本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法。

背景技術(shù)：

阿魏酸，化學(xué)名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是咖啡酸的衍生物。目前，已在多種蔬菜、水果及飲料(咖啡、啤酒)中發(fā)現(xiàn)。阿魏酸具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痙攣和提高膜穩(wěn)定性以及抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、保健品、化妝品原料和食品添加劑等方面。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枺?01510075678.0公開了一種川芎LCCOMT重組酶轉(zhuǎn)化合成阿魏酸的方法，然而現(xiàn)有的技術(shù)使用游離酶，游離酶與產(chǎn)物難以直接分離，導(dǎo)致酶無法反復(fù)利用，具有成本高、不能用于持續(xù)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的是提出一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法，固定化酶具有不溶于水，易與產(chǎn)物分離，穩(wěn)定性好，可用于持續(xù)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法，主要步驟如下：將海藻酸鈉于50～85℃水中攪拌溶解，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％～4.5％，冷卻至室溫后加入100μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用5mL注射器從10cm左右高度滴入2.5～40g/L CaCl₂溶液中，4℃固定化0.5～10h后，用蒸餾水洗滌2～3次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，海藻酸鈉溶液與酶質(zhì)量之比為2000:1～35000:1。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，CaCl₂濃度為2.5g/L。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，固定化時(shí)間為1h。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，海藻酸鈉溶液與酶質(zhì)量之比為35000:1。

本發(fā)明的一種用于生產(chǎn)阿魏酸的固定化基因工程酶的制備方法中，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％、CaCl₂濃度為2.5g/L、固定化時(shí)間為1h、海藻酸鈉溶液與酶質(zhì)量比為35000:1。

與目前技術(shù)相比，本發(fā)明主要具有以下有益效果：

本發(fā)明固定化酶具有不溶于水，易與產(chǎn)物分離，穩(wěn)定性好，可用于持續(xù)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。與游離酶相比，固定化酶相對(duì)酶活力為75.43％，連續(xù)使用12次，酶活力仍保留34.10％(與固定化酶第一次反應(yīng)酶活力相比)。這達(dá)到了使重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的一般穩(wěn)定性增加、易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離且能反復(fù)多次使用的目的，并為工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸打下良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也降低了酶的使用成本。

本發(fā)明中所用原料海藻酸鈉廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域，交聯(lián)劑CaCl₂也在食品制造、建筑材料、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等多個(gè)方面均有重要的應(yīng)用價(jià)值。所用原料均為綠色、環(huán)保、安全無毒材料，對(duì)環(huán)境無二次污染，且制備工藝簡(jiǎn)單易行，成本較低，節(jié)能環(huán)保，具有很好的社會(huì)效益和環(huán)境效益。

以海藻酸鈉為原料，CaCl₂為交聯(lián)劑，可實(shí)現(xiàn)對(duì)重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶重組酶的固定化，達(dá)到使重組酶的一般穩(wěn)定性增加、易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離且能反復(fù)多次使用的目的，并為工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸打下良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也降低了酶的使用成本。

附圖說明

圖1海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

圖2CaCl₂濃度的影響。

圖3固定化時(shí)間的影響。

圖4海藻酸鈉溶液與酶質(zhì)量之比的影響。

圖5固定化酶操作穩(wěn)定性。

圖6固定化酶照片。

圖7固定化酶活性檢測(cè)HPLC圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉的具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式的任意組合。

實(shí)施例1

稱取1.05g海藻酸鈉于250mL燒杯中，用脫氧去離子水于70℃水浴條件下攪拌溶解，得無色透明溶液，冷卻至室溫后加脫氧去離子水至52.5g，再加入1500μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用分析天平稱量3.5g混合物于5mL注射器中，從10cm左右高度滴入濃度為2.5g/L的CaCl₂溶液，4℃固定化1h后，用蒸餾水洗滌2次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

稱取1.05g海藻酸鈉于250mL燒杯中，用脫氧去離子水于70℃水浴條件下攪拌溶解，得無色透明溶液，冷卻至室溫后加脫氧去離子水至52.5g，再加入1500μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用分析天平稱量3.5g混合物于5mL注射器中，從10cm左右高度滴入濃度為2.5～40g/L的CaCl₂溶液，4℃固定化1h后，用蒸餾水洗滌2次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3

稱取1.05g海藻酸鈉于250mL燒杯中，用脫氧去離子水于70℃水浴條件下攪拌溶解，得無色透明溶液，冷卻至室溫后加脫氧去離子水至52.5g，再加入1500μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用分析天平稱量3.5g混合物于5mL注射器中，從10cm左右高度滴入濃度為2.5g/L的CaCl₂溶液，4℃固定化0.5～10h后，用蒸餾水洗滌2次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4

稱取0.525g海藻酸鈉于250mL燒杯中，用脫氧去離子水于70℃水浴條件下攪拌溶解，得無色透明溶液，冷卻至室溫后加脫氧去離子水至52.5g，再加入1500μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用分析天平稱量3.5g混合物于5mL注射器中，從10cm左右高度滴入濃度為2.5g/L的CaCl₂溶液，4℃固定化2h后，用蒸餾水洗滌2次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5

稱取0.9g海藻酸鈉于250mL燒杯中，用脫氧去離子水于70℃水浴條件下攪拌溶解，得無色透明溶液，冷卻至室溫后加脫氧去離子水至45.0g，再加入1500μg重組化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,在4℃層析冷柜中用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用分析天平稱量3.0g混合物于5mL注射器中，從10cm左右高度滴入濃度為2.5g/L的CaCl₂溶液，4℃固定化2h后，用蒸餾水洗滌2次并抽濾掉表面水分，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例6

固定化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性鑒定反應(yīng)體系為：200mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，500μM咖啡酸，1mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，1.5mM MgCl₂，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，相應(yīng)固定化川芎咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，總體積10mL，37℃靜止反應(yīng)2h，加1mL濃HCl終止反應(yīng)。用5mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，用甲醇：甲酸(95:5)溶解并定容至5mL，高效液相色譜法檢測(cè)阿魏酸含量。

高效液相色譜條件為：上樣量10μL，流動(dòng)相：0.1％的磷酸-甲醇(66:34)，流速：1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為323nm。