專利名稱：一種Oligo dT引物及構(gòu)建cDNA文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種Oligo dT引物，以及基于這種 Oligo dT引物進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建的方法。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)水平的分析，對研究基因功能起著至關(guān)重要的作用?；虮磉_(dá)序列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE),是一種快速分析基因表達(dá)信息的技術(shù),它通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequenced Tags, EST)來尋找出表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組表達(dá)信息。SAGE技術(shù)與基因芯片一起為目前兩種最常見的基因表達(dá)譜研究方法。隨著第二代測序技術(shù)的發(fā)展，通過構(gòu)建cDNA文庫，然后利用第二代測序技術(shù)的高通量優(yōu)勢對mRNA文庫進(jìn)行測序，進(jìn)而進(jìn)行基因表達(dá)譜分析的方法在基因表達(dá)譜研究中占有越來越重要的地位。真核生物的mRNA分子的5’端存在帽子結(jié)構(gòu)，且往往還含有二級結(jié)構(gòu)，因此，若要成功構(gòu)建5’端cDNA文庫(該文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽來源于5’各mRNA分子的5’ 端)，必須克服5’端帽子結(jié)構(gòu)和5’端存在的二級結(jié)構(gòu)的影響，難度較大。此外，即使得到 5’端cDNA文庫，因為mRNA分子5’端GC含量較高，該文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽與各 mRNA分子的對應(yīng)關(guān)系較差，使得這種文庫在多種科學(xué)研究中的應(yīng)用難度較高，用于mRNA分子的表達(dá)譜分析時得到的結(jié)果不準(zhǔn)確。還有，構(gòu)建所得的5’端cDNA文庫5’未端表現(xiàn)不足 (undel!representation)是目前技術(shù)的固有限制,且由許多因素引起。其中最重要的一種因素是由逆轉(zhuǎn)錄酶的延長過程的隨機(jī)失效引起的。因為逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA的3’移動到5’末端，所以一定百分比的逆轉(zhuǎn)錄酶可能從刪RNA模板解離，從而引起cDNA合成過早終止。另一種起作用的因素是逆轉(zhuǎn)錄酶在mRNA 二級結(jié)構(gòu)區(qū)域暫停、減緩或停止。還有一種因素是由污染性的RNA酶引入的，如果在由mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA分子的過程中，有極微量的污染性RNA酶，那么，部分mRNA分子的5’未端會被污染性的RNA酶降解去除。上述情況對長mRNA分子的影響尤其嚴(yán)重。因此，目前構(gòu)建cDNA文庫的現(xiàn)有技術(shù)中，構(gòu)建3’端cDNA文庫是主流。而現(xiàn)有技術(shù)中常采用的Oligo dT引物為含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子， 序列可簡寫為5’-(dT)n-3’，在整個文庫的構(gòu)建過程中僅具有分離純化mRNA分子，將mRNA 分子反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA的作用，對形成雙鏈cDNA后的后續(xù)操作限制較大，能應(yīng)用的建庫方法單一。目前，構(gòu)建3’端cDNA文庫的方法大致如下(I)利用Oligo dT引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄并合成dscDNA ；(2)錨定酶(anchoring enzyme, AE)NlaIII 酶切 dscDNA,收集 dscDNA 的 poly A/ T部分與最近的酶切位點之間的片段，得3’ -cDNA ；(3)在3’ -cDNA的5’端接上接頭1，得含有接頭I的cDNA，該接頭I為雙鏈DNA 分子，包含Mme I酶切識別序列，其3’端含有CATG四堿基突出末端；(4) Mme I酶切合有接頭I的cDNA，并回收含有接頭I的酶切產(chǎn)物；
(5)在含有接頭I的酶切產(chǎn)物的3’端接上接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的cDNA文庫，該接頭2為雙鏈DNA分子，其5’端為突出末端，含有兩個通用堿基。上述方法中的錨定酶為序列特異性的限制性內(nèi)切酶，當(dāng)某些mRNA分子上無該錨定酶的酶切位點時，這些mRNA分子在最終的cDNA文庫中無法體現(xiàn)；又或者某些mRNA分子上錨定酶的酶切位點不合適，使得后續(xù)的IIs型限制性內(nèi)切酶Mme I無法實現(xiàn)酶切，或者實現(xiàn)Mme I酶切的位置在dscDNA的poly A/T部分,使得這些mRNA分子所形成的cDNA文庫分子中包含的特異性序列太短，無法實現(xiàn)與這些mRNA分子特異性的對應(yīng)。即，上述方法無法保證樣品中所有的mRNA分子均能在cDNA文庫中得到體現(xiàn)，進(jìn)而使得后續(xù)的基因表達(dá)譜分析結(jié)果不準(zhǔn)確。