本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于合成阿莫西林的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法。
背景技術(shù)：
：青霉素?；甘侵苽洇?內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵酶，工業(yè)生產(chǎn)中已成功將該酶應(yīng)用于合成阿莫西林，多采用固定化酶形式。為制備出滿足生產(chǎn)要求的固定化酶，首先將青霉素酰化酶從發(fā)酵液中分離純化出來，然后進(jìn)行酶的固定化。青霉素酰化酶的表達(dá)載體主要包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和畢赤酵母等。盡管表達(dá)載體不一樣，但從發(fā)酵液中分離純化青霉素酰化酶都面臨一些共性問題：(1)去除發(fā)酵液中未消耗的培養(yǎng)基成分；(2)青霉素酰化酶內(nèi)源表達(dá)，需要對菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎將酶釋放出來；(3)去除細(xì)胞破碎后料液中的油脂、多糖、色素、氨基酸和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)；(4)去除細(xì)胞破碎后料液中的雜蛋白，提高青霉素?；傅募兌?。為制備得到高純度的青霉素?；感枰M(jìn)行固液分離、濃縮、除雜和分離純化等多步操作。作為工業(yè)酶，受成本所限無法采用層析技術(shù)等精細(xì)的分離技術(shù)，通常采用板框過濾、離心、硫酸銨沉淀、等電點(diǎn)沉淀和超濾等分離手段，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組合形成相應(yīng)的工藝。將本領(lǐng)域已知的青霉素?；阜蛛x純化與固定化工藝總結(jié)如下：(1)發(fā)酵液預(yù)處理：首先用高壓勻漿或珠磨等機(jī)械法、有機(jī)溶劑或表面活性劑等化學(xué)法、溶菌酶等生物法對菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后加入絮凝劑、助濾劑等，用離心或板框過濾進(jìn)行固液分離得到不含菌體的粗酶液；(2)青霉素?；傅某醴蛛x：首先用酸或堿調(diào)至等電點(diǎn)沉淀的方法將部分雜蛋白去除，然后用離心或板框過濾得到青霉素酰化酶粗酶液，最后用膜過濾將青霉素?；复置敢簼饪s到合適濃度；(3)青霉素?；傅木蛛x：首先對青霉素?；复置敢哼M(jìn)行硫酸銨鹽析，離心或板框過濾得到沉淀；然后用緩沖鹽溶液溶解沉淀，離心或板框過濾去除不溶性固體；最后用膜過濾去除小分子雜蛋白、氨基酸、無機(jī)鹽等雜質(zhì)；(4)青霉素?；傅墓潭ɑ菏紫认蚓蛛x得到的青霉素酰化酶液中補(bǔ)加緩沖鹽至合適濃度，離心或板框過濾去除固體雜質(zhì)，然后加入環(huán)氧基載體或活化的氨基載體進(jìn)行固定化。上述工藝存在的主要問題如下：(1)工藝步驟過于繁瑣，操作時間長，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低；(2)步驟多加上部分酶會因操作時間長而損失，導(dǎo)致酶的總收率低；(3)主要除雜方法為絮凝沉淀、硫酸銨沉淀、超濾和板框過濾(或離心)，分離手段比較傳統(tǒng)，除雜效果不顯著；(4)未從過程集成角度考慮固液分離、濃縮、除雜等分離純化以及固定化操作之間的相互聯(lián)系，導(dǎo)致步驟過多。因此，提供一種能夠有效簡化操作步驟、縮短操作時間，并能夠有效提高酶分離純化的總收率的新的青霉素?；傅姆蛛x純化方法是十分必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供一種用于合成阿莫西林的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法。本發(fā)明的方法操作簡便、所得青霉素?；傅幕钚院褪章瘦^高。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用有機(jī)溶劑-無機(jī)鹽的體系，通過嚴(yán)格控制無機(jī)鹽的濃度，可以形成三相分配體系，并能夠?qū)⑶嗝顾仵；父患较孪嗳芤褐?如果進(jìn)入上相溶液中，一方面容易使酶失活，另一方面無法直接進(jìn)行固定化；如果富集到中相(固體相)，無法直接進(jìn)行固定化，需要額外增加操作步驟)；從而，可以在該下相溶液中直接進(jìn)行酶的固定化；由此，本發(fā)明的方法可以將傳統(tǒng)方法的各個步驟在一個單元操作完成，極大地簡化了工藝，從而成為一種極具前景的過程集成技術(shù)。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，相比現(xiàn)有技術(shù)使用的其他種類的醇，叔丁醇能夠最大限度地保持青霉素?；傅幕钚?。本發(fā)明提供了一種用于合成阿莫西林的青霉素酰化酶的分離純化與固定化耦合方法，其中，該方法包括以下步驟：(1)制備含有青霉素?；复置敢汉蜔o機(jī)鹽的無機(jī)鹽混合溶液，所述無機(jī)鹽混合溶液中無機(jī)鹽的濃度為0.05-0.3g/mL；(2)將步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇混合，然后進(jìn)行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素酰化酶的下相溶液組成的三相分配體系；(3)向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進(jìn)行青霉素?