本發(fā)明屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、其編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferase,)可以特異性地將糖基團(tuán)從活性中間體(例如UDP-糖)轉(zhuǎn)移到受體分子上，具有較好的催化效率和區(qū)域選擇性，是糖苷類化合物合成與制備的理想催化劑。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在自然界尤其是植物中廣泛存在，對于植物次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控有著重要的作用。植物中許多重要天然產(chǎn)物的有效成分都是以其糖苷形式存在的。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作為實現(xiàn)天然產(chǎn)物糖基化的重要催化劑，其催化機理、構(gòu)效關(guān)系以及選擇性機制得以一定程度的研究解析。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶良好的催化特性已經(jīng)成功應(yīng)用于部分糖苷類天然產(chǎn)物的生產(chǎn)合成，是一種極具工業(yè)應(yīng)用價值的酶。藏紅花是一種在我國有著悠久藥用歷史的珍貴天然藥物，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花具有治療心血管疾病及預(yù)防動脈粥樣化、治療慢性病毒性肝炎及肝硬化、抗癌活性、抗氧化作用、改善乙醇誘發(fā)的學(xué)習(xí)及記憶障礙和提高機體免疫功能等諸多療效，并且藏紅花酸葡萄糖酯是其活性的最主要的有效成分，并且藏紅花資源的稀缺性以及藏紅花酸葡萄糖酯極低的含量限制了藏紅花的藥用開發(fā)。人工栽培藏紅花產(chǎn)量極低(6kg/hm2左右)，且其采收費時費力；藏紅花愈傷組織培養(yǎng)仍存在體系復(fù)雜、產(chǎn)量低且產(chǎn)物復(fù)雜難以分離等缺陷；化學(xué)法合成則存在反應(yīng)選擇性差、副產(chǎn)物多且整體產(chǎn)率低等缺陷。相比之下，酶法合成以其選擇性高、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高等特點成為解決藏紅花葡萄糖酯合成問題的一個可行方案。目前藏紅花和梔子中與藏紅花葡萄糖酯合成相關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)得以解析，在藏紅花酸轉(zhuǎn)化為藏紅花葡萄糖酯的過程中主要有2中糖基轉(zhuǎn)移酶參與，最終形成5種藏紅花酸糖酯產(chǎn)物(crocin-1、crocin-2、crocin-3、crocin-4和crocin-5)。藏紅花葡萄糖酯的生物合成已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。MaiNagatoshi等人利用從梔子G.jasminoides中純化得到葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶成功實現(xiàn)了酶法合成幾種藏紅花糖葡萄糖酯，但其總產(chǎn)量僅約3μΜ/L(NagatoshiM,TerasakaK,etal.UGT75L6andUGT94E5mediatesequentialglucosylationofcrocetintocrocininGardeniajasminoides.FEBSletters.2012；586(7):1055-61.)；Dufresne等利用藏紅花芽誘導(dǎo)出愈傷組織提取物作為催化劑，獲得無細(xì)胞催化體系進(jìn)行藏紅花酸糖基化反應(yīng)，單其產(chǎn)物主要為藏紅花單葡萄糖酯和藏紅花酸單龍膽二糖酯的混合物(DufresneC,CormierF,DorionS,etal.GlycosylationofencapsulatedcrocetinbyacrocussativusL.cellculture[J].EnzymeandMicrobialTechnology.1999,24:453)；France等利用藏紅花中提取到的粗酶液與藏紅花酸進(jìn)行反應(yīng)，獲得藏紅花雙葡萄糖酯(F,CormierF,etal.AhighlyspecificglucosyltransferaseisinvolvedinthesynthesisofcrocetinglucosylestersinCrocussativusculturedcells.JournalofPlantPhysiology.2001；158(5):553-60.)。但是由于植物源的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶難以純化制備，酶的選擇性不高，產(chǎn)物復(fù)雜，且其主要為植物膜蛋白，在工程菌株內(nèi)的異源高效表達(dá)非常困難等限制，目前藏紅花酸葡萄糖酯的制備還存在較大的問題。盡管葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是目前關(guān)于藏紅花酸葡萄糖酯合成的酶的研究還非常少，僅有植物藏紅花和梔子中相關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的報道，尚未見到能夠選擇性合成藏紅花酸單葡萄糖酯的酶或微生物源葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于藏紅花酸葡萄糖酯的報道。由于植物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶難以大量表達(dá)制備，且其在合成藏紅花酸葡萄糖酯的過程中選擇性不高，導(dǎo)致產(chǎn)物成分復(fù)雜等缺陷的存在，藏紅花酸葡萄糖酯的制備仍存在較大的技術(shù)瓶頸。近年來，隨著功能酶理性挖掘方法及生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展，依托植物糖基轉(zhuǎn)移酶合成藏紅花酸糖酯的機制，理性篩選易于大量表達(dá)制備且選擇性更高的的高效微生物源葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可以為解決藏紅花糖酯合成提供可行的方案，對于解決目前不能實現(xiàn)的高效定向制備藏紅花酸單葡萄糖酯具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對目前在糖基化合成藏紅花酸葡萄糖酯的過程中存在的植物關(guān)鍵葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶難以大量表達(dá)、底物濃度低、選擇性差等一系列問題，本發(fā)明提供了一種選擇性好、穩(wěn)定性好、表達(dá)量高的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，含有編碼該葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及其高效制備方法，以及該葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在藏紅花酸單葡萄糖酯選擇性定向合成中的應(yīng)用。