因此需要一種新的Oligo dT引物，該引物適用性廣，基于該引物形成的雙鏈cDNA 分子對后續(xù)操作的限制小，能夠應(yīng)用于多種建庫方法中；此外還需要一種新的cDNA文庫構(gòu)建方法，該cDNA文庫構(gòu)建方法能夠使樣品中所有的mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得到特異性的體現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Oligo dT引物，解決現(xiàn)有技術(shù)中的Oligo dT引物適用范圍小，基于現(xiàn)有技術(shù)中的Oligo dT引物形成雙鏈cDNA分子之后的操作限制大，應(yīng)用其建庫方法單一的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種特殊設(shè)計的Oligo dT引物，該Oligo dT引物，適用性好，可應(yīng)用于多種不同的建庫方案；進(jìn)一步的，該Oligo dT引物結(jié)構(gòu)簡單，能夠準(zhǔn)確的定位在mRNA分子poly A尾的起始位點；且利用該Oligo dT引物進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，可避免部分mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得不到特異性的體現(xiàn)的現(xiàn)象的出現(xiàn)。一種Oligo dT引物，為含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點。其中，該用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’端。其中，該Oligo dT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3，;或5 ’ - (RERS) - (dT) z_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) e -3，；或5’ -(dT)Y(I) (dT)s_3，；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。其中，該Oligo dT引物的3’末端為含通用堿基的核苷酸M，M為A或G或C。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物的3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至3’ 端依次為M和N，N為A或G或C或T或U或I ;所述Olig0 dT引物序列為5，- (dT) XU (dT) yMN_3，；或5 ’ - (RERS) - (dT) ZMN_3，；或5，- (dT) a (P-S) (dT) eMN_3，；
或5，- (dT) Y (I) (dT) sMN-3，；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。更進(jìn)一步的，x+y^ 14, z ^ 15, a +^ 14, y + 8 ^ 14。其中，所述Oligo dT引物含有標(biāo)記物，所述標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、 配體、多聚組氨酸中的至少一種。本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的cDNA文庫構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)不能保證樣品中所有mRNA分子均能在cDNA文庫中得到特異性體現(xiàn)的問題?；谏鲜鎏厥庠O(shè)計的Oligo dT引物，本發(fā)明提供了一種cDNA文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟A.利用Oligo dT引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，形成第一條cDNA鏈，得RNA/DNA雜合分子；該 Oligo dT引物為含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點；B.對RNA/DNA雜合分子中的第一條cDNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增，得雙鏈cDNA ；C.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；D.含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段與第一接頭分子連接，得cDNA文庫。其中，該用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或IIs 型限制性內(nèi)切酶識別序列，所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’端。其中，該用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷；該步驟 C包括以下步驟C01.切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段；C02.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；C03.利用第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；所述切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸
二酯鍵。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3，;或5，- (dT) a (P-S) (dT) e -3，；或5’ -(dT)Y(I) (dT)s_3，；其中，x、y、a、3、Y、6均為自然數(shù)，14 彡 x+y 彡 17，14 彡 a ( 17, 14彡y + 8彡17，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。其中，該用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷；該步驟 C包括以下步驟Cll.切割劑切割雙鏈CDNA，得雙鏈切割片段；C12.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；C13.利用第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得不含第二接頭分子的酶切片段；C14.將不含第二接頭分子的酶切片段與第三接頭分子連接，得第二連接產(chǎn)物；
