本發(fā)明屬于合成生物學領域，涉及一種生產(chǎn)倍半萜化合物—橙花叔醇(nerolidol)的萜類合酶及其應用。

背景技術：

萜類化合物是含有異戊二烯單元的化合物的總稱。它在自然界廣泛存在，迄今為止，人們已從動物、植物以及微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大約76 000種萜類化合物。該化合物具有許多生理活性，所以被廣泛應用于香水生產(chǎn)行業(yè)、保健品行業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域以及醫(yī)療行業(yè)。

萜類化合物的生產(chǎn)方法有天然提取、化學合成法和發(fā)酵法。但由于天然提取法生產(chǎn)成本居高不下，化學合成法可能的毒害作用和國際上對天然產(chǎn)物的日益推崇，人們開始大量研究利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)萜類化合物。

生物體利用2-甲基-赤蘚糖醇磷酸(MEP途徑)或者甲羥戊酸途徑(MVA途徑)以及異戊烯焦磷酸異構酶Idi合成IPP以及DMAPP，隨后IPP以及DMAPP在異戊烯轉移酶催化下合成GPP、FPP，GGPP以及GFPP等不同鏈長的異戊二烯單元。隨后萜類合酶(terpene synthase，TS)可以這些不同鏈長的異戊二烯單元為底物，合成單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C120)、二倍半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)以及多萜。

這其中，單萜和倍半萜為香水及香料化合物的主要來源，對有關這些化合物生物合成基因的挖掘及在萜類化合物微生物合成高產(chǎn)平臺中進行代謝工程改造，將使得我們能夠高效經(jīng)濟地實現(xiàn)這些高附加值產(chǎn)物的合成。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明提供一種新型的萜類合酶TPF09930及含有該萜類合酶基因的生產(chǎn)橙花叔醇的菌株，以實現(xiàn)倍半萜化合物橙花叔醇微生物合成，提高產(chǎn)量、降低成本，為香水及香料化合物的主要來源，減少毒害作用。

本發(fā)明的第一方面，提供一種萜類合酶TPF09930，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

進一步地，本發(fā)明提供一種核酸分子，其編碼上述萜類合酶TPF09930，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明的第二方面，提供萜類合酶TPF09930的用途，用于生產(chǎn)橙花叔醇。

本發(fā)明的第三方面，提供一種生產(chǎn)橙花叔醇的菌株，該菌株含有甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和橙花叔醇合成的相關基因；所述的甲羥戊酸途徑的相關基因包括(1)將乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A的基因atoB、(2)將乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合為HMG-CoA的基因erg13、(3)將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的基因thmg1、(4)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因erg12、(5)將甲羥戊酸-5-磷酸磷酸化為甲羥戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、(6)將甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的基因mvd1和(7)將異戊烯焦磷酸異構為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的橙花叔醇合成的相關基因包括ispA和萜類合酶TPF09930基因，所述的TPF09930基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。合成的目標萜類化合物橙花叔醇具有下列式(I)的結構：

所述的甲羥戊酸途徑的相關基因優(yōu)選為來源于大腸桿菌XL1-blue的atoB基因(AM946981.2)、idi(CP010152.1)和來源于釀酒酵母INVSC1的erg13基因(CP005477.2)、tHMG1(CP005464.2)、erg12(CP008027.1)、erg8(CP005426.1)、mvd1(CP005554.2)。

所述的萜類合酶TPF09930基因來源于真菌交鏈格孢TPF6菌株(Alternaria alternata TPF6)的TPF09930，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1。

優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)橙花叔醇的菌株為含有質粒pMH1、質粒pFZ81和質粒pGB136的大腸桿菌；所述的質粒pMH1以pBBR1MCS為骨架載體、啟動子為lac啟動子，復制子替換為p15A復制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID NO.3所示；所述的質粒pFZ81以pBBR1MCS-2為骨架載體、啟動子為lac啟動子、復制子為質粒自帶的pBBR1MCS復制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID NO.4所示；所述的質粒pGB286以pET21為骨架載體、啟動子為T7啟動子、復制子為質粒自帶的高拷貝的pBR322復制子，包含TPF09930、ispA、idi基因，pGB286的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID NO.5所示。

優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)橙花叔醇的菌株原核表達時過表達來源于大腸桿菌XL1-blue的atoB基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP。

本發(fā)明的第四方面是提供上述生產(chǎn)橙花叔醇的菌株在生產(chǎn)橙花叔醇中的應用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點和效果：本發(fā)明首次利用萜類合酶TPF09930基因結合外源的甲羥戊酸途徑獲得了穩(wěn)定生產(chǎn)橙花叔醇的大腸桿菌。本發(fā)明的萜類合酶具有專一性和高效性，可以提高橙花叔醇的產(chǎn)量，極大地克服了原料投入量大而橙花叔醇產(chǎn)率低的弊端，降低了研究成本，并且保證綠色環(huán)保。

附圖說明

圖1為GC-MS檢測TPF09930體外反應色譜圖；

圖2為質粒pMH1結構示意圖；

圖3為質粒pFZ81結構示意圖；

圖4為質粒pGB286結構示意圖；

圖5為用于TPF09930-FPP發(fā)酵合成萜類化合物的質粒及突變株的構建示意圖；

圖6為E.coli菌株N1的發(fā)酵產(chǎn)物的GC-MS色譜圖；

圖7為化合物橙花叔醇的譜圖，

其中a為橙花叔醇的結構示意圖；b為碳譜圖(13C NMR，CDCl₃，101MHz)；c為氫譜圖(1H NMR，CDCl₃，400MHz)。

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

【實施例1】體外驗證萜類合酶的功能

1、質粒pGB136的構建

以反轉錄的Alternaria alternata TPF6的cDNA為模板，用引物P27/P29(見表1)擴增獲得TPF09930的編碼區(qū)并連接到質粒pET28a上獲得質粒pGB136。TPF09930的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、蛋白的純化

