現(xiàn)有技術(shù)中無血清培養(yǎng)基存在的不能有效維持間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能，組分相對復(fù)雜，不支持原代細(xì)胞培養(yǎng)等問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)基，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加成分，其中所述添加成分包括L-谷氨酰胺、非必須氨基酸、L-抗壞血酸、亞硒酸鈉、纖連蛋白、乙醇胺、氫化可的松、胰蛋白酶抑制劑、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人胰島素、bFGF、TGF-β1和PDGF-BB。

其中，L-谷氨酰胺：是一種必需氨基酸，也是培養(yǎng)基的主要成分，作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的主要能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。

非必須氨基酸：含7種細(xì)胞培養(yǎng)所需非必需氨基酸，能有效改善細(xì)胞培養(yǎng)基配比。降低間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞自身生產(chǎn)非必須氨基酸的副作用。

L-抗壞血酸：是體內(nèi)一種重要的輔酶和抗氧化劑,可參與細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈作用，從而有利于細(xì)胞的完整存活和生長發(fā)育。最新研究表明抗壞血酸與許多生長因子有協(xié)同作用，可顯著增加其它生長因子對間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

亞硒酸鈉：是無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，促進(jìn)過氧化物和超氧化化的水解，在代謝解毒中起重要作用。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中的過氧化物和超氧化物的累積。

纖連蛋白：是細(xì)胞外基質(zhì)的粘著糖蛋白，能使用細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)互相粘連，鉚釘細(xì)胞，同時又介到細(xì)胞運動遷移。

乙醇胺：可參與精胺合成，精胺與亞精胺都存在于大多數(shù)細(xì)胞中，促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要物質(zhì)，使DNA分子具有更大的穩(wěn)定性與柔韌性，是細(xì)胞培養(yǎng)基中重要組分之一。

氫化可的松：是由腎上腺外皮質(zhì)層分泌的一種原發(fā)性糖皮質(zhì)激素，主要功能在于通過糖異生作用增加血糖水平；以及促進(jìn)脂肪，蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝活動。

胰蛋白酶抑制劑：是抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以終止傳代過程中胰蛋白酶的消化作用。

人轉(zhuǎn)鐵蛋白：能結(jié)合鐵離子，減少基對細(xì)胞毒性，并及時被干細(xì)胞利用，促進(jìn)細(xì)胞生長。

人胰島素：促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，對間充質(zhì)干細(xì)胞中糖代謝、脂肪代謝和蛋白代謝起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,對間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和存活起到促進(jìn)作用。

bFGF：為一種多肽類生長因子,具有多種生物活性,能刺激大量中胚層和神經(jīng)外胚層來源細(xì)胞的生長,是一種有效的有絲分裂原和分化抑制因子，bFGF可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并增強間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能。

TGF-β1:可增強間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化能力。

PDGF-BB:是一種重要的促有絲分裂因子，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可調(diào)控細(xì)胞的生命活動，可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分裂、增殖等能力。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，所述L-谷氨酰胺的濃度為1-5mM，非必須氨基酸的濃度為1-5mM，L-抗壞血酸的濃度為32-80mg/L，亞硒酸鈉的濃度為7-20ug/L，纖連蛋白的濃度為5-50mg/L，乙醇胺的濃度為1-5mg/L，氫化可的松的濃度為5-20mg/L，胰蛋白酶抑制劑的濃度為1-2mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為5-20mg/L，人胰島素的濃度為10-30mg/L，bFGF的濃度為10-30ug/L，TGF-β1的濃度為1-10ug/L，PDGF-BB的濃度為1-20ug/L。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，所述L-谷氨酰胺的濃度為1-2mM，非必須氨基酸的濃度為1-2mM，L-抗壞血酸的濃度為40-60mg/L，亞硒酸鈉的濃度為10-18ug/L，纖連蛋白的濃度為15-30mg/L，乙醇胺的濃度為1-4mg/L，氫化可的松的濃度為7-15mg/L，胰蛋白酶抑制劑的濃度為1-1.5mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為7-15mg/L，人胰島素的濃度為10-15mg/L，bFGF的濃度為20-30ug/L，TGF-β1的濃度為3-7ug/L，PDGF-BB的濃度為7-15ug/L。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，所述L-谷氨酰胺的濃度為1mM，非必須氨基酸的濃度為1mM，L-抗壞血酸的濃度為58mg/L，亞硒酸鈉的濃度為14ug/L，纖連蛋白的濃度為25mg/L，乙醇胺的濃度為3mg/L，氫化可的松的濃度為10mg/L，胰蛋白酶抑制劑的濃度為1mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為10mg/L，人胰島素的濃度為10mg/L，bFGF的濃度為20ug/L，TGF-β1的濃度為5ug/L，PDGF-BB的濃度為10ug/L。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，添加成分還包含輔酶A、丙酮酸鈉和EGF中的至少一種。