C15.利用第二 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；所述切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸
二酯鍵。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5’ _(dT)xU(dT)y-3’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) e -3，；或5’ -(dT)Y(I) (dT)s_3，；其中，x、y、a、旦、y , 6均為自然數(shù)，x+y彡14 ;3彡x彡9, a 彡14, 3 ^ a ^ 9, y + 8 ^ 14,3 ^ Y 彡 9。其中，該用于切割的識別位點為IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，其位于Oligo dT 引物的5’端；該步驟C具體為Hs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，分離純化出含有Oligo dT引物對應(yīng)序列的酶切產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5’ -(RERS)-(dT)「3’ ；其中，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，z為自然數(shù)，10彡z彡17。其中，該用于切割的識別位點為IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，其位于Oligo dT 引物的5’端；該步驟C具體為C21. Hs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，分離純化出無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段；C22.將無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段與第四接頭分子連接，得第三連接產(chǎn)物；C23.利用第三IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第三連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5’ -(RERS)-(dT)「3’ ；其中，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，z為自然數(shù)，15彡z彡30。其中，在步驟A之前還包括步驟A’:利用01 igo dT引物從總RNA中分離純化mRNA。其中，上述任意方案中，所述Oligo dT引物的3’末端可為含通用堿基的核苷酸M， M為A或G或C。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物的3’末端可為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至 3’端依次為M和N，N為A或G或C或T或U或I ;所述Oligo dT引物序列為5，-(dT)xU(dT)yMN_3，；或5 ’ - (RERS) - (dT) ZMN_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) eMN_3，；或5，- (dT) Y (I) (dT) sMN-3，；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。
更進(jìn)一步的，x+y^ 14, z ^ 15, a +^ 14, y + 8 ^ 14。其中，上述任意方案中，該Oligo dT引物在5’端含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種；優(yōu)選為生物素或多聚組氨酸。其中，該接頭分子含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種；優(yōu)選為生物素或多聚組氨酸。其中，在步驟D之后還可包括步驟D’ 利用與cDNA文庫兩端的已知序列相同或互補的引物對cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由上可知，本發(fā)明的Oligo dT引物，適用性好，可應(yīng)用于多種不同的建庫方案，其結(jié)構(gòu)簡單，基于其進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，可避免樣品中部分mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得不到特異性的體現(xiàn)的現(xiàn)象出現(xiàn)，進(jìn)一步的，還能夠準(zhǔn)確定位在mRNA分子3’端poly A 的起始位點。基于本發(fā)明的Oligo dT引物進(jìn)行的cDNA文庫構(gòu)建方法，能夠使樣品中所有的mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得到特異性的體現(xiàn),并能進(jìn)一步降低起始mRNA分子量的需求，簡化實驗步驟，提高建庫的成功率，所構(gòu)建的cDNA文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽(即來源于各mRNA分子的特異性序列)在mRNA分子中位置的確定性高，有利于構(gòu)建的cDNA文庫在完成測序后的結(jié)果分析，從而可進(jìn)一步提高根據(jù)構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行mRNA表達(dá)譜分析的準(zhǔn)確性，通過本發(fā)明方法所得的cDNA文庫可用于表達(dá)譜分析、mRNA分子3’端序列分