；傅墓潭ɑ１景l(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所存在的優(yōu)勢至少在于：(1)本發(fā)明的方法將青霉素?；傅姆蛛x純化涉及的固液分離、初分離和精分離中的多個操作單元在一個操作單元中完成，并將酶的分離純化與固定化耦合，大大簡化了操作步驟、縮短了操作時間、提高了酶提取的總收率；(2)本發(fā)明的方法省去了多步板框過濾或離心、1-2步膜過濾操作，減少了污水排放，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率；(3)本發(fā)明的方法分離純化青霉素?；傅目偸章曙@著高于現(xiàn)有技術(shù)；(4)本發(fā)明的方法制備得到的固定化酶的酶活顯著提高；(5)本發(fā)明所用的叔丁醇可回收后重復(fù)使用，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本；(6)本發(fā)明的方法的放大效應(yīng)小，很有工業(yè)化應(yīng)用前景。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。具體實(shí)施方式在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點(diǎn)值之間、各個范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。本發(fā)明提供了一種用于合成阿莫西林的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法，其中，該方法包括以下步驟：(1)制備含有青霉素?；复置敢汉蜔o機(jī)鹽的無機(jī)鹽混合溶液，所述無機(jī)鹽混合溶液中無機(jī)鹽的濃度為0.05-0.3g/mL；(2)將步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇混合，然后進(jìn)行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系；(3)向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進(jìn)行青霉素酰化酶的固定化。本發(fā)明進(jìn)行分離純化與固定化的對象為用于合成阿莫西林的青霉素酰化酶，該酶屬于青霉素?；傅囊环N，并且是特定地用于合成阿莫西林的青霉素?；福葱g(shù)語“用于合成阿莫西林的青霉素?；浮痹诒景l(fā)明中指的是這種特定的青霉素酰化酶。在本發(fā)明中為了描述方便，將“用于合成阿莫西林的青霉素酰化酶”簡稱為“青霉素?；浮保丛诒疚谋局兴觥扒嗝顾仵；浮本傅氖恰坝糜诤铣砂⒛髁值那嗝顾仵；浮?。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在步驟(1)中所得無機(jī)鹽混合溶液中無機(jī)鹽的濃度能夠顯著地影響到是否能夠在第(2)步中得到三相分配體系，一般來說，所述無機(jī)鹽混合溶液中所述無機(jī)鹽的濃度達(dá)到上述的0.05-0.3g/mL即可以使得在步驟(2)中得到三相分配體系，在優(yōu)選的情況下，所述無機(jī)鹽混合溶液中所述無機(jī)鹽的濃度為0.05-0.2g/mL，更優(yōu)選為0.1-0.2g/mL。在步驟(1)中，所述無機(jī)鹽混合溶液的pH為5-9，有利于維持青霉素?；傅拿富畈皇軗p失。為了能夠更好地形成三相分配體系并且使青霉素酰化酶盡可能地全部進(jìn)入下相溶液中，所述無機(jī)鹽混合溶液的pH優(yōu)選為6.5-9，最優(yōu)選為7.5-8.5。在步驟(1)中，所述無機(jī)鹽可以為水溶性磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和鹵化物中的一種或多種。其中，所述水溶性磷酸鹽例如為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸氫二納、磷酸二氫納、磷酸納；所述硫酸鹽例如為硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀；所述碳酸鹽例如為碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀；所述檸檬酸鹽例如為檸檬酸鈉、檸檬酸鉀；所述鹵化物例如為氯化鈉、氯化鉀，當(dāng)所述無機(jī)鹽為鹵化物時優(yōu)選與水溶性磷酸鹽配合使用。在步驟(1)中，在優(yōu)選的情況下，所述無機(jī)鹽為水溶性磷酸鹽和/或硫酸鹽，即優(yōu)選選自磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二納、磷酸二氫納、硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鉀中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽為水溶性磷酸鹽，即最優(yōu)選選自磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的一種或多種。