將含有目的基因(SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)的表達載體pGB136轉化表達宿主E.coli BL21(DE3)，轉化后挑取單克隆至含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)。按1％接種量轉接至1L含相應抗生素的新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.6-0.8，降溫至16℃，加入終濃度為0.1mM的IPTG，16℃，220rpm培養(yǎng)16-18h。8 000rpm離心5min收集細胞，之后用30-40mL蛋白純化緩沖液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，4mMβ-巰基乙醇，pH 7.6)徹底重懸細胞，超聲破碎(脈沖5s，停頓8s，超聲破碎5min)。4℃，12,000g離心30min以上，收集上清，4℃，20,000rpm離心1h，收集上清，用0.45μm濾膜進行過濾，加入6％buffer B(Buffer B：500mM咪唑加入到Buffer A中)使咪唑約為30mM，混勻備用。

使用Bio-Rad的Biologic DuoFlow Chromatography System純化組氨酸標簽蛋白。蛋白分離柱加載至FPLC上加以控制，F(xiàn)PLC的流速始終為1.5mL/min，而樣品自動上樣的流速為2mL/min。所得到的上清樣品用5mL Hitrap HP Ni-NTA柱子經(jīng)Biorad做第一步純化，該鎳離子螯合柱先經(jīng)過30mL(6個柱體積)緩沖液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，4mMβ-巰基乙醇，pH7.6)的平衡，然后通過自動進樣器將準備好的30mL上清液加載到柱子上，再用20mL的緩沖液A(4個柱體積)對柱子進行清洗，這時啟動緩沖液B(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM Imidazole pH 7.6)的線性梯度，在100mL(20個柱體積)的流量內(nèi)，緩沖液B由0％增長為100％，再用20mL(4個柱體積)100％的緩沖液B清洗柱子。根據(jù)紫外吸收收集并通過SDS-PAGE檢測帶有組氨酸標簽的目的蛋白。挑選比較純的組分收集起來，通過Millipore公司的離心濃縮管Amicon Centricon-10(分子量在10,000以下的會被濾出)來離心濃縮至2.5mL，然后通過Pharmacia公司的PD-10柱子脫鹽并交換到緩沖液C(含有10％甘油的50mM磷酸緩沖液，pH 7.6)中，分裝后液氮速凍并保存于-80℃冰箱。

3、體外催化反應

我們設立了以下體外酶促反應體系：向200μL終濃度為50mM含有10％甘油的PB buffer(pH 7.6)緩沖液中添加10μM純化的蛋白，100μM的底物GPP、FPP或GGPP，以及2mM的Mg²⁺，30℃過夜反應。隨后用等體積的正己烷萃取2次，合并有機相并用GC-MS檢測生成的產(chǎn)物。

萜類化合物檢測所用的GC-MS為Thermo TRACE GC ULTRA氣相色譜配備TSQ QUANTUM XLS MS，氣相色譜柱為TRACE TR-5MS(30m×0.25mm×0.25um)。每次分析進樣1μL，以高純的氦氣為載氣，設置流速為1mL/min。GC條件為80℃維持1min，隨后以10℃/min的速率升溫到220℃，再在220℃維持15min。進樣器和傳輸線溫度分別設定為230℃和240℃。

結果顯示，TPF09930(簡稱AaTS)能夠以GPP、FPP或GGPP為底物，合成單萜、倍半萜和二萜產(chǎn)物(圖1)。

【實施例2】構建表達載體

用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit純化獲得大腸桿菌XL1-blue基因組DNA和釀酒酵母INVSC1基因組DNA。

質粒pMH1含有甲羥戊酸途徑前三個基因：來源于大腸桿菌XL1-blue的atoB基因(乙酰乙酰輔酶A硫酯酶，AM946981.2)，來源于釀酒酵母INVSC1的erg13(HMG-CoA synthase，CP005477.2)和tHMG1(HMG-CoA還原酶，刪除了HMG1的跨膜區(qū)域，CP005464.2)。

質粒pFZ81含有甲羥戊酸途徑后四個基因：來源于釀酒酵母INVSC1的erg12(甲羥戊酸激酶，CP008027.1)，erg8(甲羥戊酸-5-磷酸激酶，CP005426.1)和mvd1(甲羥戊酸-5-焦磷酸激酶，CP005554.2)，來源于大腸桿菌XL1-blue的idi(異戊烯焦磷酸異構酶，CP010152.1)基因。

質粒pGB286含有合成倍半萜化合物的三個基因，分別是來源于真菌交鏈格孢TPF6菌株(Alternaria alternata TPF6)的TPF09930(SEQ ID NO：2)，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1；來源于大腸桿菌XL1-blue的Idi；來源于大腸桿菌XL1-blue的ispA，能夠以甲羥戊酸產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)為底物合成法尼基焦磷酸，用于倍半萜的合成。