其中，輔酶A：是乙酰化反應(yīng)的輔酶，對糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝起著重要作用。

EGF:是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個氨基組成的活細(xì)胞，其作用機制為EGF與EGF受體結(jié)合刺激細(xì)胞(包括多種組織來源的上皮細(xì)胞、各種間質(zhì)細(xì)胞)進(jìn)入細(xì)胞分裂周期,參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)一系列活動,作用于各種組織對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化起著重要作用胞。其最大特點是能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，輔酶A的濃度為80-120mg/L，丙酮酸鈉的濃度為1-5mM，EGF的濃度為5-20ug/L。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，輔酶A的濃度為100mg/L，丙酮酸鈉的濃度為1mM，EGF的濃度為10ug/L。

上述無血清培養(yǎng)基在另一種實施方式中，所述無血清培養(yǎng)基的pH值為7.2-7.4，滲透壓為260-320mosm，內(nèi)毒素為0-0.5EU/mL。

本發(fā)明還提供了一種上述無血清培養(yǎng)基在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1.本培養(yǎng)基加入了L-抗壞血酸、亞硒酸鈉、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人胰島素、bFGF、TGF-β1、PDGF-BB、EGF，可以替代胎牛血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞；

2.本培養(yǎng)基含纖連蛋白可以很好促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長；

3.本培養(yǎng)基加入組分簡單，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加成分可以體外擴增質(zhì)充質(zhì)干細(xì)胞具有較長時間增殖能力，且可以長時期維持間充質(zhì)干細(xì)胞主要生物特性、分化能力及免疫調(diào)節(jié)功能；

4.本發(fā)明的添加成分明確，有利于研究細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)機制；

5.在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞過程中無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被處理；

6.本發(fā)明培養(yǎng)基各組分濃度均通過實驗優(yōu)化最佳濃度，適合原代細(xì)胞培養(yǎng)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第12天時細(xì)胞從組織爬出形態(tài)。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)的P2和P7代人間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，其中圖2-a為P2代人臍帶間充質(zhì)干的細(xì)胞形態(tài)，圖2-b為P7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)。

圖3是根據(jù)本發(fā)明的三種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)P4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖曲線圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的P3和P7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平，其中圖4-a為P3代表面抗原表達(dá)水平，其中圖4-b為P7代表面抗原表達(dá)水平。

圖5是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)的P4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化染色結(jié)果。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)的P4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化染色結(jié)圖；

圖7是根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)的P4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化染色結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實施方式的限制。

實施例1:間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的配制

本實施例提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加以下成分：

本實施例中使用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑和細(xì)胞因子生產(chǎn)廠家及貨號見下表：

調(diào)整培養(yǎng)基各參數(shù)如下：

PH：7.2-7.4

滲透壓：260-320mosm

細(xì)菌、真菌檢測：陰性

衣原體、支原體檢測：陰性

內(nèi)毒素：0-0.5EU/mL

上述配好的完全培養(yǎng)基用0.22um的濾器過濾除菌，-20℃避光保存。

實施例2:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備

分別用下述三組培養(yǎng)基分離原代培養(yǎng)：

(1)組一：本發(fā)明實施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基；

(2)組二：傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+10％FBS)；

(3)組三：人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)家LONZA，貨號00190632)。

實驗步驟：

(1)在無菌條件下收集健康新生兒臍帶(含產(chǎn)婦體檢抽血檢測結(jié)果)，兩端絲線結(jié)扎，浸泡于含2％雙抗(青鏈霉素混合液)的保存瓶中。

(2)從生物安全柜內(nèi)取出臍帶，用75％醫(yī)用酒精消毒臍帶表面30-40s，剪開兩端結(jié)扎絲線，用含1％雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗以除去其表面附著的血液。

(3)剔除臍帶內(nèi)部包裹的血管后，使用組織鑷撕取臍帶基質(zhì)組織(華通膠)浸泡于含1％雙抗的生理鹽水中。

(4)將臍帶組織剪碎為約3mm³大小的組織塊，裝入50mL離心管。離心去除上層液體，掰斷10mL移液管頭，吸取組織塊至6個T75瓶底(分為三組，每組2瓶)，分別加入上述三組培養(yǎng)基置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)。

(5)第二天將三組分別補充培養(yǎng)基到10mL，以后每3-4天換液1次。通過組織塊貼壁法12-14天后于組織塊間隙可見散在分布的紡錘型細(xì)胞，16-18天左右可達(dá)80％融合，圖1即為采用本發(fā)明實施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第12天時細(xì)胞從組織爬出形態(tài)。