在步驟(1)中，為了將所述無機(jī)鹽混合溶液的pH控制在上述范圍內(nèi)，可以通過將所述無機(jī)鹽進(jìn)行組合，并根據(jù)酸堿性逐步加入到混合溶液中。例如，根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選情況，當(dāng)所述無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的混合物時，為了將pH調(diào)節(jié)至7.5-8.5，可以先加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH至6-7，再加磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH至8-9，最后加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH至7.5-8.5。在步驟(1)中，術(shù)語“青霉素?；复置敢骸狈媳绢I(lǐng)域的常規(guī)定義。所述青霉素?；复置敢嚎梢酝ㄟ^使用表達(dá)載體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)然后經(jīng)預(yù)處理得到；青霉素酰化酶的表達(dá)載體可以是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或畢赤酵母；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可以采用本領(lǐng)域已知的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行。所述預(yù)處理的目的在于將發(fā)酵所得含有菌體的發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞破碎，或者將發(fā)酵所得含有菌體的發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)，以得到釋放出青霉素?；傅拇置敢骸＞唧w的預(yù)處理方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在此不再贅述。在預(yù)處理的過程中可能會用到磷酸鹽等無機(jī)鹽，這些無機(jī)鹽的用量很少，或者會在預(yù)處理的過程中發(fā)生反應(yīng)除去，因此并不會對步驟(1)中所述含鹽混合物的無機(jī)鹽濃度產(chǎn)生明顯影響。在步驟(1)中，所述青霉素?；复置敢嚎梢詾榻?jīng)細(xì)胞破碎后未處理的青霉素?；复置敢海部梢詾榻?jīng)細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)后的青霉素?；复置敢海凰鋈コw等固體雜質(zhì)的方法可以為板框過濾或離心。當(dāng)所述青霉素?；复置敢簽榻?jīng)細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)后的青霉素?；复置敢簳r，在配制無機(jī)鹽混合溶液時，會有少量沉淀生成，因此優(yōu)選地，對所得混合物進(jìn)行一次去除固體雜質(zhì)。在步驟(1)中，所述制備含有青霉素?；复置敢汉蜔o機(jī)鹽的無機(jī)鹽混合溶液的方法可以包括：將無機(jī)鹽溶解于所述青霉素?；复置敢褐小Ｔ诓襟E(1)中，所述粗酶液的酶活為5-50IU/mL，優(yōu)選為20-50IU/mL。在步驟(2)中，所述無機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇的體積比可以為1：0.2-2，優(yōu)選為1：0.2-1，更優(yōu)選為1：0.4-0.6。在步驟(2)中，所述叔丁醇可以為商購得到的叔丁醇液體，也可以以叔丁醇與水的混合液的形式與所述無機(jī)鹽混合溶液相混合。為了使本發(fā)明的方法更具有經(jīng)濟(jì)性，優(yōu)選地，該步驟(2)的過程還包括：從所述上相溶液中回收叔丁醇并循環(huán)用于與無機(jī)鹽混合溶液相混合的過程中。所述回收的方法例如為蒸餾法，所得的叔丁醇通常為叔丁醇與水的混合液，該所述叔丁醇和水的混合液中叔丁醇的含量可以為70-100重量％，優(yōu)選為80-100重量％，更優(yōu)選為85-95重量％。在步驟(2)中，所述混合的方式?jīng)]有特別的限定，例如為振蕩或攪拌。在步驟(2)中，所述分相的方式?jīng)]有特別的限定，例如為離心或靜置。在步驟(2)中，當(dāng)所述分相的方式為離心分相時，該分相溫度可以為0-40℃，優(yōu)選為4-37℃，更優(yōu)選為15-30℃；離心力可以為500-5000g，優(yōu)選為1000-4000g，更優(yōu)選為2000-3500g；時間可以為2-60min,優(yōu)先為2-40min，更優(yōu)選為5-20min。在步驟(2)中，當(dāng)所述分相的方式為靜置分相時，該分相溫度可以為4-30℃，優(yōu)選為10-25℃，更優(yōu)選為12-17℃；時間為0.1-4h，優(yōu)選為0.3-3h，更優(yōu)選為0.5-2h。通過本發(fā)明的方法能夠得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和酶的下相溶液組成的三相分配體系，在該三相分配體系中，青霉素?；副桓患M(jìn)入下相的無機(jī)鹽溶液中，酶的活性可以得到很好的保持，并且可以直接將下相溶液進(jìn)行酶的固定化，實(shí)現(xiàn)了集成化的操作，有效簡化了操作步驟、縮短了操作時間，從而降低了工業(yè)成本。