所有基因均通過PCR擴增獲得，所用引物見表1。

表1引物序列表

具體構建方法如下：

①質粒pMH1的構建

首先將pBBR1MCS質粒的復制子替換為來源于pMSD15質粒的p15A復制子。以質粒pBBR1MCS為模板用引物P1/P2進行擴增，同時p15A復制子用引物P3/P4擴增(引物序列見表1)，擴增條件為：98℃，2min預變性，然后30個PCR循環(huán)98℃,20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。經(jīng)PCR產(chǎn)物純化后用Nanodrop測定DNA濃度，然后將20ng pCR擴增的p15A片段和等摩爾的pBBR1MCS片段混合，隨后轉化大腸桿菌XL1-blue獲得質粒pBBR1MCS/p15A。

用引物P5/P6以pBBR1MCS/p15A為模板擴增pMH1質粒骨架，同時用P7/P8、P9/P10、P11/P12為引物擴增相應基因。經(jīng)PCR產(chǎn)物純化之后，取50ng pBBR1MCS/p15A擴增產(chǎn)物和等摩爾的各基因擴增產(chǎn)物混合，并用去離子水調整體積到5μL，隨后加入至15μL的Gibson緩沖液中混勻，50℃反應1h后轉化大腸桿菌XL1-blue，挑取克隆，并將陽性克隆測序獲得質粒pMH1(圖2)。

②質粒pFZ81的構建

用引物P13/P14以pBBR1MCS-2為模板擴增pFZ81質粒骨架，同時用P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22為引物擴增相應基因。經(jīng)PCR產(chǎn)物純化之后，取50ng pBBR1MCS-2擴增產(chǎn)物和等摩爾的各基因擴增產(chǎn)物混合，并用去離子水調整體積到5μL，隨后加入至15μL的Gibson緩沖液中混勻，50℃反應1h后轉化大腸桿菌XL1-blue，挑取克隆，并將陽性克隆測序獲得質粒pFZ81(圖3)。

③質粒pGB285的構建

以反轉錄的Alternaria alternata TPF6的cDNA為模板，用引物P27/P28擴增獲得TPF09930的編碼區(qū)并連接到質粒pET21上獲得質粒pGB285。

④質粒pGB286的構建

用引物P23/P24以及P25/P26分別從E.coli BL21(DE3)基因組上擴增ispA以及idi基因，隨后將ispA克隆至pET21a獲得質粒pGB305；將idi克隆至pET21a(+)獲得質粒pGB306。分別用XbaI/XhoI，SpeI/XhoI酶切質粒pGB305和pGB306，隨后借助同尾酶將pGB306上酶切下來的idi片段連接至質粒pGB305從而獲得質粒pGB308。隨后用XbaI/XhoI從pGB308上酶切下來ispA-idi片段并借助同尾酶分別將其連接至質粒pGB285，獲得質粒pGB286(圖4)。

【實施例3】大腸桿菌體內(nèi)合成TPF09930來源的倍半萜化合物

為了生產(chǎn)倍半萜化合物，將甲羥戊酸途徑的兩個質粒pMH1和pFZ81同時轉入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，命名為PS，隨后將pGB286轉化進入菌株PS中，獲得菌株N1，隨后分別挑取單克隆至10mL的LB培養(yǎng)基中(同時含有100μg/mL氨芐青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)，隨后按1％接種量接種到新鮮的同一培養(yǎng)基中37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時，降溫至16℃并加入終濃度為0.1mM的IPTG進行誘導表達，誘導表達18h后升溫至28℃發(fā)酵72h，隨后對其進行發(fā)酵及產(chǎn)物萃取，收集菌體及發(fā)酵液用等體積的正己烷萃取2次，減壓蒸餾后甲醇復溶(加入甲醇前先加入少量DMSO助溶)，用于產(chǎn)物純化。

結果顯示，含有TPF09930的突變株E.coli N1能夠以FPP為底物合成保留時間為11.11min的具有木質清香的化合物橙花叔醇(圖6)。

【實施例4】化合物鑒定

1H NMR和13C NMR結果顯示(圖7)GC-MS保留時間為11.11min的化合物為無色油狀物反式橙花叔醇(trans-nerolidol)。¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ5.91(dd,J＝17.3,10.8Hz,1H),5.21(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),5.13(t,J＝5.8Hz,1H),5.10–5.05(m,1H),5.06(dd,J＝10.8,1.3Hz,1H),2.11–2.00(m,4H),1.99–1.95(m,2H),1.67(s,3H),1.59(s,6H),1.58(m,2H),1.27(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,cdcl3)δ145.02,135.60,131.46,124.20,124.17,111.66,73.52,42.01,39.69,27.90,26.62,25.70,22.71,17.69,16.01。橙花叔醇[M-OH]⁺的理論分子量為205.1951，高分辨質譜檢測結果顯示其實際分子量為205.1939。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學

<120> 一種生產(chǎn)橙花叔醇的萜類合酶及其應用

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> 交鏈格孢

<400> 1

Met Arg Tyr Gln Tyr Ser Glu Arg Val Glu Ser His Arg Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Ala Asn Asn Ile His Leu Arg Ile His Lys Asp Ser Tyr

20 25 30

Lys Glu Val Ile Gly Thr Leu Arg Ala Gln Asn Asp Trp Ser Arg Leu

35 40 45

Val Ser Ser Met Thr Lys Tyr His Gly Gly Leu Gly Asp Leu Phe Ser

50 55 60

Phe Ile Ser Val Thr Ile Pro Glu Cys Leu Pro Glu Arg Leu Glu Val

65 70 75 80

Val Ala Tyr Ala Asn Glu Tyr Ala Phe Leu Tyr Asp Asp Gln Met Glu

85 90 95

Arg Leu Asp Leu Lys Asp Phe Arg Glu Gly Arg Asp Asp Met Leu Asp

100 105 110

Ile Phe Gly Ile His Gly Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Arg Arg Pro