(6)當(dāng)細(xì)胞融合到80％時，用0.25％胰酶消化傳代。在顯微鏡下觀察，一旦胞質(zhì)回縮則加培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞懸液以1200r/min離心5min，用生理鹽水洗滌1次，原代以1：2的比例進(jìn)行再次接種培養(yǎng)，記為P1代。P2代以后按1：5或1：6的比例傳代直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底為止再重復(fù)上述操作，其中圖2-a為采用本發(fā)明實施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)P2代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，圖2-b為采用本發(fā)明實施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)P7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。

實施例3:三組培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力對比

實驗步驟：分別取實施例2中三組培養(yǎng)基培養(yǎng)生長良好的P3人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，酶解制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至2.4x 10⁴個/mL，加入12孔板，分別加入對應(yīng)三組培養(yǎng)基，每孔1mL，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2天開始每隔一天分別取各組三孔計算細(xì)胞量，求其平均值，連續(xù)測8天，以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞增殖總數(shù)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。如圖3所示。

從圖3可以看出，采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時，細(xì)胞增值速度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基和人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

實施例4:本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分析鑒定

實驗步驟：分別取用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P3和P7，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，用0.05％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成濃度為2x 10⁵個/100uL的單細(xì)胞懸液，其中，圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的P3和P7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平，圖4-a為P3代表面抗原表達(dá)水平，其中圖4-b為P7代表面抗原表達(dá)水平。分別加入10uL CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR抗體，混勻，避光孵育30min，用PBS洗滌1次，1200r/min離心5min，用500uL的PBS重懸浮細(xì)胞，然后上流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果如下表：

從表中可以看出，用本發(fā)明實施例1的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不論是經(jīng)過3次還是7次傳代培養(yǎng)，都能夠很好的保證臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物特性不變，且陽性率高于95％，陰性率低于0.1％，說明本發(fā)明的培養(yǎng)基獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高，質(zhì)量好。

實施例5:誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化鑒定

誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化培養(yǎng)基如下：

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM(高糖)+10％FBS+1umol/L地塞米松+0.5mmol/L IBMX+0.2mmol/L吲哚美辛+10μg/mL胰島素

實驗步驟：用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)P4代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×10⁵個/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到70％匯合時更換培養(yǎng)基為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換液，誘導(dǎo)14天后用油紅染色定性觀察體外誘導(dǎo)分化結(jié)果。

其中，紅油O儲存液制備方法如下：稱取0.25g油紅干粉，溶于50mL異丙醇中，配成0.5％油紅O儲存液，閉光保存。油紅O儲存液的工作濃度為，油紅O：去離子水＝3：2，用0.22um針頭濾器過濾。將細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗1遍后使用4％多聚甲醛固定30min，棄去多聚甲醛，用PBS漂洗2次后加入工作濃度油紅O覆蓋住板底，染色20min，用75％乙醇漂洗一次再用PBS多次洗滌，顯微鏡觀察。成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果如圖5所示。

圖5結(jié)果顯示脂肪誘導(dǎo)分化14天后出現(xiàn)了大量的脂滴，油紅O染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒。實驗表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向脂肪誘導(dǎo)分化的能力。

實施例6:誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化鑒定

誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基如下：

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM(高糖)+10％FBS+10nmol/Lβ-甘油磷酸鈉+1×10^-8mol/L地塞米松+50mg/L維生素C

實驗步驟：用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)P4代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以5x 10⁴個/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到50％匯合時更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換液，誘導(dǎo)21天后，用4％多聚甲醛固定30min，茜素紅-Tris-HCl(PH 8.3)染色20min，蒸餾水沖洗后顯微鏡觀察外鈣基質(zhì)沉積。結(jié)果如圖6所示。

觀察結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)第10天后，在相差顯微鏡下可觀察到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體積開始增大，形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)，具有鈣化的趨勢。圖6顯示誘導(dǎo)第21天，經(jīng)茜素紅染色鑒定可發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞內(nèi)布滿被紅染顆粒。實驗表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。

實施例7:誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定

誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化培養(yǎng)基如下：

成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM(高糖)+5mg/L胰島素+0.1umol/L地塞米松+50mg/L維生素C+10ng/mL TGF-B1

實驗步驟：用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)P4代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以1x 10⁶個/mL接種15mL到離心管中，150g/min離心5min，棄上清，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換液，誘導(dǎo)21天后，石蠟切片后進(jìn)行阿爾辛藍(lán)染色，用顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果如圖7所示。

如圖7結(jié)果顯示成軟骨誘導(dǎo)21天后，石蠟切片后進(jìn)行阿爾辛藍(lán)染色結(jié)果呈陽性反應(yīng)。實驗本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向軟骨誘導(dǎo)分化的能力。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。