所述上相溶液主要含有叔丁醇和水。在所述上相溶液和下相溶液之間會緊密地夾有一層固體層，即為所述中相固體，該中相固體主要包括雜質(zhì)蛋白、多糖以及可能存在的菌體碎片等。在步驟(3)中，所述下相溶液的酶活為5-20IU/mL，若酶活高于20IU/mL時用水稀釋至上述范圍。在步驟(3)中，所述載體的加入量可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的加入量，例如為總酶活與載體重量之比可以為30-60IU/g，優(yōu)選為40-50IU/g。在步驟(3)中，所述載體可以為本領(lǐng)域已知的各種商業(yè)化載體，如氨基載體、環(huán)氧基載體等。當(dāng)所述載體為環(huán)氧基載體時可以不進(jìn)行活化直接使用。當(dāng)所述載體為氨基載體時需要先進(jìn)行活化，氨基載體的活化方法按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式進(jìn)行即可，例如為：1)配制戊二醛磷酸鹽緩沖液：按2-7g/L稱取磷酸氫二鉀放入裝有一定體積純化水的燒杯中溶解，然后按30-50mL/L加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40-60％的戊二醛溶液，最后用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH至7.8-8.2，補(bǔ)加純化水定容至刻度使得戊二醛的終濃度為1-3％(w/v)；2)稱取一定量的氨基載體按照載體重量加入3-5倍體積(mL/g)的上述戊二醛磷酸鹽緩沖液進(jìn)行活化，溫度為20-30℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，活化時間為1.5-4h，活化結(jié)束后抽干溶液；3)按照載體重量加入3-5倍體積(mL/g)的純化水?dāng)嚢枨逑?-4次，每次攪拌15-40min，抽干溶液，收集活化好的載體備用。在步驟(3)中，所述酶的固定化的條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作條件，例如可以包括：溫度為10-40℃，優(yōu)選為20-30℃；pH為5-9，優(yōu)選為7-8.5；轉(zhuǎn)速為50-300rpm，優(yōu)選為100-200rpm；時間為4-48h，優(yōu)選為16-40h。本發(fā)明步驟(3)的固定化的方法還可以包括固定化酶后處理的過程，經(jīng)后處理可以得到可直接用于工業(yè)合成阿莫西林的固定化青霉素?；赋善罚龊筇幚淼姆椒梢詾楸绢I(lǐng)域常規(guī)的后處理方法，例如包括：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入2-6倍體積(mL/g)純化水清洗2-4次，抽干溶液，收集固定化酶放置2-6℃庫房中保存。本發(fā)明的方法制備得到的固定化青霉素?；笐?yīng)用于合成阿莫西林中的具體方法按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行即可，在此不再贅述。以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。首先，對以下實(shí)施例和對比例中所使用的物質(zhì)、試驗(yàn)方法和計算方法進(jìn)行如下介紹：1、酶的固定化所使用的載體酶的固定化所使用的載體為西安藍(lán)曉科技有限公司提供的氨基載體(LX-1000HA)。在使用之前提前對該載體進(jìn)行活化，活化方法如下：1)配制2％(w/v)戊二醛磷酸鹽緩沖液：按4.76g/L稱取磷酸氫二鉀放入裝有一定體積純化水的燒杯中溶解，然后按40mL/L加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的戊二醛溶液，最后用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH至約為8，補(bǔ)加純化水定容至刻度；2)稱取一定量的氨基載體按照載體重量加入4倍體積(mL/g)的2％(w/v)戊二醛磷酸鹽緩沖液進(jìn)行活化，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，活化時間為2h，活化結(jié)束后抽干溶液；3)按照載體重量加入4倍體積(mL/g)的純化水?dāng)嚢枨逑慈?，每次攪?0min，抽干溶液，收集活化好的載體備用。2、酶活的測定酶活測定采用堿滴定方法。酶活的定義為：在28℃、pH8.0條件下，單位的青霉素?；?min消耗1μmol青霉素G鉀鹽的酶活為一個單位(IU)。原理為：在28℃、pH8.0條件下，青霉素?；杆馇嗝顾谿鉀鹽生成等摩爾的6-APA和苯乙酸，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)定液精確滴定苯乙酸即可計算青霉素G鉀鹽的消耗量。具體步驟如下：1)緩沖液的配制：稱取4.76g磷酸氫二鉀和0.55g磷酸二氫鉀溶解于900mL蒸餾水中，用磷酸二氫鉀調(diào)pH至7.8，然后定容到1L。2)0.1mol/LNaOH溶液配制：先配制飽和NaOH溶液，待澄清后取上清液5mL加入到1000mL無二氧化碳的水中，搖勻。再使用鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定，計算其濃度。