本發(fā)明目的之一，在于提供一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列表如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明提供的SEQIDNO:2所示的氨基酸序列組成的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可以從本實驗篩選到的一株來源于污水處理站附近土壤的枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)中分離獲得，也可以從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體重分離獲得，也可以人工獲得。本發(fā)明另一目的在于提供一種編碼本發(fā)明的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明SEQIDNO:1所示的基因可以從本實驗篩選到的一株來源于污水處理站附近土壤的枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)中分離獲得，也可以從所示的重組表達(dá)載體中或者重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工獲得。本發(fā)明中，核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，命名為Bs-GT，全長1218bp。編碼序列(CDS)從第一個堿基起至第1218個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。本發(fā)明另一目的在于提供含有所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的重組載體、表達(dá)盒或重組菌。所述重組菌是將所述基因插入pet-28a后轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌E.coli-BL21-DE3所得，或是含有所述基因的本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體以及含有該重組載體的本領(lǐng)域各種常規(guī)宿主菌株。本發(fā)明構(gòu)建了葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-GT基因的重組表達(dá)載體，并將重組表達(dá)載體成功導(dǎo)入大腸埃希氏菌E.coli-BL21-DE3，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE驗證其在大腸埃希氏菌E.coli-BL21-DE3中成功表達(dá)。本發(fā)明還提供所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在定向合成藏紅花酸單葡萄糖酯中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用包括如下3種技術(shù)方案：(1)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶法定向合成藏紅花酸單葡萄糖酯：培養(yǎng)本發(fā)明前述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組表達(dá)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。其中，所述的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體中所用的培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域常規(guī)的任何可使轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)獲得的重組轉(zhuǎn)化體離心收集細(xì)胞，并經(jīng)生理鹽水洗滌2次后獲得靜息細(xì)胞。用pH7.5-8.5的PBS緩沖重懸細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎后離心收集粗酶液，并經(jīng)鎳柱純化獲取純化后的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。進(jìn)而將純化后的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與UDP-Glc(5.0-15g/L)和藏紅花酸(0.1-1.0g/L)混合到pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖溶液(優(yōu)選pH9.5的Gly-NaOH緩沖液)中，置于25-40℃水浴反應(yīng)2-4h。(2)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶偶聯(lián)體系定向合成藏紅花酸單葡萄糖酯：利用上述獲得的純化后的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖溶液(優(yōu)選pH9.5的Gly-NaOH緩沖液)中添加1U的蔗糖合成酶、濃度為0.25-1.0g/L的UDP、蔗糖(100-200g/L)后，置于25-40℃水浴反應(yīng)2-4h(優(yōu)選37℃)。(3)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶重組轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞催化定向合成藏紅花酸單葡萄糖酯：利用上述獲得的靜息細(xì)胞，在pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液或者pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖溶液(優(yōu)選pH9.5的Gly-NaOH緩沖液)中添加葡萄糖(20-50g/L)和藏紅花酸(0.1-1.0g/L)，置于25-40℃(優(yōu)選37℃)、180rpm搖床振蕩反應(yīng)12-24h。