本發(fā)明涉及一種偏甘油酯脂肪酶及富含PUFA的油脂的酶法脫酸方法。

背景技術：

未經(jīng)精煉加工的天然動、植物油脂中均含有一定量的游離脂肪酸，需要對游離脂肪酸進行脫除后，油脂才能達到存儲、加工、食用等利用標準，因此油脂的脫酸處理是油脂加工中不可或缺的加工過程。

油脂脫酸方法有化學脫酸(堿煉脫酸)、物理脫酸、酶法脫酸等，其中物理脫酸需要在較高的溫度下進行(一般在200℃以上)，富含PUFA的油脂在高溫容易發(fā)生氧化與反式化，因此物理脫酸不適用于富含PUFA的油脂脫酸；化學脫酸方法是利用堿中和油脂中游離脂肪酸的原理進行的，由于堿中和脂肪酸后形成的皂會夾帶大量的中性油脂，使得脫酸油脂的得率較低，特別不適用于較高游離脂肪酸含量的油脂脫酸，而且化學脫酸的后續(xù)加工過程中會產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水，會對環(huán)境造成極大的污染，目前已經(jīng)越來越不被人們重視。酶法脫酸具有反應條件溫和、催化效率高、專一性強及環(huán)境友好等特點，且通過酶的回收利用可大大降低成本，應用潛力巨大。CN105802730A公布了一種米糠油酶法脫酸的方法，用甘油作為酰基受體，利用酶反應的高效性和專一性，在真空狀態(tài)下進行酯化脫酸，反應6h后，米糠油的酸值自26.8mgKOH/g降至1.96mgKOH/g，脂肪酸脫除率達到92.69％。CN105419937A公布了一種小麥胚芽油的酶法脫酸方法，利用固定化脂肪酶Novozym 435，在70℃下反應5h后，小麥胚芽油的酸值由21.72mgKOH/g降至2.98mgKOH/g，脂肪酸脫除率達到86.28％。CN105349259A公開了一種高酸價植物油的酶法脫酸工藝，在0.075～0.1MPa真空度下，固定化脂肪酶催化游離脂肪酸與單乙醇胺進行酰胺化反應，反應選擇性高，催化效率高；避免了酶法酯化反應造成的副產(chǎn)物增多、中性油消耗等問題。CN101824364A公布了一種高酸價魚油的酶法精煉脫酸方法，利用無水乙醇作為?；荏w，Novozym 435作為催化劑，在50℃下反應1h后，金槍魚油的酸價由36.3mgKOH/g降至4.7mgKOH/g，脂肪酸脫除率達到87.05％?？傊阜撍嵊捎谄渥饔脳l件溫和、催化效率高、專一性強且反應過程綠色環(huán)保等優(yōu)勢特別適用于對富含PUFA的油脂進行脫酸處理。

但是現(xiàn)有的酶法脫酸技術一般采用脂肪酶(甘油三酯脂肪酶)為催化劑，由于脂肪酶也可以催化甘油三酯與羥基供體進行反應，這就使得會有大量副反應發(fā)生，降低了脫酸油脂特別是產(chǎn)物中甘油三酯的得率。偏甘油酯脂肪酶是一種特殊的脂肪酶，其對偏甘油酯(甘油單酯和甘油二酯)具有嚴格的底物專一性，而不能作用于甘油三酯。研究表明偏甘油酯可以用于合成甘油二酯(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2012,77:87-91)，也可以用于去除甘油酯混合物中的偏甘油酯制備高純度的甘油三酯產(chǎn)品(Molecules,2013,18:9704-9716)。

進一步的研究表明，利用偏甘油酯脂肪酶的底物特異性，可以催化富含PUFA的油脂中的游離脂肪酸與短鏈一元醇反應生成脂肪酸酯，分離純化后可以得到低酸價的脫酸油脂。但是，現(xiàn)有的偏甘油酯脂肪酶(Lipase SMG1和Lipase G“Amano”50)其對長鏈多不飽和脂肪酸特別是EPA和DHA的催化效率較低，應用于富含PUFA的油脂脫酸后，脫酸效果差，產(chǎn)物中脂肪酸含量高。

技術實現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有的富含長鏈PUFA油脂酶法脫酸工藝中催化效率較低、反應時間長、反應不穩(wěn)定等問題，本發(fā)明提供一種偏甘油酯脂肪酶脫酸方法。

研究表明，偏甘油酯脂肪酶的催化功能特點也是由其分子結(jié)構特別是一級結(jié)構決定的；進一步的研究發(fā)現(xiàn)將Lipase SMG1 278位的Phe突變?yōu)锳sn后，得到的Lipase SMG1Phe278Asn，在用于富含長鏈PUFA的油脂脫酸時，具有良好的脫酸效果，并且不催化原料中的甘油三酯發(fā)生副反應，進而形成了本發(fā)明。