3)3mol/LNaOH溶液配制：快速用干凈的小燒杯稱取30gNaOH后，用純化水溶解后倒入250mL的容量瓶中，用純化水沖洗燒杯3次并倒入容量瓶中，定容搖勻后即為3mol/LNaOH溶液。4)底物的配制：稱取2g青霉素G鉀鹽，溶于40mL酶活緩沖液中，用3mol/LNaOH將pH調(diào)至8.0，現(xiàn)配現(xiàn)用。5)酶活測定：精確量取一定體積的液體酶或稱取一定質(zhì)量的固定化酶至提前預(yù)熱到28℃的40mL底物溶液中，保持溫度并快速攪拌，用0.1或3mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8.0開始計時，間斷滴加0.1mol/L的NaOH標(biāo)定液維持pH為8.0，反應(yīng)5min左右，記錄加NaOH滴定液量和反應(yīng)時間。6)液體酶活計算：酶活力＝v1*c*1000/t*v2。其中，酶活力單位為IU/mL；v1表示測定時間內(nèi)消耗的NaOH滴定液體積(mL)；c表示NaOH滴定液(0.1mol/L)濃度(mol/L)；1000表示毫摩爾和微摩爾的換算比例；t表示反應(yīng)時間(min)；v2表示液體酶體積(mL)。7)固定化酶活計算：酶活力＝v1*c*1000/t*w。其中，酶活力單位為IU/g；v1表示測定時間內(nèi)消耗的NaOH滴定液體積(mL)；c表示NaOH滴定液(0.1mol/L)濃度(mol/L)；1000表示毫摩爾和微摩爾的換算比例；t表示反應(yīng)時間(min)；w表示固定化酶重量(g)。3、青霉素?；副然畹挠嬎闱嗝顾仵；副然畹挠嬎愎綖椋罕然?IU/mg)＝酶活(IU/mL)/蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)，其中蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。4、酶收率的計算(1)每步處理青霉素酰化酶收率(Y，％)的計算公式為：Y＝c*v/(c0*v0)*100％，其中，c表示處理后料液中青霉素?；傅臐舛?IU/mL)；v表示處理后料液體積(mL)；c0表示處理前料液中青霉素?；傅臐舛?IU/mL)；v0表示處理前料液體積(mL)；(2)酶提取總收率(％)＝發(fā)酵液預(yù)處理步驟收率(％)×酶的分離純化步驟收率(％)。5、所得的固定化酶產(chǎn)品用于合成阿莫西林(1)合成方法稱取91.69g固定化酶放置到反應(yīng)器中，加入500mL純化水?dāng)嚢枨逑?，抽干溶液后加入提前預(yù)冷的純化水800mL；然后分別稱取86.5g6-氨基青霉烷酸(6-APA)和74.65g對羥基苯甘氨酸甲酯投入反應(yīng)器中，攪拌混合。反應(yīng)過程中控制溫度為9.5-10.5℃之間，反應(yīng)結(jié)束時間根據(jù)pH的變化進(jìn)行判斷(在反應(yīng)過程中pH值會不斷的上升，當(dāng)上升到最高點(diǎn)時應(yīng)時刻觀察，當(dāng)pH值穩(wěn)定下降0.01時即判定反應(yīng)結(jié)束)。(2)6-氨基青霉烷酸(6-APA)含量的測定(合成阿莫西林的化學(xué)方程式可以表示為6-氨基青霉烷酸+對羥基苯甘氨酸甲酯→阿莫西林+對羥基苯甘氨酸，本發(fā)明通過對6-APA殘留量的測定表征反應(yīng)的程度)6-APA用液相色譜法進(jìn)行檢測，具體如下：①流動相配制：稱取6.80g磷酸二氫鉀，加入1000mL純化水溶解，用1mol/l氫氧化鉀溶解調(diào)節(jié)pH值在5.8，再加入40mL乙腈充分混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，超聲脫氣20min；②對照品配置：稱取阿莫西林、對羥基苯甘氨酸、6-氨基青霉烷酸和對羥基苯甘氨酸甲酯各20mg加入到100mL潔凈干燥的容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻后經(jīng)0.45μm的濾膜過濾；③樣品處理：量取100μL反應(yīng)液用流動相稀釋至10mL，搖勻后經(jīng)0.45μm的濾膜過濾；④液相條件：柱子為C18(150mm*4.6mm)，進(jìn)樣量為20μL，流速為1mL/min，檢測波長為225nm。制備例(1)青霉素?；傅陌l(fā)酵培養(yǎng)使用重組表達(dá)的大腸菌菌株，采用現(xiàn)有文獻(xiàn)(陸健美，合成阿莫西林用青霉素?；冈诖竽c桿菌中的表達(dá)[D]，北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013)中所述的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵液中青霉素酰化酶的酶活為35.7IU/mL。(2)發(fā)酵液預(yù)處理：(i)發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液4500g離心20min，收集菌體；然后向菌體中按磷酸鹽緩沖液/菌體的體積質(zhì)量比為2.5mL/g加入0.1mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖液，900bar壓力下，高壓勻漿破碎細(xì)胞，時間為80min，勻漿二次，間隔取樣測定酶活至細(xì)胞破碎基本完全，得到酶活為32.2IU/mL的青霉素?；复置敢篒；(ii)細(xì)胞破碎結(jié)束后，將料液升溫至47℃，維持溫度為47℃處理60min，然后快速將溫度降至40℃以下；然后緩慢加入0.4g/mL氯化鈣溶液調(diào)節(jié)pH至5.1；最后將料液4500g離心20min，收集上清液，該上清液即為酶活為27.6IU/mL的青霉素?