本發(fā)明涉及一種纖維素酶，尤指一種提升耐溫性的纖維素酶。

背景技術(shù)：

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成之一，也是地球上主要生物質(zhì)能(biomass)的來源，因此，現(xiàn)今許多能夠有效分解纖維素的酶蛋白在不同工業(yè)上的應(yīng)用也十分廣泛。纖維素是由葡萄糖為單位，以β-1,4-糖苷鍵(β-1,4-glycosidic bond)所鍵結(jié)而成的長鏈多糖，這些多糖體共同組織排列成緊密的結(jié)晶型纖維素，進而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中許多草食動物以及微生物等需要藉由將植物細(xì)胞壁中的多糖纖維素分解成可以被體內(nèi)吸收的葡萄單糖，以作為生存能量來源。纖維素酶的催化機制主要是藉由酸堿反應(yīng)，將連接兩個單糖的β-1,4-糖苷鍵進行水解作用，進而分解多糖纖維素。而纖維素酶基本上可分成三類，分別為內(nèi)切葡聚糖酶(endo-glucanase)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase)以及葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。內(nèi)切葡聚糖酶能夠隨機地將長鏈纖維素切成許多小片段的寡糖；而外切葡聚糖酶則可從長鏈纖維素的還原端或非還原端進行分解，其主要產(chǎn)物為纖維二糖；至于葡萄糖苷酶則可把纖維二糖分解為單糖的葡萄糖。

纖維素酶在工業(yè)上的應(yīng)用十分廣泛，不論是在食品、飼料或紡織業(yè)，甚至可運用到現(xiàn)在最受關(guān)注的生物質(zhì)能源。針對不同工業(yè)的應(yīng)用，纖維素酶也需有符合其不同的適用條件與范圍。舉例而言：飼料工業(yè)上適合偏酸性以及耐溫的酶蛋白，然而紡織工業(yè)上則是偏好偏堿性的纖維素酶。因此，能夠找出更加符合不同工業(yè)上所需的酶蛋白也是目前不論是學(xué)術(shù)或產(chǎn)業(yè)界都在努力的目標(biāo)。目前在許多相關(guān)的研究中，為了得到更佳的酶，除了在自然界中篩選出來之外，就是將現(xiàn)有的酶蛋白加以改造?，F(xiàn)今主要有兩大改造策略，其一是隨機突變或是將酶基因隨機排列，再于特定的作用條件之下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。此策略的好處是無須深入研究酶的結(jié)構(gòu)或作用機 制，而是直接在特定的條件下隨機去找出更好的酶蛋白；然而，其缺點即是需要大量的人力以及時間去進行大量篩選或是要有很好的大量篩選方法來配合。另一種改造策略則是藉由研究酶結(jié)構(gòu)與作用機制以找出對于酶活性或特性具有關(guān)鍵性的氨基酸，并針對這些特定氨基酸進行突變并測試，進而得到功能性更強的改造酶蛋白。此優(yōu)點是不需花費時間與人力在大量突變與篩選的步驟，但需要先了解此酶的蛋白結(jié)構(gòu)以及其作用機制，才能找出具改造潛力的特定氨基酸。

不同的工業(yè)制程需要符合其不同作用環(huán)境的酶蛋白來配合且參與。即便纖維素酶在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用已久，然而許多工業(yè)用酶是從嗜常溫菌，如里式木霉(Trichoderma reesei)所篩選出來的，因此耐熱性也較差。另一方面，耐熱性纖維素酶能夠有效地應(yīng)用于需要高溫作用環(huán)境的產(chǎn)業(yè)上，包含啤酒制成或是生質(zhì)能源工業(yè)等。具耐熱性的蛋白相對地其蛋白穩(wěn)定度也會較高，因此能夠在高溫環(huán)境中穩(wěn)定存在，甚至作用地更好。不論是在作用環(huán)境或是后段處理過程中，也不需擔(dān)心會因為高溫而破壞了酶蛋白本身。此外，酶蛋白的活性也是改良工業(yè)酶的一大重點，酶活性愈高就代表成本的下降以及利潤的提高。

根據(jù)文獻研究，雙硫鍵有助于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及提升耐熱性。里式木霉具有許多種纖維素酶，其中屬GH family 5的Cel5A纖維素酶，其蛋白結(jié)構(gòu)(ID 3QR3)在2011年發(fā)表，結(jié)構(gòu)內(nèi)部具有四個雙硫鍵位置在C16-C22、C92-C99、C232-C2683以及C273-C323，因此具有較高的溶解溫度(Tm值)，另外，Cel5A的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)α/β TIM barrel的結(jié)構(gòu)類型(Toni M Lee,Mary F Farrow,Frances H Arnold,and Stephen L Mayo.(2011)Protein Structure Report,nov27；20(11):1935-40.)。而在2004年Simon R.Andrews等人研究發(fā)現(xiàn)，Cellvibrio japonicas木聚糖酶蛋白CjXyn10A與Cellvibrio mixtus的CmXyn10B，在其N端與C端增加雙硫鍵鍵接，能夠進一步穩(wěn)定結(jié)構(gòu)進而提升溫度的耐受性，而CjXyn10A與CmXyn 10B其結(jié)構(gòu)也是屬于α/β TIM barrel型態(tài)(Andrews S.R.,Taylor E.J.,Pell G.,Vincent F.,Ducros V.M.,Davies G.J.,Lakey J.H.,and Gilbert H.J.,(2004)J.Biol.Chem.Dec24；279(52):54369-79.)。