115 120 125

Glu Lys Thr Leu Gln Leu Gln Ile Phe Asp Glu Leu Met Ala Ile Asp

130 135 140

Gln Asp Arg Ala Ile Val Thr Met Gln Ala Trp Ala Lys Phe Ile Asp

145 150 155 160

Leu Ala Ser Arg Thr Arg Val Glu Pro Phe Asn Thr Leu Ala Ala Tyr

165 170 175

Leu Pro Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly Glu Leu Phe Trp Phe Gly Met

180 185 190

Leu Thr Phe Ala Met Ala Leu Thr Ile Pro Ala His Glu Leu Asp Val

195 200 205

Cys Met Arg Leu Ala Arg Pro Gly Tyr Glu Ala Ile Ser Leu Ile Asn

210 215 220

Asp Ile Tyr Ser Trp Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Glu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Gln Asp Tyr Val Phe Asn Ala Val Trp Val Val Met Lys Glu Arg Lys

245 250 255

Cys Asp Glu Gln Lys Ala Thr Glu Phe Cys Lys Asn Leu Ala Arg Gln

260 265 270

Ser Ile Gln Asp Phe Ser Thr Ser Val Asn Thr Pro Gln Val Thr Glu

275 280 285

Leu Ser Cys Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Gly Ala Val Arg Leu Ser Tyr