；复置敢篒I。分別按照以下實(shí)施例和對比例所述的方法對制備例所得的青霉素?；复置敢篒或II進(jìn)行酶的分離純化與固定化。實(shí)施例1(1)在14℃的條件下，按照濃度為0.15g/mL的用量將磷酸鹽(由K2HPO4.3H2O和KH2PO4組成)在90min內(nèi)溶解于制備例得到的青霉素?；复置敢篒I中并在加入的過程中調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0(先加KH2PO4調(diào)節(jié)pH至6.5，再加K2HPO4.3H2O調(diào)節(jié)pH至8.3，最后加入KH2PO4調(diào)節(jié)pH至8.0)，加鹽的同時攪拌使鹽充分溶解，攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm；然后4500g離心20min，收集上清液，得到無機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.6的體積比相混合，漩渦振蕩2min至充分混合，然后3500g離心10min，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為85重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至酶活為15IU/mL，再按總酶活與載體重量之比為45IU/g加入活化的氨基載體進(jìn)行酶的固定化，操作條件為：溫度為27℃，pH為8，轉(zhuǎn)速為150rpm，時間為30h；(5)固定化酶后處理：酶的固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(mL/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫房中保存。計算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。實(shí)施例2(1)在12℃的條件下，按照濃度為0.2g/mL的用量在90min內(nèi)將磷酸鹽(由K2HPO4.3H2O和KH2PO4組成)溶解于制備例得到的青霉素?；复置敢篒中并在加入的過程中調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5(先加KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7，再加K2HPO4.3H2O調(diào)節(jié)pH至9，最后加入KH2PO4調(diào)節(jié)pH至8.5)，加鹽的同時攪拌(攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm)使鹽充分溶解，得到無機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.4的體積比相混合，漩渦振蕩2min至充分混合，然后2000g離心20min，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和酶的下相溶液組成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為95重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至酶活為5IU/mL，再按酶/載體的比例為50IU/g加入活化的氨基載體進(jìn)行固定化，固定化的操作條件為：固定化溫度為20℃，pH為8.5，轉(zhuǎn)速為100rpm，時間為40h；(5)固定化酶后處理：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(mL/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫房中保存。計算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。實(shí)施例3(1)取制備例得到的青霉素?；复置敢篒I，加入罐體中，控制罐體溫度13℃，攪拌速度270rpm，然后在90min內(nèi)按照濃度為0.2g/mL的用量加入磷酸鹽并在加入過程中控制溶液的pH值約為7.8(先加KH2PO4調(diào)節(jié)pH至6.5，再加K2HPO4.3H2O調(diào)節(jié)pH至8.0，最后加入KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7.8)；然后加入少量硅藻土，板框過濾，收集濾液，即得到無機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.5的體積比相混合，350rpm攪拌30min充分混合，然后控制罐體溫度在15℃，停止攪拌，靜置分相1小時，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為88重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至酶活為20IU/mL，再按總酶活與載體重量之比為40IU/g加入活化的氨基載體進(jìn)行酶的固定化，操作條件為：溫度為30℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為200rpm，時間為40h；(5)固定化酶后處理：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(mL/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫房中保存。