本發(fā)明一株抗托曲珠利單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株K-5及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及雜交瘤細(xì)胞株K-5及其產(chǎn)生的抗托曲珠利單克隆抗體。
背景技術(shù)：
：托曲珠利（Toltrazuril，TOL）屬于三嗪酮類新型廣譜抗球蟲藥,俗稱托曲珠利可溶性粉。為類白色至淡黃色粉末，無臭，在醋酸乙酯及二氯甲烷中溶解，在甲醇中略溶，在水中不溶。其在預(yù)防和治療家禽球蟲病方面效果顯著，對(duì)雞堆型布氏巨裂和緩毒害柔嫩艾美耳球蟲及火雞腺狀艾美耳球蟲、大艾美耳球蟲、小艾美耳球蟲均有殺毒作用。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)被廣泛應(yīng)用。其殺球蟲機(jī)理為：通過干擾球蟲細(xì)胞核分裂和線粒體，影響球蟲的呼吸和代謝功能，并能夠使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)龐大，發(fā)生嚴(yán)重的空泡化，從而使球蟲死亡。但其對(duì)動(dòng)物機(jī)體存在著一定的危害。目前檢測(cè)托曲珠利的方法主要有氣相色譜法（GC），液相色譜法（HPLC），液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）、串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等儀器方法，其準(zhǔn)確度和靈敏度均能很好的滿足需求，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較貴等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，因此建立一種快速簡(jiǎn)便的托曲珠利檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、靈敏、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高靈敏度和強(qiáng)特異性的單克隆抗體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，其中半抗原的設(shè)計(jì)是最重要的一環(huán)節(jié)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)托曲珠利具有高靈敏度和強(qiáng)特異性的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法。提供一株抗托曲珠利單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)托曲珠利具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來建立托曲珠利的免疫學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案：一株抗托曲珠利單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株K-5，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13095。托曲珠利單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為CGMCCNo.13095的托曲珠利單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株K-5分泌產(chǎn)生。所述的托曲珠利單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全中托曲珠利的殘留檢測(cè)。本發(fā)明提供的細(xì)胞株K-5的制備基本步驟為：（1）免疫原（TOL-KLH）的制備：稱取托曲珠利半抗原（TOLCOOH），其結(jié)構(gòu)式如下：TOLCOOH4.6mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC4.4mg和N-羥基丁二酰亞胺NHS2.6mg，溶于0.6mL無水N,N-二甲基甲酰胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，稱為A液；量取血藍(lán)蛋白KLH6.0mg，用0.05M、pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋至3.0mg/mL，稱為B液；在磁力攪拌作用下，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得完全抗原TOL-KLH，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；包被原TOL-OVA的制備方法同免疫原的制備，將KLH換為雞卵清蛋白OVA即可；（2）小鼠的免疫：托曲珠利完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑，首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。最后一次用托曲珠利完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；（3）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行3次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株K-5；（4）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定靈敏度和特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）設(shè)計(jì)出一種托曲珠利新型半抗原，并成功合成人工抗原；（2）本發(fā)明獲得的抗托曲珠利單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)托曲珠利有很好的檢測(cè)靈敏度和特異性（IC50值為5.0ng/mL）。生物材料樣品保藏：一株單克隆細(xì)胞株K-5，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13095，保藏日期為2016年10月31日。附圖說明圖1.K-5分泌的托曲珠利單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明通過將托曲珠利完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)托曲珠利有很好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)施例1：雜交瘤細(xì)胞株K-5的制備1、完全抗原的合成稱取托曲珠利半抗原（TOLCOOH）4.6mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）4.4mg和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）2.6mg，溶于0.6mL無水N,N-二甲基甲酰胺（混合液稱為A液），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h。量取血藍(lán)蛋白（KLH）6.0mg，用0.05M、pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋至3.0mg/mL（稱為B液），在磁力攪拌作用下，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得完全抗原（TOL-KLH），通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；包被原（TOL-OVA）的制備方法同免疫原的制備，將KLH換為雞卵清蛋白（OVA）即可。2、動(dòng)物免疫選擇健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取托曲珠利完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。3、細(xì)胞融合在沖擊免疫3天后，按照常規(guī)PEG（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；（2）收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；（3）將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照計(jì)數(shù)比1︰10的比例混合，離心后用50%PEG融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用托曲珠利為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)托曲珠利標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)3次，獲得細(xì)胞株K-5。5、單克隆抗體的制備與鑒定取8～10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定單克隆抗體托曲珠利的IC50分別為：5.0ng/mL，說明對(duì)托曲珠利有很好的靈敏度，可用于托曲珠利免疫分析檢測(cè)。K-5分泌的托曲珠利單克隆抗體的交叉反應(yīng)率如表1所示。表1托曲珠利單克隆抗體K-5的交叉反應(yīng)率化學(xué)物質(zhì)IC50(ng/mL)CR（%）托曲珠利5.0100鹽霉素>1000<0.05拉沙菌素>1000<0.05莫能菌素>1000<0.05馬杜霉素>1000<0.05海南霉素>1000<0.05地克珠利>1000<0.056、抗體應(yīng)用將雜交瘤細(xì)胞株K-5通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于托曲珠利的ELISA添加回收試驗(yàn)，具體步驟如下：（1）包被：將包被原TOL-OVA用0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液從2μg/mL開始倍比稀釋，100μL/孔，37℃反應(yīng)2h；（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；（3）封閉：拍干后，加入200μL/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；（4）加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μL/孔，37℃反應(yīng)1h；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反應(yīng)1h；（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μL的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；（6）終止和測(cè)定：每孔加入50μL2MH2SO4終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450值；（7）結(jié)果判讀：以O(shè)D450值大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)。添加回收及樣品前處理：本實(shí)驗(yàn)選取陰性雞肉組織為樣本，經(jīng)LC-MS鑒定選取的雞肉樣本中不含有托曲珠利。稱取4份1g雞肉均質(zhì)樣品置入50mL離心管中，分別添加2.0ng/g、5.0ng/g和10.0ng/g托曲珠利，剩下一份雞肉樣品為空白樣。向所有樣品中加入含10mL1%的三氯乙酸的乙腈溶液（w/v）震蕩均勻后，超聲提取30min，5000r/min離心10min，取5mL上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL正已烷，超聲15min，5000r/min離心15min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，加?.5mLPBS溶解，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，樣品稀釋倍數(shù)為0。其回收率分別為94.6%，104.2%，106.0%。溶液的配置：碳酸鹽緩沖液（CBS）：稱取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至1000mL，4℃貯存?zhèn)溆?；磷酸鹽緩沖液（PBS）：8.0gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2～7.4，定容至1000mL；PBST：含0.05%吐溫20的PBS；TMB顯色液：A液：Na2HPO4·12H2O18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000mL；B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按體積比1︰5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3