290 295 300

Val Gly Asn Leu Val Trp Ser Ile Tyr Cys Pro Arg Tyr Asn Ile Ala

305 310 315 320

Val Pro Val Tyr His Ser Lys Leu

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 交鏈格孢

<400> 2

atgcgttacc agtatagcga gcgtgtggaa agccaccgtt atcgtgacga tggtctggcg 60

aacaacattc acctgcgtat ccacaaggat agctacaaag aagtgattgg caccctgcgt 120

gcgcaaaacg actggagccg tctggttagc agcatgacca agtatcacgg tggcctgggc 180

gacctgttca gctttattag cgttaccatc ccggaatgcc tgccggagcg tctggaagtg 240

gttgcgtacg cgaacgagta tgcgttcctg tacgacgatc agatggaacg tctggacctg 300

aaagatttcc gtgagggtcg tgacgatatg ctggacatct ttggcattca cggtggcgcg 360

agcaacctgg aggatcgtcg tccggaaaag accctgcagc tgcaaatttt tgacgagctg 420

atggcgattg accaggatcg tgcgatcgtg accatgcaag cgtgggcgaa attcatcgat 480

ctggcgagcc gtacccgtgt tgaaccgttt aacaccctgg cggcgtatct gccgagccgt 540

accattgacg cgggcgagct gttctggttt ggcatgctga ccttcgcgat ggcgctgacc 600

atcccggcgc acgaactgga tgtgtgcatg cgtctggcgc gtccgggtta tgaggcgatc 660

agcctgatta acgacatcta cagctggccg aaggaacgtg cggaggcgga aaaagcgggc 720

caggattacg tgtttaacgc ggtttgggtg gttatgaagg agcgtaaatg cgacgaacaa 780

aaggcgaccg agttctgcaa aaacctggcg cgtcagagca tccaagattt tagcaccagc 840

gtgaacaccc cgcaagttac cgagctgagc tgcgacagcc gtacctatct gggtgcggtt 900

cgtctgagct acgtgggcaa cctggtttgg agcatttatt gcccgcgtta caacatcgcg 960

gtgccggttt accacagcaa gctg 984

<210> 3

<211> 4515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta 60

gaactagtgg atccttagga tttaatgcag gtgacggacc catctttcaa acgatttata 120

tcagtggcgt ccaaattgtt aggttttgtt ggttcagcag gtttcctgtt gtgggtcata 180

tgactttgaa ccaaatggcc ggctgctagg gcagcacata aggataattc acctgccaag 240

acggcacagg caactattct tgctaattga cgtgcgttgg taccaggagc ggtagcatgc 300

gggcctctta cacctaataa gtccaacatg gcaccttgtg gttctagaac agtaccacca 360

ccgatggtac ctacttcgat ggatggcatg gatacggaaa ttctcaaatc accgtccact 420

tctttcatca atgttataca gttggaactt tcaacatttt gtgcaggatc ttgtcctaat 480

gccaagaaaa cagctgtcac taaattagct gcatgtgcgt taaatccacc aacagaccca 540

gccattgcag atccaaccaa attcttagca atgttcaact caaccaatgc ggaaacatca 600

ctttttaaca cttttctgac aacatcacca ggaatagtag cttctgcgac gacactctta 660

ccacgacctt cgatccagtt gatggcagct ggtttttttg tcggtacagt agttaccaga 720

aacggagaca acctccatat cttcccagcc atactcttct accatttgct ttaatgagta 780

ttcgacacct ttagaaatca tattcatacc cattgcgtca ccagtagttg ttctaaatct 840

catgaagagt aaatctcctg ctagacaagt ttgaatatgt tgcagacgtg caaatcttga 900

tgtagagtta aaagcttttt taattgcgtt ttgtccctct tctgagtcta accatatctt 960

acaggcacca gatcttttca aagttgggaa acggactact gggcctcttg tcataccatc 1020

cttagttaaa acagttgttg caccaccgcc agcattgatt gccttacagc cacgcatggc 1080

agaagctacc aaacaaccct ctgtagttgc cattggtata tgataagatg taccatcgat 1140

aaccaagggg cctataacac caacgggcaa aggcatgtaa cctataacat tttcacaaca 1200

agcgccaaat acgcggtcgt agtcataatt tttatatggt aaacgatcag atgctaatac 1260

aggagcttct gccaaaattg aaagagcctt cctacgtacc gcaaccgctc tcgtagtatc 1320

acctaatttt ttctccaaag cgtacaaagg taacttaccg tgaataacca aggcagcgac 1380

ctctttgttc ttcaattgtt ttgtatttcc actacttaat aatgcttcta attcttctaa 1440

aggacgtatt ttcttatcca agctttcaat atcgcgggaa tcatcttcct cactagatga 1500

tgaaggtcct gatgagctcg attgcgcaga tgataaactt ttgactttcg atccagaaat 1560

gactgtttta ttggttaaaa cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat 1620