析等。


圖I是本發(fā)明一個實施例中硫代磷酸脂鍵的結(jié)構(gòu)示意圖2是本發(fā)明一個實施例中cDNA文庫構(gòu)建的方法流程圖3是本發(fā)明一個實施例中帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭的結(jié)構(gòu)示意圖4是本發(fā)明一個實施例中單突出末端接頭的結(jié)構(gòu)示意圖5是本發(fā)明一個實施例中雙突出末端的結(jié)構(gòu)示意圖6是本發(fā)明一個實施例中得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段的方法流程 閱圖7是本發(fā)明另一個實施例中得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段的方法流程圖;
圖8是本發(fā)明另一個實施例中得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段的方法流程圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明所述的IIs型限制性內(nèi)切酶為切割位點在識別序列之外的限制性內(nèi)切酶，
包括但不限于Acu I、Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、 BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、 BtgZ I、Ear I、Eei I、 EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyAV、Mbo II、Mly I、 Mme I. Mnl I、NmeAIII、Ple I. Sap I. SfaN I 和 TspDT I，優(yōu)選為 Acu I. Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I0
本發(fā)明所述的mRNA來源于真核生物，包括但不限于動物、植物、真菌和原生生物。一種Oligo dT引物，該Oligo dT引物為含有連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核苷酸 (thymidine deoxynucleotide, dT)序列的單鏈DNA分子,其含有用于切割的識別位點。需要說明的是利用用于切割的識別位點進(jìn)行的切割可發(fā)生在識別位點上；也可發(fā)生在識別位點外，例如在該識別位點的3’端方向的特定位置。利用用于切割的識別位點進(jìn)行的切割可發(fā)生在該Oligo dT引物上，也可發(fā)生在該Oligo dT引物擴(kuò)增出的片段上。本發(fā)明的01 igo dT引物，因為其含有用于切割的識別位點，在利用其進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建的過程中，能夠根據(jù)需要對基于其形成的雙鏈cDNA分子進(jìn)行各種處理，即，可根據(jù)客觀條件的不同，采用多種不同的建庫方案，從而達(dá)到最優(yōu)設(shè)計，本發(fā)明的Oligo dT引物適用性廣，能夠應(yīng)用于多種建庫方案中；且利用該Oligo dT引物進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建,可避免樣品中部分mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得不到特異性的體現(xiàn)的現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，該用于切割的識別位點包括但不限于尿嘧啶核苷酸(uridine，U)、脫氧肌苷 (deoxyinosine, I)、硫代磷酸酯鍵(P_S)或IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列,所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’端。上述用于切割的識別位點均可在相應(yīng)的物質(zhì)的作用下發(fā)生特異性的切割。用于切割的識別位點與該相應(yīng)的物質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系包括但不限于U-USER 酶或 UDG 酶；I——大腸桿菌核算內(nèi)切酶V及其同源物或DNA糖基化酶；P-S——含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd原子的切割劑；Hs型限制性內(nèi)切酶識別序列一Hs型限制性內(nèi)切酶。需要說明的是上述方案中的硫代磷酸酯鍵是指磷酸二酯鍵的橋接氧原子之一被硫原子取代。硫代磷酸脂鍵可以是圖IA所示的5’-S-硫代磷酸酯連接(3’-0-P-S-5’)，也可以是圖IB所示的3’ -S-硫代磷酸酯連接(3’ -S-P-0-5’ )?？捎酶鞣N含金屬的物質(zhì)切割硫代磷酸酯鍵。所述金屬可以是Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或 Cd。優(yōu)選的，該物質(zhì)是提供48+、取++^11++、211+或0(1+離子的可溶于水的鹽(也可采用提供其它氧化狀態(tài)的離子的鹽)。特別優(yōu)選含銀鹽如硝酸銀(AgNO3)或其它提供Ag+離子的鹽。 切割的條件包括例如50mMAgN03，約22 37°C，10分鐘或更長時間如30分鐘。優(yōu)選的，pH 為4. 0 10. 0，更優(yōu)選5. 0 9. 0，如約6. 0 8. 0，如約7. O。參見Mag, M.等，Nucleic Acids Res. ,19(7) :1437_1441，1991。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3，;或5，- (RERS) - (dT) z_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) e -3，；或5’ -(dT)Y(I) (dT)s_3，；其中，x、y、z、a、0、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。