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有選擇性好、表達(dá)量高、催化效率高等顯著優(yōu)勢，其催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成的轉(zhuǎn)化率可達(dá)70-80％，是目前唯一報道的可以選擇性定向合成藏紅花酸單葡萄糖酯的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，具有很好的應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為基因Bs-GT的PCR擴增電泳圖，其中：1，DNAMarker；2，基因Bs-GT的PCR擴增產(chǎn)物。圖2為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶BS-GT的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中：1，蛋白Marker；2，Bs-GT粗酶液；3：鎳柱純化后的Bs-GT酶。圖3為藏紅花酸及5種藏紅花酸糖酯產(chǎn)物結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成示意圖。圖5為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶法催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成反應(yīng)時間進(jìn)程曲線。圖6為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶-蔗糖合成酶雙酶偶聯(lián)法催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成反應(yīng)時間進(jìn)程曲線。圖7為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶全細(xì)胞催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成反應(yīng)時間進(jìn)程曲線。圖8為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶全細(xì)胞催化的反應(yīng)產(chǎn)物HPLC檢測圖。圖9為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶全細(xì)胞催化的反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)C-MS檢測圖。具體實施方式實施例一本實施例說明本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的篩選步驟初篩采用如下方法：以10％DMSO作為篩選壓力從南京周邊污水處理廠附近的土壤中篩選耐有機溶劑的微生物。具體篩選培養(yǎng)基的配方為：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl1g/L，溶劑為10％DMSO水溶液。培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為24-48h，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。此方法可篩選到耐有機溶劑的微生物。將初篩獲得的菌株進(jìn)行復(fù)篩，具體方法如下：將菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，具體培養(yǎng)基的配方為：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl1g/L，溶劑為pH7.0的10％DMSO水溶液。培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時間為12-24h。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液于12000rpm離心1min，棄上清，取菌體溶于pH8.0磷酸緩沖液，并加入0.1g/L的藏紅花酸，置于30℃搖床振蕩反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液于12000rpm離心1min，收集上清，并通過HPLC檢測篩選結(jié)果，挑選可以將藏紅花酸糖基化的菌株進(jìn)行菌種鑒定。經(jīng)16SrRNA序列分析，發(fā)明人篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。實施例二本實施例說明本發(fā)明的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-GT編碼基因的分離克隆程序。采用酚-氯仿抽提法提取菌體總DNA。根據(jù)枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis全基因測序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得一個編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，根據(jù)該基因核苷酸序列設(shè)計引物SF和SR。SF(SEQIDNO:3)序列為：CGCGGCAGCCATATGGCTAGCGCTAATGTATTAATGATCGGTSF(SEQIDNO:4)序列為：TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTATGCATTTGCTGATTGAG其中，引物SF下劃線部分為NheⅠ酶切位點，引物SR下劃線部分為SalⅠ酶切位點。以本實驗篩選到的一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)基因組為模板，進(jìn)行PCR擴增。PCR體系為：2×TaqPlusMasterMix25μL，引物SF和SR各2μL，DNA模板2μL和ddH2O19μL。PCR擴增步驟為：(1)95℃，預(yù)變形5min；(2)95℃，變形30S；(3)52℃，退火30S；(4)72℃，延伸2min；步驟(2)～(4)重復(fù)30次；(5)72℃徹底延伸10min，冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶(圖1)。獲得一條完整的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，全長1218bp，命名為Bs-GT，其堿基序列如序列表中SEQIDNO:1所示。