在本發(fā)明中，采用固定化Lipase SMG1Phe278Asn作為催化劑，在溶劑體系下催化游離脂肪酸與短鏈一元醇反應生成脂肪酸酯，反應產(chǎn)物經(jīng)過分離后得到脫酸后的油脂。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種偏甘油酯脂肪酶，是將Lipase SMG1第278位的Phe突變?yōu)锳sn后得到的突變體Lipase SMG1Phe278Asn，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1。

一種富含PUFA的油脂的酶法脫酸方法，包括以下步驟：

1)將富含PUFA的油脂與非極性有機溶劑、短鏈一元醇混合，添加固定化偏甘油酯脂肪酶進行酯化反應；所述偏甘油酯脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.1；

2)回收固定化酶，回收有機溶劑和一元醇，即得到脫酸后的富含PUFA的油脂。

步驟1)所述的油脂與有機溶劑的質(zhì)量體積比為1：(0.4～5)g/ml；所述油脂中游離脂肪酸與一元醇的摩爾比1:(1.1～4)。

步驟1)所述偏甘油酯脂肪酶的添加量為50～200U/g反應底物總質(zhì)量。

所述酯化反應的溫度為25℃以下。

步驟1)中所述固定化偏甘油酯脂肪酶的制備：固定化載體為環(huán)氧樹脂，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，偏甘油酯脂肪酶與環(huán)氧樹脂按10～50mg/g樹脂的比例混合進行固定化。

所述固定化載體為ECR8285環(huán)氧樹脂，緩沖液的濃度為1.5moL/L，pH＝6.0；固定化時間為7h。

步驟1)中所述的一元醇為甲醇、乙醇、丙醇或者其中兩種以上的混合。

所述的富含PUFA的油脂為海洋魚油、藻油或富含具有20個碳原子以上多不飽和脂肪酸中的一種或兩種以上的混合物。

步驟1)中所述的富含PUFA的油脂的酸值為20～80mgKOH/g。

步驟2)所述的非極性有機溶劑為正己烷、正庚烷、異辛烷中的一種或兩種以上的混合物。

所述一元醇采用分步添加的方式進行，分別為酯化反應開始時添加總量的1/3，反應進行6h后添加1/3，反應進行12h后添加余下的1/3。

步驟2)中所述的固定化酶的回收方式為過濾回收，有機溶劑和一元醇采用減壓蒸餾或分子蒸餾(薄膜蒸發(fā))的方式回收。本發(fā)明所采用的固定化偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1Phe278Asn對長鏈多不飽和脂肪酸EPA和DHA的選擇性較野生型Lipase SMG1有顯著提高，催化活力也有明顯提高。與此同時，其仍保持對偏甘油酯嚴格的底物特異性。應用上述偏甘油酯酶催化富含PUFA的油脂中的游離脂肪酸與短鏈一元醇反應，幾乎可以將全部的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸酯。酯化反應可以在較低的溫度下進行，避免了油脂中PUFA的氧化。

發(fā)明人研究表明，利用固定化Lipase SMG1Phe278Asn催化富含PUFA的油脂中的游離脂肪酸與短鏈一元醇反應時，存在反應體系粘度大、反應后期速率慢的現(xiàn)象。進一步研究表明，當反應體系中加入一定量的非極性有機溶劑時，能顯著改善反應的傳質(zhì)及后期反應速率慢的問題。因此，綜合考慮反應速率和脂肪酸的去除效果，本發(fā)明在利用固定化Lipase SMG1Phe278Asn催化富含PUFA的油脂中的游離脂肪酸與短鏈一元醇反應時，加入一定量的非極性有機溶劑來改善脂肪酸的去除效果。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明中，采取固定化Lipase SMG1Phe278Asn為催化劑，避免了甘油三酯發(fā)生副反應，提高了PUFA的脫酸效率，降低了PUFA氧化的風險。

(2)本發(fā)明采用正己烷或異辛烷或兩者的混合物為溶劑，并采用分步添加一元醇的方法，提高了脫酸效率，游離脂肪酸的去除率可以達到99％以上，增加了固定化脂肪酶的重復使用次數(shù)。

具體實施方式

以下通過實施例更詳細地介紹本發(fā)明的實施。在所述實施例中，所有百分比均以質(zhì)量計。

固定化Lipase SMG1Phe278Asn的制備：固定化載體為ECR8285環(huán)氧樹脂，偏甘油酯脂肪酶與ECR8285環(huán)氧樹脂按20mg/g樹脂的比例混合，緩沖液為1.5moL/L pH＝6.0的磷酸鹽緩沖液且添加量與酶液體積相等，混勻后于轉(zhuǎn)速為200rpm的水浴搖床中室溫下固定化7h。固定化酶通過布氏漏斗過濾回收，于30℃下真空干燥6h。最終得到的固定化酶的蛋白吸附量為52.7mg/g,蛋白吸附率為82.11％，酯化酶活為328U/g(正丙醇月桂酸法)。

實施例1

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.29g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.29g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至0.10mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.63％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為3.2meq/Kg(與原料基本一致)，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

實施例2

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.22g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為2:1)和60mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至20℃后，加入100U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在20℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.22g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為2:3)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至0.19mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.29％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為3.1meq/Kg(與原料基本一致)，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