因此，本發(fā)明欲藉由改造基因以增加纖維素酶的雙硫鍵鍵接，藉此提升 纖維素酶對于溫度的耐受性，以有效增加纖維素酶在工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于改造現(xiàn)有纖維素酶，利用結(jié)構(gòu)分析及點突變技術(shù)，增加纖維素酶的雙硫鍵鍵接，以有效提升纖維素酶的耐溫性，進而增加纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用價值。

為達上述目的，本發(fā)明的一個較廣義實施方式提供一種纖維素酶，其氨基酸序列是將序列編號2的N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)的序列。其中編碼該序列編號2的基因是從里式木霉(Trichoderma reesei)所分離出來并經(jīng)優(yōu)化的基因。

在一實施例中，該纖維素酶的氨基酸序列是序列編號4的氨基酸序列。

在一實施例中，該纖維素酶的氨基酸序列是序列編號6的氨基酸序列。

又，本發(fā)明的另一個較廣義實施方式提供一種編碼該纖維素酶的核酸分子及包含該核酸分子的重組質(zhì)粒。

附圖說明

圖1顯示W(wǎng)T纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖2顯示引物一的突變引物序列。

圖3顯示引物二的突變引物序列。

圖4顯示引物三的突變引物序列。

圖5顯示改造后的CGC纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖6顯示改造后的CPC纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。

圖7顯示W(wǎng)T纖維素酶與CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白的耐溫性分析。

圖8顯示評估雙硫鍵接的SDS-PAGE電泳分析。

具體實施方式

體現(xiàn)本發(fā)明特征與優(yōu)點的一些典型實施例將在后段的說明中詳細(xì)敘述。應(yīng)理解的是本發(fā)明能夠在不同的實施方式上具有各種的變化，其皆不脫離本 發(fā)明的范圍，且其中的說明及圖示在本質(zhì)上應(yīng)當(dāng)作說明之用，而非用以限制本發(fā)明。

本發(fā)明采用的纖維素酶是從里式木霉(Trichoderma reesei)菌株中所分離出來的基因，并經(jīng)優(yōu)化且去除N端91個氨基酸的序列，以提升其蛋白表達能力。此基因未經(jīng)突變處理，故以野生型纖維素酶稱之(以下簡稱WT纖維素酶)。前述WT纖維素酶的兩端是以EcoRI與NotI限制酶位置銜接在pPICZαA載體上，并進行定序及蛋白表達。圖1即顯示W(wǎng)T纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，WT纖維素酶基因包含984個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標(biāo)示)以及327個氨基酸(氨基酸序列以序列編號2標(biāo)示)。

進一步利用PyMOL軟件分析結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)WT纖維素酶的N端與C端之間空間距離約大于形成雙硫鍵的距離。因此，本發(fā)明嘗試將N端與C端兩端各加上一個Cysteine(半胱氨酸)之外，更在C端Cysteine前增加一個分子較小的Glycine(甘氨酸)或是讓長鏈產(chǎn)生角度偏轉(zhuǎn)的Proline(脯氨酸)，來減少N端與C端的空間距離而產(chǎn)生雙硫鍵相接，藉此穩(wěn)定蛋白的N端與C端，進而提升蛋白的耐溫性。換言之，本發(fā)明進行兩種突變改造，其中第一種突變改造是在WT纖維素酶的N端加上Cysteine及在C端加上Glycine及Cysteine，第二種突變改造是在WT纖維素酶的N端加上Cysteine及在C端加上Proline及Cysteine。改造后的蛋白包含330個氨基酸，N端的Cysteine位于氨基酸序列的第1個位置，C端的Glycine或Proline位于氨基酸序列的第329個位置，C端的Cysteine則位于氨基酸序列的第330個位置，故本發(fā)明的第一種突變改造以C1G329C330表示，簡稱CGC纖維素酶，而第二種突變改造以C1P329C330表示，簡稱CPC纖維素酶。

以下將詳述本發(fā)明改造纖維素酶的方法及其所得到的改良纖維素酶。

本發(fā)明運用點突變技術(shù)進行突變改造。首先，使用引物一(如圖2所示)于纖維素酶N端增加Cysteine之后，再利用引物二(如圖3所示)于纖維素酶C端增加Glycine與Cysteine，得到C1G329C330(CGC)的改造基因，接著再運用引物三(如圖4所示)，將C1G329C330改造基因的第329個氨基酸Glycine點突變?yōu)镻roline，得到C1P329C330(CPC)的改造基因。圖5即顯示改造后的CGC纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，CGC纖維素酶基因 包含993個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號3標(biāo)示)以及330個氨基酸(氨基酸序列以序列編號4標(biāo)示)。圖6則顯示改造后的CPC纖維素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，CPC纖維素酶基因包含993個堿基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號5標(biāo)示)以及330個氨基酸(氨基酸序列以序列編號6標(biāo)示)。

