本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及在水稻(Oryza sativa L.)中異源表達(dá)真菌Trichurus的谷氨酸脫氫酶基因TrGDH，可以提高水稻的氮素高效利用和改善水稻的生長(zhǎng)。

背景技術(shù)：

水稻(Oryza sativa L.)是氮肥用量最多的糧食作物之一，也是對(duì)干旱極度敏感的作物。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO 2001)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)1995-1997年水稻種植面積年均31.7×10⁶hm²，占世界水稻種植面積的20%，而水稻氮肥用量占全球水稻氮肥總用量的37%，成為世界上施用無機(jī)氮肥最多的國(guó)家。中國(guó)單季稻田氮肥用量平均為180kg/hm²，比世界稻田氮肥平均用量約高75% (彭少兵等 2002)。水稻的氮肥低效利用與超量施用的現(xiàn)實(shí)，加劇了諸如富營(yíng)養(yǎng)化、空氣污染等嚴(yán)重環(huán)境問題；同時(shí)，我國(guó)水稻生產(chǎn)受干旱的威脅日益嚴(yán)重。因此，培育氮高效利用和抗旱性強(qiáng)的水稻新品種對(duì)提高我國(guó)糧食產(chǎn)量和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展非常重要（Bates et al. 2008; Xu et al. 2012）。

植物的氮源主要來自于無機(jī)氮化物，如銨鹽（NH₄⁺)和硝酸鹽（NO₃^-)。但是水稻在大田中能利用的無機(jī)氮源主要形式為銨鹽（NH₄⁺)。水稻體內(nèi)NH₄⁺同化包括兩個(gè)途徑：谷氨酰胺合成酶(GS)-谷氨酸合酶（GOGAT）途徑^[8]和谷氨酸脫氫酶（GDH）途徑（江立庚等 2002; Qiu et al. 2009）。高等植物體內(nèi)NH₄⁺同化的主要途徑為GS/GOGAT，而GDH可能是輔助NH₄⁺同化，并參與調(diào)控體內(nèi)的碳氮代謝的平衡（Lea 和Miflin 1974；Abiko et al. 2005；Qiu et al. 2009）。谷氨酸脫氫酶（GDH；E.C.1.1.4.1）催化反應(yīng)為：α-酮戊二酸 + NH₄⁺ + NAD(P)H + H⁺→谷氨酸 + H₂O + NAD(P)⁺。在生物體中，GDH分為2類：一類為以NADPH為輔酶的NADPH-GDH，主要作用于谷氨酸的合成; 另一類為以NADH為輔酶的NADH-GDH，主要作用于谷氨酸的分解（Loulakakis et al. 1991; Bernard et al. 2009）。本發(fā)明中以下所指的GDH就是NADPH-GDH。在高等植物中雖存在GDH基因，但由于其GDH對(duì)NH₄⁺的親和力低（K_m 為10 mM-80 mM)，而來源于真菌的GDH對(duì)NH₄⁺的親和力非常高（K_m 為0.2 mM-4.5 mM)，預(yù)示真菌GDH在低NH₄⁺濃度時(shí)的氨同化能力比高等植物強(qiáng)（Abiko et al. 2010; Zhou et al. 2014）。因此，利用外源谷氨酸脫氫酶（主要是細(xì)菌和真菌）提高植物氮肥利用率是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外生物工程研究的熱點(diǎn)之一。Lightfoot et al. （2001）將大腸桿菌（E. coli）的gdhA基因在煙草中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能夠增強(qiáng)對(duì)PPT (phosphinothricin herbicides)的耐受力，而且氮素利用效率明顯提高。Lightfoot et al.（2007）將大腸桿菌E.coligdhA 基因轉(zhuǎn)入玉米中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在明顯缺水的季節(jié)里的萌發(fā)率和生物產(chǎn)量均比對(duì)照高，其氮素利用效率也明顯提高，說明該基因在植株中高效表達(dá)即可以提高氮素利用效率，又可以使植物耐旱性增強(qiáng)。特別是在半干旱地區(qū)，作物谷氨酸脫氫酶改造具有很好的應(yīng)用前景。朱冰等（2000）克隆了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）谷氨酸脫氫酶基因并研究了其表達(dá)和功能。王芳和田波（2001）通過RT-PCR方法克隆了真菌中間脈孢霉（Neurospora intermedia）、好食脈孢霉（Neurospora sitophila）、粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）的谷氨酸脫氫酶基因。重組谷氨酸脫氫酶活性分析表明：Ni-GDH具有更高的酶活性，其Km值在0.3-0.45 mmol/L左右。將其轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)煙草在低氮水平下的生長(zhǎng)。黃國(guó)存等利用RT-PCR方法從小球藻(Chlorella sorokiniana)中克隆了NADPH-GDH基因，并轉(zhuǎn)入煙草(Nicotiana tabacumL.)。研究表明, 在低氮培養(yǎng)基或在低氮蛭石中其生長(zhǎng)速度和葉片數(shù)明顯高于對(duì)照。同時(shí)，銨毒性實(shí)驗(yàn)表明,無論在低銨或高銨條件下，接種在MS固化培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因綠葉圓片存活時(shí)間長(zhǎng),葉綠素含量高（黃國(guó)存等，2002）。以上這些研究結(jié)果表明，外源NADPH-GDH在提高植物氮素的吸收和利用能力上具有巨大潛力和應(yīng)用價(jià)值。