其中，上述所有方案中的Oligo dT引物的3’末端可為含通用堿基的核苷酸M，M為A或G或C。通過該含通用堿基的核苷酸M，該Oliog dT引物在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中能夠準(zhǔn)確定位在mRNA分子poly A尾的起始位點，從而消除在合成第一條cDNA鏈時Oligo dT引物可能與poly A尾的任意位置結(jié)合所造成的不利影響，保證了所構(gòu)建的cDNA文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽(即來源于各mRNA分子的特異性序列)在mRNA分子中位置的確定性，有利于構(gòu)建的cDNA文庫在完成測序后的結(jié)果分析，進(jìn)一步提高了根據(jù)構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行mRNA 表達(dá)譜分析的準(zhǔn)確性。該Oligo dT引物的3’末端序列可用以下通式表示5’ -M(N) E_3’ ；其中，e為自然數(shù)，N為A或G或C或T或U或I。其中，隨著e的增大，該Oligo dT引物在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中定位在mRNA分子poly A尾的準(zhǔn)確率提高。在綜合考慮準(zhǔn)確率和Oligo dT引物的制備成本后，e優(yōu)選為I或2。進(jìn)一步的，所述Oligo dT引物的3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至 3’端依次為M和N，M為A或G或C，N為A或G或C或T或U或I ;所述Oligo dT引物序列為5’-(dT)xU(dT)yMN-3，；或5 ’ - (RERS) - (dT) ZMN_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) 0 MN-3 ’ ；或5’ -(dT) Y (I) (dT) sMN-3’ ；其中，x、y、z、a、P、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。更進(jìn)一步的，x+y^ 14, z ^ 15, a 彡 14, y + 6 彡 14。本方案保證了 Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾的結(jié)合強度，有利于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。其中，上述所有方案中的01 igo dT引物還可含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種。通過與Oligo dT引物上的標(biāo)記物適配的配合物，可進(jìn)一步提高Oligo dT引物在使用過程中的易用性，提高實驗效率。圖2示出了本發(fā)明的第一實施例中的cDNA文庫構(gòu)建方法流程，包括以下步驟SI.利用Oligo dT引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，形成第一條cDNA鏈，得RNA/DNA雜合分子；S2.對RNA/DNA雜合分子中的第一條cDNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增，得雙鏈cDNA ；S3.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；S4.含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段與第一接頭分子連接，得cDNA文庫。其中，步驟SI所述的Oligo dT引物為本發(fā)明所述的任一種Oligo dT引物，即含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點。本實施例通過Oligo dT引物及相關(guān)設(shè)計,使得樣品中所有的mRNA分子在構(gòu)建的 cDNA文庫中均得到了特異性的體現(xiàn)，且所構(gòu)建的cDNA文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽(即來源于各mRNA分子的特異性序列)均來源于mRNA分子的3’端。需要說明的是在本實施例中，步驟SI中的Oligo dT引物可包含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物包括但不限于生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸；通過與Oligo dT引物上的標(biāo)記物適配的配合物，可進(jìn)一步提高Oligo dT引物在使用過程中的易用性，提高實驗效率。例如，該標(biāo)記物為生物素時，可利用與生物素特異性結(jié)合的鏈霉親和素或親和素，而實現(xiàn)對步驟SI中 RNA/DNA產(chǎn)物的快速分離純化，提高了實驗效率；同樣的，該標(biāo)記物為抗原、抗體、受體或配體時，可利用與這些標(biāo)記物適配的抗體、抗原、配體或受體，對由Oligo dT引物生成的產(chǎn)物完成快速的分離純化。當(dāng)然，這些標(biāo)記物可能會對Oligo dT引物的延伸造成一定影響，但是通過對這些標(biāo)記物在Oligo dT引物上位置的合理設(shè)計，可將這些影響降低到最低，甚至無影響；一般情況下，標(biāo)記物設(shè)置在Oligo dT引物的5’端對其延伸都無明顯影響。優(yōu)選的， 該標(biāo)記物為生物素或多聚組氨酸。更優(yōu)選的，該標(biāo)記物位于Oligo dT引物的5’端。其中，用于切割的識別位點包括但不限于尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’ 端。上述用于切割的識別位點均可在相應(yīng)的物質(zhì)的作用下發(fā)生特異性的切割。