計算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。表1實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)809380分離純化收率(％)947995酶提取總收率(％)757476分離酶比活(IU/mg)5.34.25.4固定化酶活(IU/g)41.037.541.8固化酶水含量(％)515350實(shí)施例4和對比例1實(shí)施例4(包括實(shí)施例4-1～4-4)和對比例1(包括對比例1-1～1-2)用于說明不同的萃取體系對青霉素?；阜蛛x純化的影響。實(shí)施例4按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，將步驟(1)中的磷酸鹽替換為相同質(zhì)量的其他無機(jī)鹽，具體如表2所示。對比例1按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，將步驟(2)中的叔丁醇替換為相同質(zhì)量的其他有機(jī)溶劑，具體如表2所示。分別取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表2中。表2從表2可以看出，通過采用本發(fā)明的萃取體系可以使得萃取得到的酶的比活達(dá)到4.0IU/mg以上，收率達(dá)到83％以上，尤其當(dāng)采用實(shí)施例1的叔丁醇-磷酸鹽體系時萃取得到的酶的比活可以達(dá)到5.3IU/mg，收率可以達(dá)到94％。而當(dāng)對比例將叔丁醇替換為乙醇時，青霉素?；赴l(fā)生了失活，當(dāng)將叔丁醇替換為異丙醇時，青霉素?；傅氖章蕛H為5％。實(shí)施例5和對比例2實(shí)施例5(包括實(shí)施例5-1～5-3)和對比例2(包括對比例2-1～2-2)用于說明步驟(1)中無機(jī)鹽混合溶液中無機(jī)鹽濃度對青霉素酰化酶分離純化的影響。實(shí)施例5按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變磷酸鹽的重量使得磷酸鹽的濃度改變，但是保持溶液的pH值不變，具體如表3所示。對比例2按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變磷酸鹽的重量使得磷酸鹽的濃度改變，但是保持溶液的pH值不變，具體如表3所示。分別取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表3中。表3從表3可以看出，當(dāng)無機(jī)鹽的濃度在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時，萃取得到的酶的比活達(dá)到4.6IU/mg以上，收率可以達(dá)到91％以上。而當(dāng)無機(jī)鹽濃度過低(對比例2-1)時無法形成三相分配體系；當(dāng)無機(jī)鹽濃度過高(對比例2-2)時，大部分青霉素?；阜峙涞街邢?，下相萃取得到的酶的比活和收率均有顯著的下降。實(shí)施例6實(shí)施例6(包括實(shí)施例6-1～6-5)用于說明步驟(1)中無機(jī)鹽混合溶液的pH值對青霉素?；阜蛛x純化的影響。按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，在保持磷酸鹽重量不變的基礎(chǔ)上，改變磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的配比使所得無機(jī)鹽混合溶液的pH值達(dá)到如表4所示，在需要的情況下可以用磷酸或3mol/L的NaOH進(jìn)行微調(diào)。分別取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表4中。表4從表4可以看出，當(dāng)無機(jī)鹽混合溶液的pH值在本發(fā)明的較大范圍內(nèi)時，萃取得到的酶的比活可以達(dá)到5.2IU/mg以上，收率可以達(dá)到66％以上；在本發(fā)明最優(yōu)選范圍內(nèi)時萃取得到的酶的分離純化收率顯著提高到87％以上。實(shí)施例7實(shí)施例7(包括實(shí)施例7-1～7-5)用于說明步驟(2)中叔丁醇的用量對青霉素酰化酶分離純化的影響。按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變步驟(2)中步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液的體積比，具體如表5所示。分別取樣測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表5中。表5從表5可以看出，當(dāng)步驟(1)所得無機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液的體積比在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時，萃取得到的酶的比活達(dá)到5.1IU/mg以上，收率可以達(dá)到73％以上；當(dāng)在本發(fā)明的最優(yōu)選范圍內(nèi)時萃取得到的酶的比活達(dá)到5.3IU/mg以上，收率可以達(dá)到86％以上。