外源GDH在水稻中的應(yīng)用方面，已有多個(gè)真菌GDH基因已轉(zhuǎn)入水稻并展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。Abiko等（2010）將黑曲霉（Aspergillus niger）的GDH基因表達(dá)于水稻中，顯著提高了水稻的氮同化效率和產(chǎn)量。同時(shí)，Zhou等（2015）將埃倫柱孢（Cylindrocarpon ehrenbergii）的CeGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得了氮素同化效率和谷物產(chǎn)量均顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系，尤其在低氮大田中其增產(chǎn)效果非常顯著。然而，Zhou等（2014）將鮑魚菇（Pleurotus cystidiosus）的PcGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得了氮同化效率和谷蛋白含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系，而其產(chǎn)量提高不明顯。另外，Du等（2014）粗糙脈孢桿菌（Neurospora crassa）的NcGDH基因?qū)胨?，卻發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的生長(zhǎng)受到抑制，但是其耐除草劑Basta的能力顯著提高。以上研究發(fā)現(xiàn)，真菌GDH基因雖能增強(qiáng)水稻的氮同化效率，但是并不一定能增加產(chǎn)量，甚至有時(shí)還降低產(chǎn)量。因此，篩選和鑒定既能增強(qiáng)氮同化效率又能增加產(chǎn)量的新的真菌GDH基因仍顯得十分緊迫，而且也具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種真菌Trichurus的谷氨酸脫氫酶基因及其編碼蛋白，該基因命名為TrGDH，所編碼的相應(yīng)蛋白命名為TrGDH蛋白。TrGDH序列全長(zhǎng)為1359 bp，編碼452個(gè)氨基酸。

本發(fā)明所提供的谷氨酸脫氫酶蛋白，名稱為TrGDH，來源于真菌Trichurus，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：

1）序列表中的SEQ ID No:2；

序列表SEQ ID No:2中的序列由452個(gè)氨基酸殘基組成。

TrGDH的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

TrGDH的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；

2）編碼序列表中SEQ ID No:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；

3）在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；

4）與序列表中 SEQ ID No:1限定的 DNA序列具有 70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。

序列表中的序列1由1359個(gè)堿基組成。

所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在 0.1×SSPE (或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜含有TrGDH基因的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