用于切割的識別位點與該相應(yīng)的物質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系包括但不限于U-USER 酶或 UDG 酶；I——大腸桿菌核算內(nèi)切酶V及其同源物或DNA糖基化酶；P-S——含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd原子的切割劑；Hs型限制性內(nèi)切酶識別序列一Hs型限制性內(nèi)切酶。需要說明的是上述方案中的硫代磷酸酯鍵是指磷酸二酯鍵的橋接氧原子之一被硫原子取代。硫代磷酸脂鍵可以是圖IA所示的5’-S-硫代磷酸酯連接(3’-0-P-S-5’)，也可以是圖IB所示的3’ -S-硫代磷酸酯連接(3’ -S-P-0-5’ )?？捎酶鞣N含金屬的物質(zhì)切割硫代磷酸酯鍵。所述金屬可以是Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或 Cd。優(yōu)選的，該物質(zhì)是提供Ag+、Hg++、Cu++、Mn++、Zn或Cd+離子的可溶于水的鹽(也可采用提供其它氧化狀態(tài)的離子的鹽)。特別優(yōu)選含銀鹽如硝酸銀(AgNO3)或其它提供Ag+離子的鹽。切割的條件包括例如50mMAgN03，約22 37°C，10分鐘或更長時間如30分鐘。優(yōu)選的， pH為4.0 10.0，更優(yōu)選5.0 9.0，如約6.0 8.0，如約7. O。參見Mag，M.等，Nucleic Acids Res. ,19(7) :1437_1441，1991。在上述列舉的四種用于切割的識別位點中，硫代磷酸脂鍵的優(yōu)點在于，在使用過程中，成本更低，完成切割的速度更快，操作也更為簡便；但其對環(huán)境造成的污染較大，反應(yīng)后的廢液處理成本高，而另外三種用于切割的識別位點，均是通過特異性的酶完成的切割， 不存在環(huán)境污染的問題。進(jìn)一步的，該Oligo dT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3，;或5，- (RERS) - (dT) z_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) e -3，；或5’ -(dT)Y(I) (dT)s_3，；其中，x、y、z、a、P、Y、S均為自然數(shù)；RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，該核苷酸序列可為DNA或RNA，優(yōu)選為DNA ;P_S為硫代磷酸酯鍵；I為脫氧肌苷。
其中，對x+y、z、a+P、y + 6的大小均無特殊限制。進(jìn)一步的,9 < x+y < 44, 9 彡 z 彡 44，9 彡 a ^ 45,9 ^ y + 8 彡 44。在步驟SI中，mRNA的來源無特殊限定?？刹捎酶鞣N現(xiàn)有技術(shù)從總RNA中分離純化出mRNA，例如采用常規(guī)的Oligo dT引物從總RNA中捕獲mRNA，該常規(guī)Oligo dT引物可固定在纖維柱上或帶有生物素標(biāo)記，以便于捕獲的mRNA的回收純化。優(yōu)選的，在步驟SI之前還包括步驟SI’ 采用Oligo dT引物從總RNA中分離純化 mRNA。該Oligo dT引物優(yōu)選為本發(fā)明所述的Oligo dT引物。更優(yōu)選的，該Oligo dT引物帶有標(biāo)記物，然后利用與該標(biāo)記物適配的配合物對捕獲的mRNA進(jìn)行分離純化；或者該Oligo dT引物被固定在介質(zhì)上，從而在介質(zhì)表面對總RNA 中的mRNA分子進(jìn)行捕獲和純化，該介質(zhì)優(yōu)選為纖維柱或凝膠柱。更優(yōu)選的，該標(biāo)記物為生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種。例如，該Oligo dT引物在5’端帶有標(biāo)記物，該標(biāo)記物為多聚組氨酸，所述步驟SI’ 大致如下通過多聚組氨酸與鎳離子(帶有鎳離子的凝膠柱)之間的結(jié)合，實現(xiàn)對捕獲的 mRNA的分離純化。又或者，該Oligo dT引物同時帶有2種標(biāo)記物，一種為在該引物5’端的多聚組氨酸，另一種為在該引物序列中部的生物素，所述步驟SI’大致如下首先，利用帶有鎳離子的凝膠柱捕獲Oligo dT引物，再利用Oligo dT引物捕獲總 RNA中的mRNA分子；然后，將Oligo dT引物和捕獲的mRNA分子從凝膠柱上洗脫下來，并使它們保持結(jié)合狀態(tài)；最后，再利用帶有鏈霉親和素的磁珠實現(xiàn)對mRNA分子的純化。在本實施例中，步驟S2可根據(jù)需要采用多種現(xiàn)有方法，包括但不限于自身引導(dǎo)法、置換合成法。自身引導(dǎo)法是先用氫氧化鈉消化RNA/DNA雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離得到的第一條cDNA鏈的3’末端會自身形成一個發(fā)夾環(huán)，并引導(dǎo)依賴于DNA的聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，然后再利用SI核酸酶將連接處(僅該位點處為單鏈結(jié)構(gòu))切斷形成平端結(jié)構(gòu)的雙鏈cDNA。置換合成法是這樣實現(xiàn)的，RNA/DNA雜合雙鏈中的mRNA鏈在RNA酶H的作用下先形成很多切口，mRNA鏈就被切割成喝多的小片段， 這些小片段為依賴于RNA的聚合酶(如大腸桿菌DNA聚合酶I)提供了合成第二鏈DNA的引物。依賴于RNA的聚合酶以第一鏈cDNA為模板合成一段段互補的cDNA片段。這些cDNA 片段進(jìn)而在DNA連接酶的作用下連接成一條鏈，從而得到雙鏈cDNA。但是自身引導(dǎo)法的反應(yīng)較難控制，尤其是第一條cDNA鏈的3’末端形成發(fā)夾環(huán)這一反應(yīng)很難控制，往往需要多次摸索實驗條件，形成雙鏈cDNA的失敗率較高。優(yōu)選的，步驟S2采用置換合成法，該方法的反應(yīng)條件容易控制，成功率高。