實施例三本實施例說明重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備。將實施例一所得的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段在37℃用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切12h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段。將目標(biāo)片段在T4連接酶的作用下，與同樣經(jīng)NheⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切后的質(zhì)粒pET28a，在16℃下過夜連接得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Bs-GT。將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli-BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上對陽性重組體進(jìn)行篩選，挑選單克隆，菌落PCR驗證陽性的克隆子，經(jīng)DNA測序驗證后，即獲得陽性重組轉(zhuǎn)化體大腸桿菌E.coli-BL21-DE3-/pET-Bs-GT。實施例四本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化過程。將實施例二所得的重組大腸桿菌E.coli-BL21-DE3-/pET-Bs-GT，接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按2％(v/v)的接種量接入裝有40mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于37℃、180rpm搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.6時，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，16℃誘導(dǎo)24h后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，并利用生理鹽水洗滌兩次，得靜息細(xì)胞。將所得的靜息細(xì)胞懸浮于pH8.0的緩沖液中，在冰浴中超聲破碎，離心收集上清液，即為重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。粗酶液用Ni-NTAAgarose親和柱層析除去不帶6His標(biāo)記的雜蛋白，并用腸激酶切除組氨酸標(biāo)簽，得到了電泳純葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖見圖2。實施例五本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶法催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為37℃，采用pH9.5的Gly-NaOH緩沖液，其中UDP-Glc為5-15g/L，藏紅花酸終濃度為0.1-1.0g/L，水浴反應(yīng)2-4h，定時取樣檢測，結(jié)果如圖5。實施例六本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶法催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為25℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖液，其中UDP-Glc為5g/L，藏紅花酸終濃度為0.1g/L，水浴反應(yīng)2h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為80％。實施例七本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶法催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為40℃，采用pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液，其中UDP-Glc為15g/L，藏紅花酸終濃度為1.0g/L，水浴反應(yīng)4h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為70％。實施例八本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶雙酶偶聯(lián)催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為37℃，采用pH8.5的Gly-NaOH緩沖液，其中UDP終濃度為0.25-1g/L，蔗糖終濃度為100-200g/L，藏紅花酸終濃度為0.1-1.0g/L，水浴反應(yīng)2-4h，定時取樣檢測，結(jié)果如圖6。實施例九本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶雙酶偶聯(lián)催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為25℃，采用pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液，其中UDP終濃度為0.25g/L，蔗糖終濃度為100g/L，藏紅花酸終濃度為0.1g/L，水浴反應(yīng)2h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為75％。實施例十本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶雙酶偶聯(lián)催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為40℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖溶液，其中UDP終濃度為1g/L，蔗糖終濃度為200g/L，藏紅花酸終濃度為1.0g/L，水浴反應(yīng)4h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為70％。實施例十一本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為37℃，采用pH9.5的Gly-NaOH緩沖液，其中葡萄糖終濃度為20-50g/L，藏紅花酸終濃度為0.1-1.0g/L，180rpm搖床內(nèi)振蕩反應(yīng)12-24h，定時取樣檢測，結(jié)果如圖7。