真菌Trichurus的谷氨酸脫氫酶基因(TrGDH)及其編碼蛋白屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，且擴(kuò)增TrGDH基因中任意片段的引物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的提高水稻氮素高效利用的基因TrGDH導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得改善水稻氮素高效利用及生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記（GUS基因、GFP、YFP、As-Red和熒光素酶基因等）或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因（潮霉素、慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、博萊霉素等）。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)也可不攜帶任何標(biāo)記基因，在苗期進(jìn)行特定PCR分子標(biāo)記篩選。含有本發(fā)明的TrGDH的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等。

本發(fā)明的TrGDH蛋白異源表達(dá)在水稻中通過提高水稻的總NADP(H)-GDH酶活從而促進(jìn)水稻對(duì)氮素的吸收進(jìn)而改善水稻幼苗的生長(zhǎng)及成熟期水稻的有效穗和千粒重。因此，通過基因工程的方法異源表達(dá)真菌Trichurus的谷氨酸脫氫酶在水稻中，可提高水稻在低氮條件下氮素的高效利用，從而使水稻在低氮的條件下能正常生長(zhǎng)，提高氮肥的利用率，減少環(huán)境污染。本發(fā)明中的TrGDH蛋白對(duì)于提高水稻的氮素高效利用，進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量具有重要的作用。

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

附圖說明

圖1為TrGDH蛋白的進(jìn)化樹分析。

圖2a 為His₆-TF-TrGDH蛋白的純化與鑒定。

圖2b 為His₆-TF-TrGDH蛋白的western blot鑒定。

圖3a為His₆-TF-TrGDH在不同NH₄Cl濃度梯度下的動(dòng)力學(xué)分析。

圖3b為His₆-TF-TrGDH在不同α-酮戊二酸（2-OG）濃度梯度下的動(dòng)力學(xué)分析。

圖3c為His₆-TF-TrGDH在不同L-谷氨酸濃度梯度下的動(dòng)力學(xué)分析。

圖3d為His₆-TF-TrGDH與水稻內(nèi)源OsGDH在不同NH₄Cl濃度梯度下的動(dòng)力學(xué)比較分析。

圖4a為異源表達(dá)TrGDH的雙元載體pCAMBIAL1300-TrGDH圖譜。

圖4b為異源表達(dá)TrGDH的半定量RT-PCR分析。

圖4c為異源表達(dá)TrGDH的western blot分析。

圖4d為異源表達(dá)TrGDH對(duì)水稻內(nèi)源GDHs（GDH1，GDH2，GDH3）表達(dá)影響的定量RT-PCR分析。

圖5a 為不同NH₄Cl濃度梯度下過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13的表型分析。

圖5b 為過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13根與地上部分GDH酶活性分析。

圖5c為不同NH₄Cl濃度梯度下過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13的氮含量檢測(cè)。

圖5d為不同NH₄Cl濃度梯度下過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13的濕重分析。

圖5e為不同NH₄Cl濃度梯度下過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13的干重分析。

圖6為不同NH₄Cl濃度梯度下過表達(dá)植株Ubi::TrGDH-4與Ubi::TrGDH-13種子谷清蛋白的含量分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