實(shí)施例8實(shí)施例8(包括實(shí)施例8-1～8-2)用于說明步驟(2)中采用靜置分相時的靜置時間對青霉素?；阜蛛x純化的影響。按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行，所不同的是，在步驟(2)中靜置分相的不同時間點(diǎn)進(jìn)行取樣，測定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表6中，具體的時間點(diǎn)設(shè)置如表6所示。表6從表6可以看出，隨著靜置時間的增長，萃取得到的酶的比活和收率均有所增長，但當(dāng)靜置時間超過2小時時，萃取得到的酶的比活和收率出現(xiàn)輕微的下降，生產(chǎn)效率有所降低。實(shí)施例9該實(shí)施例(包括實(shí)施例9-1～9-5)用于說明在步驟(2)中對叔丁醇進(jìn)行多次循環(huán)利用對青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化以及固定化酶合成阿莫西林的影響。按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行多次試驗(yàn)，所不同的是，在步驟(2)中所使用的叔丁醇和水的混合物為上一次試驗(yàn)回收得到的叔丁醇，也就是說，每進(jìn)行一次試驗(yàn)所使用的叔丁醇的循環(huán)次數(shù)增加一次，具體如表7所示。測定并計算所得的發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)、酶的分離純化收率(％)、酶提取總收率(％)(即發(fā)酵液預(yù)處理和酶的分離純化兩步的總收率)、固定化酶活(IU/g)和固定化酶水含量(％)記錄于表7中。表7從表7中可以看出，使用5次回收所得叔丁醇分別進(jìn)行試驗(yàn)的數(shù)據(jù)重復(fù)性好，發(fā)酵液預(yù)處理收率、酶的分離純化收率、酶提取總收率、固定化酶活和固定化酶水含量的數(shù)據(jù)基本保持在誤差范圍內(nèi)；分離純化步驟平均收率為96±1％，酶提取平均總收率為77±1％，得到的固定化酶成品平均酶活為41.5±1.4IU/g，平均水含量為51±1％。另外，分別取實(shí)施例9-1、實(shí)施例3和實(shí)施例9-2所得的固定化酶合成阿莫西林，重復(fù)反應(yīng)15批次，平均反應(yīng)時間分別為69、64、66min，平均6-APA殘留分別為2.80、2.60、2.60mg/mL，證明所得固定化酶的性能良好。對比例3本對比例用于說明當(dāng)采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)分離純化與固定化青霉素?；敢约肮潭ɑ负铣砂⒛髁值那闆r。使用制備例所得的青霉素?；复置敢篒I，按如下步驟分離純化與固定化青霉素?；福?1)青霉素?；复置敢篒I用1-3mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8.4-8.6，加少量硅藻土，攪拌混合混勻后板框過濾，收集濾液；然后用中空纖維膜將濾液濃縮至酶活為15-30IU/mL，收集濃縮液；(2)濃縮液中緩慢加入25-30％硫酸銨，邊加鹽邊攪拌，加鹽結(jié)束后再攪拌30min，然后加少量硅藻土板框過濾，收集沉淀；(3)用跟粗酶液II體積接近的0.05mol/LpH8.0磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后加少量硅藻土板框過濾，收集濾液；(4)濾液用中空纖維素膜加純化水反復(fù)沖洗，去除色素、無機(jī)鹽和小分子蛋白，使電導(dǎo)小于1000μS/mL，最后將酶液濃縮至青霉素酰化酶的酶活為15-25IU/mL，收集濃縮液；(5)酶的固定化和后處理：濾液按一定比例補(bǔ)加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀至無機(jī)鹽終濃度為0.1mol/L，其它操作方式與實(shí)施例1的固定化和后處理的操作方式相同，得到固定化酶。測試?yán)龑?shí)施例3和對比例3所得的固定化酶產(chǎn)品分別用于合成阿莫西林，重復(fù)反應(yīng)15批次，將結(jié)果取平均值，如表8所示。表8編號實(shí)施例3對比例3發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)8080酶的分離純化收率(％)9570酶提取總收率(％)7656固定化酶活(IU/g)41.834固定化酶水含量(％)5052合成反應(yīng)時間(min)64866-APA殘留量(mg/mL)2.602.68從表8可以看出，本發(fā)明的方法與對比例的方法相比，酶的分離純化的收率有顯著的增加，從而酶提取總收率有顯著增加。并且本發(fā)明所得的固定化酶的酶活明顯高于對比例，從而使合成阿莫西林的反應(yīng)時間比對比例明顯縮短，單位時間內(nèi)合成阿莫西林的效率顯著提高。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于此。在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，包括各個技術(shù)特征以任何其它的合適方式進(jìn)行組合，這些簡單變型和組合同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3