gctagccata tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct 1680

gctgcccata gtgtaatcct ccttattttt taacatcgta agatcttcta aatttgtcat 1740

cgatgttggt caagtagtaa acaccacttt gcaaatgctc aatggaacct tgaggtttga 1800

agttcttctt caaatgggca ttttctctca attcgatggc agcttcgtaa tcctttggag 1860

tttcggtgat tctcttggct aatttgttag taatatctaa ttccttgata atatgttgga 1920

cgtcaccaac aattttgcaa gaatatagag atgcagctaa accggaaccg taagaaaata 1980

aaccaacacg cttgccttgt aagtcgtcag atccaacata gtttaataga gatgcaaagg 2040

cggcataaac agatgcggtg tacatgttac ctgtgtttgt tggaacaatc aaagattggg 2100

caactctctc tttgtggaat ggcttagcaa cattaacaaa agttttttca atgttcttat 2160

cggttaaaga ttcgtcataa tcgcgagtag ctaattcggc gtcaacttct gggaacaatt 2220

gaggattggc tctgaaatcg ttatatagta atctaccgta tgattttgtg accaatttac 2280

aggttggaac atggaaaacg ttgtagtcga aatatttcaa aacgttcaaa gcatccgaac 2340

cagcgggatc gctaaccaac cctttagaaa tagccttctt ggaataactc ttgtaaactt 2400

gatcaagagc cttgacgtaa caagttaatg aaaaatgacc atcgacgtaa ggatattcgc 2460

tggtgaaatc tggcttgtaa aaatcgtagg cgtgttccat gtaagaagct cttacagagt 2520

caaatacaat tggagcatca ggaccgatcc acatagcaac agtaccggca ccaccggttg 2580

gtcttgcggc acccttatcg tagatggcaa tatcaccgca aactacaatg gcgtctctac 2640

catcccatgc gttagattca atccagttca aagagttgaa caacgcgttg gtaccaccgt 2700

aacaggcatt aagcgtgtca ataccttcga cgtcagtgtt ttcaccaaac aattgcatca 2760

agacagactt gacagacttg gacttgtcaa tcagagtttc agtaccgact tctaatctac 2820

caattttgtt ggtgtcgatg ttgtaactct tgatcaactt agacaaaaca gttagggaca 2880

tcgagtagat atcttctctg tcattgacaa aagacatgtt ggtttggccc agaccaattg 2940

tgtatttacc ttgagaaacg ccatcaaatt tctctagctc agattggttg acacattgag 3000

ttgggatgta aatttggata cctttaatac cgacattttg aggtctggtt ttttgttcag 3060

cggtcttttg tttttttagt tcagtcattt gcaagtttgt attgtgtaat tgttgttgct 3120

tttgcggcct aagtcttcct ttaataccac accaacaaag tttagttgag agtttcattt 3180

agctgtcctc cttaattcaa ccgttcaatc accatcgcaa ttccctgacc gccgccaatg 3240

cacagtgttg ccagccccag cgttttatcg cgtgcctgca tggcatgtaa tagtgtgacc 3300

agaatacgag caccactggc accgatagga tgcccgagcg cgatggcccc gccgttgaca 3360

ttcactttct cagaatcaaa gcccaggttt ttcccaacgg caaggaactg tgcagcaaat 3420

gcttcattag cctcaatgag atcaatatcc gccagttgca gccccgccag ttgtaacgct 3480

ttttgcgtgg caggtactgg ccccataccc atcaatgcgg ggggcacgcc accgctggca 3540

taacttttaa tgcgagccag gggggtaagg cctgctgcca gcgccgcaga ttcttccata 3600

atcaccagag cggcagcacc gtcgttaata ccagacgcgt tcccagcggt gactgttcct 3660

gctttatcga aggccgggcg caatgcacct aacgcttcag ccgttgaatt cgctttcggg 3720

aattcgtctt gactgaagac gaaggttttc tttcgagtga caacatttac cgggacgatt 3780

tcggctgtaa aagcaccgga ctcaattgcg gctgccgctt tacgctgtga atgtagcgcc 3840

agttcatcct gcatttcacg ggtaattccg tactctttag ccacgttttc ggcggtaatc 3900

cccatatgat aaccatgggt ggcgcacatc aggccatcgc gcaggattac gtcataaacc 3960

tgtccgtctc caagacgata accagagcgt gcttttgcat cgagtaagta gggggctaaa 4020

ctcatatttt ccataccccc cgccacaatg ctctgcgcct gacctgcctg aatggcctgg 4080

gcggcaagcg ccacactttt aagacccgaa ccacatactt tattgaccgt gaatccgcac 4140

accgtttctg ccagcccgct ttttaacagt gcctgacgcg ccggattttg ccccagcccg 4200

gcttgtaaca cgttacccat aatcacttca tcaacgtgtt gtgaatcgat ttttgcacgt 4260

tcaatggcgg ctttaattac tgtcgccccc aggtcgatgg cgctggtgga agcgagtgaa 4320

ccgttaaaac taccgatagc agtacgtacc gcactgacga tgacacaatt tttcatttta 4380

tattcctcct agtcgactct agaggatccc cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat 4440

cgataccgtc gacctcgagg gggggcccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt 4500