TrGDH基因的克隆

通過對(duì)已經(jīng)測(cè)序的真菌菌株的GDH基因的序列找到GDH 基因的保守區(qū)，并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。簡(jiǎn)并引物的正向引物從開放閱讀框的起始密碼子開始，序列為5'- ATGTCCCACCTGCCTTTCGARCCNGARTT -3'；簡(jiǎn)并引物的反向引物位于開放閱讀框3’端的后面，序列為5'- CCACCAGTCACCCTGGTCRTGCATNGC -3'。以真菌Trichurus的cDNA為模板，利用RT-PCR的方法克隆出TrGDH基因。根據(jù)Chen et al (2006)的方法將TrGDH基因克隆到Gateway入門載體pGWC中然后測(cè)序。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里沒有收錄，它有完整的開放閱讀框（ORF）并能夠通讀，是一個(gè)本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的新基因，我們將其命名為TrGDH。由于真菌和水稻它們對(duì)密碼子的偏愛性不一樣，所以為了使TrGDH基因更好的在水稻植株內(nèi)表達(dá)，根據(jù)網(wǎng)站http://www.kazusa.or.jp/codon/中的方法找出需要改變的密碼子，然后分析序列的結(jié)構(gòu)域，將在功能域中的原真菌密碼子變成水稻偏愛的密碼子。采用設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物并運(yùn)用重疊PCR技術(shù)將TrGDH序列中的原真菌密碼子變成水稻偏愛的密碼子，同時(shí)為了增強(qiáng)真菌PcGDH基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株內(nèi)的翻譯水平，我們?cè)谄鹗济艽a子ATG前面添加了kozark序列（GCCACC）。其克隆全長(zhǎng)引物如下：TrGDH-F：GCCACCATGTCCCACCTGCCTTTCGA，TrGDH-R：CCACCAGTCACCCTGGTCGT。將添加了kozark序列并進(jìn)行了水稻偏愛密碼子修飾后的TrGDH序列再克隆到pGWC載體中，并將其通過Gateway的LR反應(yīng)重組到改造后的pCAMBIA1301載體中。改造后的pCAMBIA1301載體含有潮霉素抗性篩選基因HPT和紅色熒光蛋白篩選標(biāo)記基因AsRed，并且將gateway cassette sequence克隆到pCAMBIA1301載體多克隆位點(diǎn)SacI和SacII之間，然后在gateway cassette sequence的3’末端加上2個(gè)FLAG標(biāo)簽序列（圖2）。將構(gòu)建好的pCAMBIA1301-TrGDH電擊轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌并轉(zhuǎn)化水稻（Oryza sativa cv. Kitaake）。

TrGDH基因的功能驗(yàn)證

(1) TrGDH基因的進(jìn)化樹分析

為了分析TrGDH基因與其他真菌及物種GDH基因的同源性關(guān)系，我們收集了真菌、E.coli、藻類、水稻和擬南芥GDH蛋白的氨基酸序列（表1：為進(jìn)化樹分析所用蛋白序列的具體信息），然后運(yùn)用CLUSTAL X 和 MEGA 5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，TrGDH與已有文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)NH₄⁺有很高親和力的gdhA(Aspergillus niger), gdhA(Aspergillus nidulans)和NiGDH(Neurospora intermedia)的同源性很高，而與植物內(nèi)源的GDH同源性不高（圖1）。

表1.進(jìn)化樹分析所用蛋白序列的具體信息

（2）TrGDH的原核表達(dá)及酶促動(dòng)力學(xué)分析

為了分析TrGDH的NADP(H)酶活，我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體pCold-TF-TrGDH并轉(zhuǎn)化E. coli (BL21)。體外誘導(dǎo)表達(dá)TrGDH并通過SDA-PAGE檢測(cè)純化的蛋白并經(jīng)western blot鑒定，由圖2a-b可知純化的TrGDH蛋白很單一，可用于測(cè)定NADP(H)-GDH酶活性和K_m值 (圖3a-d，表2)。GDH酶活性分析結(jié)果表明，TrGDH在體外正反應(yīng)的酶活性大于逆反應(yīng)的酶活性，說明TrGDH傾向于利用NH₄⁺ 將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸，并且由K_m值可知TrGDH對(duì)NH₄⁺ 的親和力大于對(duì)谷氨酸的親和力。

表2. His₆-TF-TrGDH蛋白對(duì)不同底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

(3) TrGDH基因的水稻轉(zhuǎn)化

為了研究TrGDH基因?qū)λ镜乩玫挠绊?，將?gòu)建好的pCAMBIA1301-TrGDH（圖4a）電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（Agrobacterium）菌株EHA105。然后用含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-TrGDH的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，在黑暗處28 ℃培養(yǎng)3天后，在含有 50 mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗1周，然后移栽至大田中。