在本優(yōu)選的條件下，將藏紅花酸糖基化產(chǎn)物經(jīng)HPLC和LC-MS，確認(rèn)產(chǎn)物為藏紅花酸單葡萄糖酯。檢測圖譜如圖8、9所示。實施例十二本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為25℃，采用pH7.5-8.0磷酸緩沖溶液，其中葡萄糖終濃度為20g/L，藏紅花酸終濃度為0.1g/L，180rpm搖床內(nèi)振蕩反應(yīng)12h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為80％。實施例十三本實施例說明重組葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化體全細(xì)胞催化藏紅花酸單葡萄糖酯定向合成方法。反應(yīng)條件：溫度為40℃，采用pH8.0-10.0的Gly-NaOH緩沖溶液，其中葡萄糖終濃度為50g/L，藏紅花酸終濃度為1.0g/L，180rpm搖床內(nèi)振蕩反應(yīng)24h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為72％。實施例十四本實施例說明本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶相較于類似葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在合成藏紅花酸單葡萄糖酯能力上的差異。按實施例十一所述的反應(yīng)條件，分別加入本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-GT和來源于其他枯草芽孢桿菌(SequenceID:CP011051.1,CP010434.1,CP002183.1)的具有相似核苷酸序列的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,并取樣檢測其催化藏紅花酸合成藏紅花酸單葡萄糖酯的能力，結(jié)果如表1所示。表1.不同枯草芽孢桿菌來源葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成藏紅花酸單葡萄糖酯結(jié)果菌株SequenceID轉(zhuǎn)化率本發(fā)明枯草芽孢桿菌70-80％BacillussubtilisstrainT30CP011051.12-5％Bacillussubtilissubsp.spizizeniistrainNRS231CP010434.10％Bacillussubtilissubsp.spizizeniistr.W23CP002183.10％實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組轉(zhuǎn)化體具有催化藏紅花酸糖基化生成藏紅花酸葡萄糖酯的能力，在優(yōu)選的條件下，最大摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到70-80％，并且產(chǎn)物單一，無副產(chǎn)物的產(chǎn)生。該高效率、高選擇性、高表達(dá)量的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在藏紅花酸葡萄糖酯的合成中具有巨大的應(yīng)用潛力。序列表<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及在合成藏紅花酸葡萄糖酯中的應(yīng)用<130>xb17041702<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1218<212>DNA<213>Bacillussubtilis<220><221>CDS<222>(1)..(1218)<400>1atggctaatgtattaatgatcggttttcccggtgaaggacatattaat48MetAlaAsnValLeuMetIleGlyPheProGlyGluGlyHisIleAsn151015ccgtctatcggtgtaatgaaggagctgaaatcacggggagaacatatt96ProSerIleGlyValMetLysGluLeuLysSerArgGlyGluHisIle202530acttactacgcagtgaaggaatacaaagaaaaaattgcagctcttgat144ThrTyrTyrAlaValLysGluTyrLysGluLysIleAlaAlaLeuAsp354045attgagtttcgtgagtatcatgattttcgagaagattacttcggaaaa192IleGluPheArgGluTyrHisAspPheArgGluAspTyrPheGlyLys505560aacgcaacaggagatgaagaaagagatttcgcagaaatgatctgcgcc240AsnAlaThrGlyAspGluGluArgAspPheAlaGluMetIleCysAla65707580tttttgaaaggctgtagggatattgcgactcatatttatgatgaagtc288PheLeuLysGlyCysArgAspIleAlaThrHisIleTyrAspGluVal859095aaacatgaatcgtatgattatgtcatatatgatcaccatttactggcc336LysHisGluSerTyrAspTyrValIleTyrAspHisHisLeuLeuAla100105110ggtaaaatcattgccaacctgctgaagctgccgagattttcattgtgt384GlyLysIleIleAlaAsnLeuLeuLysLeuProArgPheSerLeuCys115120125actacctttgcaatggatgaggaatttctaaaggaaataatgggttct432ThrThrPheAlaMetAspGluGluPheLeuLysGluIleMetGlySer130135140tacatgaaagggtcaattgaagaatcgtcacattatgaatcttaccag480TyrMetLysGlySerIleGluGluSerSerHisTyrGluSerTyrGln145150155160cagcttgtagaaacattaaatgctgattttcaaacagcgatcaaaaag528GlnLeuValGluThrLeuAsnAlaAspPheGlnThrAlaIleLysLys165170175ccatttgacgttttttcctcagatggggatttgacgattgtctttaca576ProPheAspValPheSerSerAspGlyAspLeuThrIleValPheThr180185190tcaagggaatttcagccaatggctgatcaattcggcgatcggtatgta624SerArgGluPheGlnProMetAlaAspGlnPheGlyAspArgTyrVal195200205