taattgcgcg ctggg 4515

<210> 4

<211> 4667

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct tatttaagct gggtaaatgc 60

agataatcgt tttctggctt cgcgatttgt cgcctgcatc accatccacg gactgaacgc 120

ccacggcgtg gcatcaatac cgtgtaatac atctgctaaa tcacaccatt gataatccat 180

cacttcatca tcattgatct gtaacgcact agtggtgcgt gcggcaaata ccggacacac 240

ttcattttcc acaatgccac tcggatcggt ggcgcggtag cgaaagtcag gatagataga 300

ttcaggaggc gtaatttcca cgccaagctc ataacggcaa cggcggatca ctgcgtcttc 360

gttgctttct cccagttgtg ggtgcccaca aaccgagtta gtccacacgc caggccatgc 420

ttttttgctc agtgcgcggc gggtaactaa taattgtcct ttggcattaa acagccaact 480

ggagaacgcg agatgtaagc gggtgtctgc cgtgtgtgcg gcatactttt ccagcgtacc 540

cgtgggaact ccctgtgcat tcaataaaat gacgtgttcc gtttgcatat ggctgccgcg 600

cggcaccagg ccgctgctgt gatgatgatg atgatggctg ctgcccatat agtaatcctc 660

ctcccgggct gcagttattc ctttggtaga ccagtctttg cgtcaatcaa agattcgttt 720

gtttcttgtg ggcctgaacc gacttgagtt aaaatcactc tggcaacatc cttttgcaac 780

tcaagatcca attcacgtgc agtaaagtta gatgattcaa attgatggtt gaaagcctca 840

agctgctcag tagtaaattt cttgtcccat ccaggaacag agccaaacaa tttatagata 900

aatgcaaaga gtttcgactc attttcagct aagtagtaca acacagcatt tggacctgca 960

tcaaacgtgt atgcaacgat tgtttctccg taaaactgat taatggtgtg gcaccaactg 1020

atgatacgct tggaagtgtc attcatgtag aatattggag ggaaagagtc caaacatgtg 1080

gcatggaaag agttggaatc catcattgtt tcctttgcaa aggtggcgaa atctttttca 1140

acaatggctt tacgcatgac ttcaaatctc tttggtacga catgttcaat tctttcttta 1200

aatagttcgg aggttgccac ggtcaattgc ataccctgag tggaactcac atccttttta 1260

atatcgctga caactaggac acaagctttc atctgaggcc agtcagagct gtctgcgatt 1320

tgtactgcca tggaatcatg accatcttca gcttttccca tttcccaggc cacgtatccg 1380

ccaaacaacg atctacaagc tgaaccagac ccctttcttg ctattctaga tatttctgaa 1440

gttgactgtg gtaattggta taacttagca attgcagaga ccaatgcagc aaagccagca 1500

gcggaggaag ctaaaccagc tgctgtagga aagttatttt cggagacaat gtggagtttc 1560

cattgagata atgtgggcaa tgaggcgtcc ttcgattcca tttcctttct taattggcgt 1620

aggtcgcgca gacaattttg agttctttca ttgtcgatgc tgtgtggttc tccatttaac 1680

cacaaagtgt cgcgttcaaa ctcaggtgca gtagccgcag aggtcaacgt tctgaggtca 1740

tcttgcgata aagtcactga tatggacgaa ttggtgggca gattcaactt cgtgtccctt 1800

ttcccccaat acttaagggt tgcgatgttg acgggtgcgg taacggatgc tgtgtaaacg 1860

gtcatgagta ttacctccta tttatcaaga taagtttccg gatctttttc tttcctaaca 1920

ccccagtcag cctgagttac atccagccat tgaaccttag aaaatctttt gtcattagcg 1980

gtttgagccc taagatcaac atcttgctta gtaatcactg caatggcgtc ataaccacca 2040

gcaccaggta ttaagcaagt aagaactcct tttaaggtct ggcaatcatc caataagcta 2100

gtttgtacgg gaggttcgat atcggcacca gattctttag ttatttttct aaaggaacgt 2160

ctaattgtgg caactgcatc tctaacttct gtgatttcag gatacttttg acaggtacag 2220

tcattcctct caagagactc aaatatctga tcgctgtaat cgtcatgagt ctcgtgtaag 2280

cgatctagtt tagatagtcc atccataaat ctagaatttg catgatcgag ttctgtatat 2340

attttcaagc tttctggcat atgcgaatca taccaatttt ttaccttctg gaccagtttt 2400

actgtttctg aaccattctt aatatcgccc atccataaag ttaatcccga aggtaaatgg 2460

ttacttttaa tcgtaatatt ccagtcttct tcatcaacca aatgcgccag tttactgccg 2520

taagtagcac ttccaatatc tggcaaatta gagattaatg cgggtgggaa tcttctatat 2580

ctgatagatc catatgctgc cgccgctaca tcaaacccgc ttccaatttt accctgagct 2640

tgacaatgag caacttgtgc taaattatga ataacttctc tatatttgtc tacattattt 2700

tccaggtccg atacaaaaaa ggaggccaaa gctgtagtta aaactgtgac taaacctgcc 2760

gaggagccca gccctgtttt gggaacttct tcaattctgt gcgaatgaaa actcaatctt 2820

ctgttgccac gatgttcggt aacgctatcc tcctgagaat ggtaggcatc atcagagaaa 2880

atatcaataa cgaacaagtt tctattgcag tagtcgtcca tgttaggttt aaagtagcta 2940

aatacgttag cgataacttt ttcaatgaaa gggttcttag atccgcctat cgaaacagga 3000

atgaagccac ttttaggact tatatggtac agccactccc catctttaaa ttgtttactt 3060

ttcacacgca cttcaaactt atcagaccct tgcaatgaac cgtaaggatg ggctacagca 3120

tgcattcttg ccgataatcc gactacaaat gcttcatatt ttgtatctaa aactaaatat 3180

ccaccagcta gtaacgcttt ccctggggca ctgaaggctc tcaactctga catttgatct 3240

gcctcctatg aagtccatgg taaattcgtg tttcctggca ataatagatc gtcaatttgt 3300

tgctttgtgg tagttttatt ttcaaataat tggaatacta gggatttgat tttaggatct 3360

ttattcaaat tttttgcgct taacaaacag cagccagtcc cacccaagtc tgtttcaaat 3420

gtctcgtaac taaaatcatc ttgcaatttc tttttgaaac tgtcaatttg ctcttgagta 3480

atgtctcttc gtaacaaagt caaagagcaa ccgccgccac cagcaccggt aagttttgtg 3540

gagccaattc tcaaatcatc gctcagattt ttaataagtt ctaatccagg atgagaaaca 3600

ccgattgaga caagcagtcc atgatttatt cttatcaatt ccaatagttg ttcatacagt 3660

tcattattag tttctacggc ctcgtcatcg gtgcctttac atttacttaa ctttgtcatg 3720

atctctaagc cttgtagggc acattcaccc atggcatcta gaattggctt cataacttca 3780

ggaaatttct cggtgaccaa cacacgaacg cgagcaacaa gatcttttgt agaccttgga 3840

attctagtat aggttaggat cattggaatg gctgggaaat catctaagaa cttaaaattg 3900

tttgtattta ttgttccatt atgtgagtct ttttcaaata gcagggcatt accataagtg 3960

gccacagcgt tatctattcc tgaaggggta ccgtgaatac acttttcacc tatgaaggcc 4020

cattgattca ctatatgctt atcgttttct gacagctttt ccaagtcatt agatcctatt 4080

aaccccccca agtaggccat agctaaggcc agtgatacag aaatagaggc gcttgagccc 4140

aacccagcac cgatgggtaa agtagacttt aaagaaaact taatattctt ggcatggggg 4200

cataggcaaa caaacatata caggaaacaa aacgctgcat ggtagtggaa ggattcggat 4260

agttgagcta acaacggatc caaaagacta acgagttcct gagacaagcc atcggtggct 4320

tgttgagcct tggccaattt ttgggagttt acttgatcct cggtgatggc attgaaatca 4380

ttgatggacc acttatgatt aaagctaatg tccgggaagt ccaattcaat agtatctggt 4440

gcagatgact cgcttattag caggtaggtt ctcaacgcag acacactagc agcgacggca 4500

ggcttgttgt acacagcaga gtgttcacca aaaataataa cctttcccgg tgcagaagtt 4560

aagaacggta atgacatggt taattcctcc tactgcagga attcgatatc aagcttatcg 4620

ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccc 4667

<210> 5

<211> 2914

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctagtt attgctcagc 60

ggtggcagca gccaactcag cttcctttcg ggctttgtta gcagccggat ctcagtggtg 120

gtggtggtgg tgctcgagtg cggccgcaag cttgtcgacg gagctcgaat tcttatttaa 180

gctgggtaaa tgcagataat cgttttctgg cttcgcgatt tgtcgcctgc atcaccatcc 240

acggactgaa cgcccacggc gtggcatcaa taccgtgtaa tacatctgct aaatcacacc 300

attgataatc catcacttca tcatcattga tctgtaacgc actagtggtg cgtgcggcaa 360

ataccggaca cacttcattt tccacaatgc cactcggatc ggtggcgcgg tagcgaaagt 420

caggatagat agattcagga ggcgtaattt ccacgccaag ctcataacgg caacggcgga 480

tcactgcgtc ttcgttgctt tctcccagtt gtgggtgccc acaaaccgag ttagtccaca 540

cgccaggcca tgcttttttg ctcagtgcgc ggcgggtaac taataattgt cctttggcat 600

taaacagcca actggagaac gcgagatgta agcgggtgtc tgccgtgtgt gcggcatact 660

tttccagcgt acccgtggga actccctgtg cattcaataa aatgacgtgt tccgtttgca 720

tatggctgcc gcgcggcacc aggccgctgc tgtgatgatg atgatgatgg ctgctgccca 780

tggtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gttatttatt acgctggatg 840