(4) 轉(zhuǎn)基因植株的篩選和分子鑒定

收獲T₀代轉(zhuǎn)基因水稻的種子（T₁代），將種子在水中浸種2天后，移入37 ℃培養(yǎng)箱催芽3天，然后將幼苗進(jìn)行半定量RT-PCR和western blot分析（圖4b-c）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TrGDH在轉(zhuǎn)基因株系Ubi::TrGDH-4和Ubi::TrGDH-13中表達(dá)量較高，因此選這2個(gè)株系做下一步的實(shí)驗(yàn)研究。為了研究外源的TrGDH對(duì)水稻內(nèi)源GDHs（GDH1,GDH2,GDH3）表達(dá)的影響，我們利用定量RT-PCR分析了水稻內(nèi)源GDHs（GDH1,GDH2,GDH3）的表達(dá)變化（圖4d），結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入TrGDH降低了水稻內(nèi)源GDHs（GDH1,GDH2,GDH3）的轉(zhuǎn)錄水平。為了確定TrGDH在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)是否具有GDH酶活性，我們提取了轉(zhuǎn)基因植株的總蛋白檢測(cè)NADP(H)-GDH酶活性（圖5b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的NADP(H)-GDH酶活力大于野生型，并且在轉(zhuǎn)基因株系和野生型中都是正反應(yīng)的酶活大于逆反應(yīng)的酶活，說明TrGDH蛋白在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)發(fā)揮了功能。

（5）轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

將上一步得到的轉(zhuǎn)基因水稻植株Ubi::TrGDH-4和Ubi::TrGDH-13以及野生型分別在不同氮素條件下進(jìn)行水培和大田實(shí)驗(yàn)觀察表型（圖5a）。在水培實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株的干重、濕重、氮素含量以及谷清蛋白等都比野生型要好（圖5c-e; 圖6）。田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，轉(zhuǎn)基因植株的有效穗和千粒重比野生型的要高，但結(jié)實(shí)率比野生型略低，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)量和野生型相比沒有明顯的提高（表3）。

表3.野生型和TrGDH轉(zhuǎn)基因水稻的田間農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析

3. TrGDH基因的應(yīng)用

基于經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境保護(hù)的考慮，近年來水稻的氮素利用效率引起了大家的重視。目前水稻氮素利用研究主要集中在肥料施用方法和時(shí)期的探索、緩釋復(fù)合肥的研發(fā)和施用、以及水稻聯(lián)合工程固氮菌的培育和使用等方面，而且也取得了一定進(jìn)展。上世紀(jì)80年代產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于直接在基因水平上改造植物的遺傳物質(zhì)、可定向改造植物的遺傳性狀，外源基因的轉(zhuǎn)入打破了物種之間的生殖隔離障礙、豐富了基因資源等優(yōu)點(diǎn)而彌補(bǔ)了常規(guī)育種方法的不足，得到了前所未有的發(fā)展。由于水稻本身的谷氨酸脫氫酶(GDH)對(duì)NH₄⁺的親和力低的特性，決定了水稻氮素利用效率不高。目前，國(guó)內(nèi)外的研究工作證實(shí)通過外源GDH基因在轉(zhuǎn)化植物中高效表達(dá)能夠提高氮素利用率。到目前為止，雖然已有多個(gè)真菌GDH基因已轉(zhuǎn)入水稻并展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景，但是真菌GDH基因并不一定能增加產(chǎn)量。因此，發(fā)掘既能增強(qiáng)氮同化效率又能增加產(chǎn)量的新的真菌GDH基因仍顯得十分緊迫。我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將真菌Trichurus的GDH基因（TrGDH）轉(zhuǎn)入水稻，在提高水稻氮素利用和改善水稻生長(zhǎng)及農(nóng)藝性狀方面取得了良好的效果。

<110>湖南大學(xué)

<120>提高氮素高效利用的真菌TrGDH蛋白及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 1359

<212> cDNA

<213>毛束霉菌(Trichurus)