將兩種突變改造的DNA質(zhì)粒使用Pme I限制酶進行線性化之后，以電轉(zhuǎn)(electroporation)方式送入酵母Pichia pastoris X33，然后將轉(zhuǎn)型后的菌液涂到含有100μg/ml zeocin抗生素的YPD平板上，放置于30℃的培養(yǎng)箱進行兩天的培養(yǎng)。之后挑選單一菌落至5ml YPD于30℃培養(yǎng)，再接種到50ml BMGY中30℃培養(yǎng)一天；接下來將菌體換至20ml的BMMY進行四天的誘導(dǎo)蛋白表達。每24小時取樣并加0.5％甲醇，菌液以3500rpm轉(zhuǎn)速離心并收取上清液，進行蛋白量測量及纖維素酶活性測定。

纖維素酶的活性測試方式是取1％羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose,CMC,pH 4.8,0.05M檸檬酸鈉)0.2ml與適當(dāng)濃度的纖維素酶蛋白液(稀釋緩沖液為0.05M檸檬酸鈉；pH 4.8)0.2ml，混合均勻后在50℃下作用15分鐘，接著加入1.2ml的1％DNS并于100℃沸水中煮沸5分鐘以停止反應(yīng)且呈色，然后在冷水中降溫10分鐘，在OD₅₄₀波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中，酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線是由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0-0.35μg/ml之間制定，而1unit的定義為每分鐘釋放1μmole產(chǎn)物所需的酶蛋白量。

耐溫測試則是將適當(dāng)濃度的纖維素酶蛋白液(稀釋緩沖液為0.05M檸檬酸鈉；pH 4.8)放置在不同溫度下處理2分鐘，取出后放置在4℃降溫10分鐘再放置室溫回溫10分鐘，之后再進行50℃的酶活性檢測，以沒有經(jīng)過熱處理的酶蛋白樣本作為100％對照，分別計算出經(jīng)過熱處理后的相對殘留活性百分比。

圖7顯示W(wǎng)T纖維素酶與CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白的耐溫性分析，其中未經(jīng)熱處理的樣本的纖維素酶活性設(shè)定為100％。由圖7結(jié)果可知，在75℃、80℃以及85℃處理2分鐘后，CPC纖維素酶的相對殘留活性為94％、70％以及74％，CGC纖維素酶的相對殘留活性為93％、68％以及75％，兩者遠(yuǎn)高于WT纖維素酶的66％、35％以及43％。換言之，CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白在不同溫度下處理2分鐘后的殘留活 性皆高于WT纖維素酶原始蛋白，故具有較高的耐溫性，也表示具有較大潛力的工業(yè)應(yīng)用價值。

另一方面，本發(fā)明亦針對突變蛋白進行雙硫鍵的評估試驗。將適當(dāng)濃度的CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白以及WT纖維素酶原始蛋白液添加10mM dithiothreitol(DTT)，進行12.5％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，初步分析突變蛋白是否具有雙硫鍵接。

圖8顯示評估雙硫鍵接的SDS-PAGE電泳分析，其是運用DTT使蛋白結(jié)構(gòu)里的雙硫鍵斷裂，并觀察蛋白在電泳膠體中的移動速度。由圖8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加DTT后的CGC纖維素酶突變蛋白與添加DTT的WT纖維素酶原始蛋白的分子量與大小相當(dāng)，而未添加DTT的CGC纖維素酶突變蛋白位置遠(yuǎn)低于未添加DTT的WT纖維素酶原始蛋白，表示CGC纖維素酶突變蛋白產(chǎn)生較多的雙硫鍵接導(dǎo)致蛋白分子空間縮小，在電泳膠體中的移動速度較沒有增加雙硫鍵的原始蛋白來的快。

綜上所述，為了增加纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用價值，本發(fā)明藉由邏輯性的突變設(shè)計，使N端與C端產(chǎn)生雙硫鍵穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)來提升纖維素酶的耐溫性。在本發(fā)明的兩種突變設(shè)計中，第一種是在WT纖維素酶的N端加上Cysteine及在C端加上Glycine及Cysteine，得到CGC纖維素酶；第二種則是在WT纖維素酶的N端加上Cysteine及在C端加上Proline及Cysteine，得到CPC纖維素酶。根據(jù)耐溫測試結(jié)果可知，CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白相較于WT纖維素酶原始蛋白，對于高溫的耐受性更佳，故在面臨溫度的沖擊時能更穩(wěn)定并能降低其生產(chǎn)成本，可有效增加纖維素酶在工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)價值。

縱使本發(fā)明已由上述實施例詳細(xì)敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利范圍所欲保護者。