atgtagtccg ctagcgcttc cagtgccgag gtatcgagtg actgttcagc cagttgtttc 900

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agaagtgcag ggtaggtact tttaccaagt tgctggtcgg caccctggcg ttttcccaac 1020

gttgcagtat ctcccaccac atccaggatg tcatcctgaa cctggaaggc aaggccgatg 1080

ctctctgcat acttgtcgag taccggcaga gcacgacgtc ctttatctcc ggcgcttaat 1140

gcaccaaggc gaacggcggc gcgaatcaat gcgccggttt tatgacgatg aatacgctca 1200

agcgcgtcca gaggtacgtg tttgccttcc gcgtctaaat ctaatgcctg accaccgcac 1260

attccggcaa taccactggc gctcgccagt tcagaaatca tcgaaattct gtcgcggtcc 1320

gacacttccg gcatatcggc atcgcttaaa atcgagaacg ccagcgtttg taaagcgtcg 1380

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agatcgtcat catccattgc cggtaaatca tcatgaatta atgagtaagc gtggatacac 1500

tcaacggcgg cagcgggtgc gtccagcgtg tttgtgctaa cgccgaacat atgaccggtg 1560

gcataaacca ggaaaggtcg caggcgctta ccacctaata atgcgccata ctgcatggtt 1620

tcgaccacgg gagtgttctg aaagggcagt ggggcgataa aacggctcag cgcctggttg 1680

gcctgcttaa cgcaggcttc gagttgctgc ggaaagtcca tggatccgcg acccatttgc 1740

tgtccaccag tcatgctagc catatggctg ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga 1800

tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 1860

tagttacgcg atgttgtaac gcgggcaata aatgctccaa accaggttgc ccacgtagct 1920

cagacgaacc gcacccagat aggtacggct gtcgcagctc agctcggtaa cttgcggggt 1980

gttcacgctg gtgctaaaat cttggatgct ctgacgcgcc aggtttttgc agaactcggt 2040

cgccttttgt tcgtcgcatt tacgctcctt cataaccacc caaaccgcgt taaacacgta 2100

atcctggccc gctttttccg cctccgcacg ttccttcggc cagctgtaga tgtcgttaat 2160

caggctgatc gcctcataac ccggacgcgc cagacgcatg cacacatcca gttcgtgcgc 2220

cgggatggtc agcgccatcg cgaaggtcag catgccaaac cagaacagct cgcccgcgtc 2280

aatggtacgg ctcggcagat acgccgccag ggtgttaaac ggttcaacac gggtacggct 2340

cgccagatcg atgaatttcg cccacgcttg catggtcacg atcgcacgat cctggtcaat 2400

cgccatcagc tcgtcaaaaa tttgcagctg cagggtcttt tccggacgac gatcctccag 2460

gttgctcgcg ccaccgtgaa tgccaaagat gtccagcata tcgtcacgac cctcacggaa 2520

atctttcagg tccagacgtt ccatctgatc gtcgtacagg aacgcatact cgttcgcgta 2580

cgcaaccact tccagacgct ccggcaggca ttccgggatg gtaacgctaa taaagctgaa 2640

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tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt atta 2914

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catcttatta atcagataaa atatttctcg agctccggca aaaagtggcc cc 52

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcttccag gaaatctccg ccccgctcga gaaacccacg gcggcaatgc 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggccactt tttgccggag ctcgagaaat attttatctg attaataaga tg 52

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaagga tccactagtt ctaga 55

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttttatattc ctcctagtcg actctagagg atccccgggc tgcaggaatt cgatatcaa 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccggggatc ctctagagtc gactaggagg aatataaaat gaaaaattgt gtcatcgtc 59

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttgagagtt tcatttagct gtcctcctta attcaaccgt tcaatcacc 49

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acggttgaat taaggaggac agctaaatga aactctcaac taaact 46

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tggctgctgc ccatagtgta atcctcctta ttttttaaca tcgtaagat 49

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgttaaaaa ataaggagga ttacactatg ggcagcagcc atcatca 47

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttaggattta atgcaggtga cgg 23

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct taaataagag ctccaattcg ccctatagt 59

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttaagaacgg taatgacatg gttaattcct cctactgcag gaattcgata tcaag 55

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctgcagtagg aggaattaac catgtcatta ccgttcttaa ct 42

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctcaactctg acatttgatc tgcctcctat gaagtccatg gtaa 44

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttaccatgga cttcatagga ggcagatcaa atgtcagagt tgagagcctt c 51

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatgctgtgt aaacggtcat gagtattacc tcctatttat caagataagt ttc 53

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atcttgataa ataggaggta atactcatga ccgtttacac agcatccgtt 50

<210> 25

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgcccatata gtaatcctcc tcccgggctg cagttattcc tttggtagac cagtc 55

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ggaataactg cagcccggga ggaggattac tatatgggca gcagccatca t 51

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ttatttaagc tgggtaaatg caga 24

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

atatggatcc atggactttc cgcagcaact c 31

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atatgaattc actagtttat ttattacgct ggatgatg 38

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atcgcatatg caaacggaac acgtcatttt attg 34

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atatctcgag actagttatt taagctgggt aaatgc 36

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcatcatatg cgttaccagt atagcgag 28

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atatctcgag actagtttac gcgatgttgt aacgcgggc 39

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atatgaattc ttacgcgatg ttgtaacgcg ggcaa 35