實施例3

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.5g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為6:5)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.5g無水乙醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為2:5)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至0.10mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.72％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為2.3meq/Kg(與原料基本一致)，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

實施例4

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.28g無水甲醇(游離脂肪酸和無水甲醇的摩爾比為3:2)和60mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至20℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在20℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.28g無水甲醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水甲醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至0.14mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.61％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為2.2meq/Kg，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

實施例5

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.29g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)和80mL異辛烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.29g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至0.09mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.66％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為3.0meq/Kg(與原料基本一致)，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

實施例6

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.5g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為6:5)和60mL異辛烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至20℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在20℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.5g無水乙醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為2:5)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至0.11mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到99.70％，回收得到的脫酸油脂的過氧化值為2.2meq/Kg(與原料基本一致)，固定化酶重復使用6個批次后，其活力沒有明顯降低。

對比實施例1

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.29g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.29g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至3.73mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到86.07％。

對比實施例2

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.29g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase G“Amano”50，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.29g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至3.41mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到87.27％。

對比實施例3

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.28g無水甲醇(游離脂肪酸和無水甲醇的摩爾比為3:2)和80mL異辛烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至20℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1，在20℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.28g無水甲醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水甲醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至4.89mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到86.48％。

對比實施例4

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.5g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為6:5)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.5g無水乙醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為2:5)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至5.69mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到84.26％。

對比實施例5

取20g脫色后的金槍魚油，金槍魚油的酸值為36.16mgKOH/g，加入0.4g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)和80mL異辛烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.4g無水乙醇(三次添加后，金槍魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后金槍魚油的酸值，金槍魚油的酸值由初始的36.16mgKOH/g降至5.39mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到85.09％。

對比實施例6

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，一次性加入0.87g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的總摩爾比為1:2)和80mL正己烷置于500mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至1.70mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到93.65％。

對比實施例7

取20g脫色后的魷魚油，魷魚油的酸值為26.78mgKOH/g，加入0.29g無水乙醇(游離脂肪酸和無水乙醇的摩爾比為3:2)后置于100mL具塞三角瓶中，混勻并預熱至25℃后，加入80U/g(占反應底物總質(zhì)量)固定化Lipase SMG1Phe278Asn，在25℃下開始進行酯化反應，氣浴搖床攪拌速度為200rpm，反應6h和12h后分別繼續(xù)加入0.29g無水乙醇(三次添加后，魷魚油中游離脂肪酸與無水乙醇的總摩爾比為1:2)，酯化反應30h后，分析脫酸后魷魚油的酸值，魷魚油的酸值由初始的26.78mgKOH/g降至1.14mgKOH/g，游離脂肪酸的去除率可以達到95.74％。固定化酶重復使用3個批次后，其活力變?yōu)樽畛趸盍Φ?8％。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種偏甘油酯脂肪酶及富含PUFA的油脂的酶法脫酸方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

Gly Arg Gly Gly Ser Ser Thr Asp Gln Pro Val Ala Asn Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Thr Lys Glu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Leu Val Gln Gln Thr Tyr Cys

20 25 30

Asp Ser Thr Glu Asn Gly Leu Lys Ile Gly Asp Ser Glu Leu Leu Tyr

35 40 45

Thr Met Gly Glu Gly Tyr Ala Arg Gln Arg Val Asn Ile Tyr His Ser

50 55 60

Pro Ser Leu Gly Ile Ala Val Ala Ile Glu Gly Thr Asn Leu Phe Ser

65 70 75 80

Leu Asn Ser Asp Leu His Asp Ala Lys Phe Trp Gln Glu Asp Pro Asn

85 90 95

Glu Arg Tyr Ile Gln Tyr Tyr Pro Lys Gly Thr Lys Leu Met His Gly

100 105 110

Phe Gln Gln Ala Tyr Asn Asp Leu Met Asp Asp Ile Phe Thr Ala Val

115 120 125

Lys Lys Tyr Lys Lys Glu Lys Asn Glu Lys Arg Val Thr Val Ile Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Ala Ala Met Gly Leu Leu Cys Ala Met Asp Ile Glu

145 150 155 160

Leu Arg Met Asp Gly Gly Leu Tyr Lys Thr Tyr Leu Phe Gly Leu Pro

165 170 175

Arg Leu Gly Asn Pro Thr Phe Ala Ser Phe Val Asp Gln Lys Ile Gly

180 185 190

Asp Lys Phe His Ser Ile Ile Asn Gly Arg Asp Trp Val Pro Thr Val

195 200 205

Pro Pro Arg Ala Leu Gly Tyr Gln His Pro Ser Asp Tyr Val Trp Ile

210 215 220

Tyr Pro Gly Asn Ser Thr Ser Ala Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Glu Asn

225 230 235 240

Val His Gly Ile Leu Thr Val Ala Arg Glu Phe Asn Asn Asp Asp His

245 250 255

Gln Gly Ile Tyr Phe His Thr Gln Ile Gly Ala Val Met Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Ala Gln Val Gly Asn His

275