tttgtcggtccttccattacagaaagggccggaaacaacgatttccca672PheValGlyProSerIleThrGluArgAlaGlyAsnAsnAspPhePro210215220tttgatcagattgacaatgaaaacgtgctgtttatttcaatgggaacc720PheAspGlnIleAspAsnGluAsnValLeuPheIleSerMetGlyThr225230235240atttttaacaatcaaaagcagttttttaatcaatgtctcgaggtatgt768IlePheAsnAsnGlnLysGlnPhePheAsnGlnCysLeuGluValCys245250255aaagactttgacggaaaagttgtgctttccatcggcaaacatattaaa816LysAspPheAspGlyLysValValLeuSerIleGlyLysHisIleLys260265270gcaaatgagctaaacgacattccggagaatttcattgtacgcccgtat864AlaAsnGluLeuAsnAspIleProGluAsnPheIleValArgProTyr275280285gtcccacagcttgagatcctgaaaagagccagcttatttgtaacccac912ValProGlnLeuGluIleLeuLysArgAlaSerLeuPheValThrHis290295300gggggaatgaatagcacaagtgaaggtttgtattttgaaaccccgctc960GlyGlyMetAsnSerThrSerGluGlyLeuTyrPheGluThrProLeu305310315320gtagtcattccgatgggtgctgaccaatttgctgtaggaaatcaagtg1008ValValIleProMetGlyAlaAspGlnPheAlaValGlyAsnGlnVal325330335gaaaaaataggcgcaggaaaagtgctgaaaaaagaacaattatcagaa1056GluLysIleGlyAlaGlyLysValLeuLysLysGluGlnLeuSerGlu340345350ggccttctgaaagaaacaattcatgaagtgatgaacaatcccgcatat1104GlyLeuLeuLysGluThrIleHisGluValMetAsnAsnProAlaTyr355360365gctgaaaaggcaaaagacattggccaatcattgaaagcggcaggcgga1152AlaGluLysAlaLysAspIleGlyGlnSerLeuLysAlaAlaGlyGly370375380tctaaaaaggcggccgacagcattcttgaagttgtgaaactcaaaact1200SerLysLysAlaAlaAspSerIleLeuGluValValLysLeuLysThr385390395400caatcagcaaatgcatag1218GlnSerAlaAsnAla405<210>2<211>405<212>PRT<213>Bacillussubtilis<400>2MetAlaAsnValLeuMetIleGlyPheProGlyGluGlyHisIleAsn151015ProSerIleGlyValMetLysGluLeuLysSerArgGlyGluHisIle202530ThrTyrTyrAlaValLysGluTyrLysGluLysIleAlaAlaLeuAsp354045IleGluPheArgGluTyrHisAspPheArgGluAspTyrPheGlyLys505560AsnAlaThrGlyAspGluGluArgAspPheAlaGluMetIleCysAla65707580PheLeuLysGlyCysArgAspIleAlaThrHisIleTyrAspGluVal859095LysHisGluSerTyrAspTyrValIleTyrAspHisHisLeuLeuAla100105110GlyLysIleIleAlaAsnLeuLeuLysLeuProArgPheSerLeuCys115120125ThrThrPheAlaMetAspGluGluPheLeuLysGluIleMetGlySer130135140TyrMetLysGlySerIleGluGluSerSerHisTyrGluSerTyrGln145150155160GlnLeuValGluThrLeuAsnAlaAspPheGlnThrAlaIleLysLys165170175ProPheAspValPheSerSerAspGlyAspLeuThrIleValPheThr180185190SerArgGluPheGlnProMetAlaAspGlnPheGlyAspArgTyrVal195200205PheValGlyProSerIleThrGluArgAlaGlyAsnAsnAspPhePro210215220PheAspGlnIleAspAsnGluAsnValLeuPheIleSerMetGlyThr225230235240IlePheAsnAsnGlnLysGlnPhePheAsnGlnCysLeuGluValCys245250255LysAspPheAspGlyLysValValLeuSerIleGlyLysHisIleLys260265270AlaAsnGluLeuAsnAspIleProGluAsnPheIleValArgProTyr275280285ValProGlnLeuGluIleLeuLysArgAlaSerLeuPheValThrHis290295300GlyGlyMetAsnSerThrSerGluGlyLeuTyrPheGluThrProLeu305310315320ValValIleProMetGlyAlaAspGlnPheAlaValGlyAsnGlnVal325330335GluLysIleGlyAlaGlyLysValLeuLysLysGluGlnLeuSerGlu340345350GlyLeuLeuLysGluThrIleHisGluValMetAsnAsnProAlaTyr355360365AlaGluLysAlaLysAspIleGlyGlnSerLeuLysAlaAlaGlyGly370375380SerLysLysAlaAlaAspSerIleLeuGluValValLysLeuLysThr385390395400GlnSerAlaAsnAla405<210>3<211>42<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>3cgcggcagccatatggctagcgctaatgtattaatgatcggt42<210>4<211>41<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1<400>4tgcggccgcaagcttgtcgacctatgcatttgctgattgag41當(dāng)前第1頁1 2 3