<400> 1

ATGTCCCACCTGCCTTTCGAGCCTGAGTTCGAGCAGGCTTACAACGAGCTTGCCACCACGCTCGAGAACTCGACCCTCTTCCAGAAGCACCCCGAGTATCGCACCGCGCTCAAGGTTTCCGCCATCCCCGAGCGTGTCATCCAGTTCCGCGTTGTCTGGGAGGACGATGCGGGCAACCTGCAGGTCAACCGCGGTTACCGCGTTCAGTTCAACTCCGCGCTAGGCCCTTACAAGGGTGGCCTGCGCCTCCACCCCTCGGTCAACCTGTCTATTCTTAAGTTCCTTGGCTTCGAGCAGATCTTCAAGAATGCGCTCACTGGTCTTTCCATGGGCGGCGGCAAGGGAGGCGCCGATTTCGACCCCAAGGGCAAGAGCGACGGCGAGATCCGCCGTTTCTGCACCTCTTTCATGCGTGAGCTTGGAAAGCACATCGGTGCCGACACTGACGTGCCCGCTGGTGACATCGGTGTGGGCGGTCGCGAGATCGGCTACCTGTTCGGTGCCTACCGCAAGGACCGCAACAAGTTCGAGGGTGTCCTGACCGGCAAGGGCCTCAGCTGGGGCGGCAGCCTGATCAGGCCCGAGGCCACCGGCTACGGTCTCGTCTACTACGTTGACCTCATGCTCCAGCACATGGGCAAGGGCGGCTTCGCTGGCAAGCGCGTCGCCATCTCCGGCTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCGGCGCTCAAGTGCATTGAGCTCGGTGCCACCGTCGTCTCTCTCTCCGACTCCACCGGTGCCCTCGTCCTCGACGGTGCGGAGGACTCCTTCACTCCCGAGGATATCAGCGCCATCATGAGCCTCAAGGAGAAGCGCAAGGCCATCACTGAGTTCAGCGGCAACGGCAAGCACAGGTACATCGCCGGCGCCAGGCCGTGGGTGTACGTCGGCAAGGTCGACATCGCGCTCCCCTGCGCGACCGAGAACGAGGTCAGCAAGGAGGAGGCCGAGGTGCTCGTCCGCAACGGCTGCTACGTCGTCGCTGAGGGCTCCAACATGGGCTGCACCCAGGAGGCCATCGACCTCTTCGAGGCCGAGAGGCAGACCAAGGGCAGCTCCGCCATCTGGTACGCCCCCGGCAAGGCCGCCAACTGCGGTGGTGTCGCCGTCTCGGGTCTCGAGATGGCCCAGAACAGCCAGCGCCTCCGGTGGACCCGTGAGGTCGTCGACGAGAGGCTCAAGGACATCATGAAGGACGCCTTCGAGGCCGGTCTCAAGAGCGCCGCCGAGTACGTCGAGACCAAGGAGGGCGAGCTTCCTTCGCTCGTTGCCGGTAGCAACATCGCCGGCTTCATCAAGGTCGCGGAGGCTATGCACGACCAGGGTGACTGGTGGTGA

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213>毛束霉菌(Trichurus)

<400> 2

MSHLPFEPEFEQAYNELATTLENSTLFQKHPEYRTALKVSAIPERVIQFRVVWEDDAGNLQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNALTGLSMGGGKGGADFDPKGKSDGEIRRFCTSFMRELGKHIGADTDVPAGDIGVGGREIGYLFGAYRKDRNKFEGVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVDLMLQHMGKGGFAGKRVAISGSGNVAQYAALKCIELGATVVSLSDSTGALVLDGAEDSFTPEDISAIMSLKEKRKAITEFSGNGKHRYIAGARPWVYVGKVDIALPCATENEVSKEEAEVLVRNGCYVVAEGSNMGCTQEAIDLFEAERQTKGSSAIWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLRWTREVVDERLKDIMKDAFEAGLKSAAEYVETKEGELPSLVAGSNIAGFIKVAEAMHDQGDWW