在本實施例中，步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶對雙鏈cDNA的酶切有多種實現(xiàn)方案，包括但不限于以下兩種方式；第一，可以是由步驟SI中的Oligo dT引物將IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列引入至雙鏈cDNA中，從而使得步驟S3中可以用對應(yīng)的IIs型限制性內(nèi)切酶直接對雙鏈cDNA進(jìn)行酶切；第二，也可以是在步驟S3中進(jìn)行IIs型限制性內(nèi)切酶酶切步驟之前，利用Oligo dT引物上的用于切割的識別位點對雙鏈cDNA進(jìn)行切割，然后通過含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的接頭分子與切割產(chǎn)物連接，從而引入IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，然后再用相應(yīng)的IIs型限制性內(nèi)切酶對連接后的產(chǎn)物實現(xiàn)酶切。具體將在后續(xù)的實施例中進(jìn)行一步詳細(xì)闡述。在本實施例中，步驟S4中的第一接頭分子為至少含有一個突出末端的核酸分子， 該突出末端與步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端相匹配。該核酸分子可為單鏈核酸分子，即帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭(如圖3所示)，該單鏈核酸分子包括第一互補配對區(qū)I、莖環(huán)區(qū)2、第二互補配對區(qū)3和突出末端4，第一互補配對區(qū)I 能夠與第二互補配對區(qū)3互補配對，且它們形成的互補配對區(qū)包括至少一個限制性內(nèi)切酶識別位點，該突出末端4的位置和序列與步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端相匹配。例如，當(dāng)步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶為Acu I時，該第一接頭分子的該突出末端位于單鏈核酸分子的3’末端，該突出末端含有2個含通用堿基N的核苷酸，N為A或 G或C或T或U或I ;當(dāng)步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶為EcoP15 I時，該第一接頭分子的該突出末端位于單鏈核酸分子的5’末端，該突出末端含有2個含通用堿基N的核苷酸， N為A或G或C或T或U或I ;當(dāng)步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶為Mme I時，該第一接頭分子的該突出末端位于單鏈核酸分子的3’末端，該突出末端含有2個含通用堿基N的核苷酸，N為A或G或C或T或U或I。當(dāng)?shù)谝唤宇^分子為帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭時，第一接頭分子與含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段連接生成連接產(chǎn)物，利用限制性內(nèi)切酶切去連接產(chǎn)物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(來源于帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭)，進(jìn)而形成cDNA文庫。該限制性內(nèi)切酶能夠特異性的識別第一接頭分子上的限制性內(nèi)切酶識別位點。該核酸分子還可以是雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子至少包括一突出末端，該突出末端與步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端相匹配。根據(jù)該雙鏈核酸分子的結(jié)構(gòu)，可分成兩類，分別是單突出末端接頭、雙突出末端接頭。該單突出末端接頭(如圖4所示)一端為平末端(圖4a)或分叉結(jié)構(gòu)(圖4b)，另一端為與步驟S3中的IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端相匹配的突出末端。其中帶有分叉接頭的單突出末端接頭能夠防止接頭自連。為了防止一端為平末端的單突出末端接頭自連，可對平末端上的3’ OH進(jìn)行修飾(包括但不限于用氨基封閉羥基)，或?qū)⑵侥┒松系?5’磷酸基團(tuán)去除。該雙突出末端接頭(如圖5所示)含有兩個突出末端，這兩個突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖5a)或在不同的核苷酸鏈上(圖5b)，其中一個突出末端與步驟S3中的IIs 型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端相匹配。當(dāng)這兩個突出末端在不同的核酸鏈上時，他們相互之間不互補，以防在連接時出現(xiàn)接頭自連。在本實施例中，步驟S4之后還可包括步驟S4’ 利用與cDNA文庫兩端的已知序列相同或互補的引物對cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得擴(kuò)增后的cDNA文庫。以滿足第二代高通量測序方法中的單分子擴(kuò)增步驟對測序文庫的量的要求。該單分子擴(kuò)增是指將測序文庫中的多種文庫分子，以極微量(甚至單分子)的形式在空間上隔離(但這些文庫分子整體上還是屬于同一個反應(yīng)體系)，并且在各自的空間內(nèi)實現(xiàn)擴(kuò)增，以提升各種分子在后續(xù)測序反應(yīng)中的信號。
針對步驟S3，根據(jù)01 igo dT引物設(shè)計的不同，可有不同的具體實施方案。其中，當(dāng)用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷時，可通過相應(yīng)的切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段，然后使雙鏈切割片段與接頭分子連接，從而引入IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，進(jìn)而得到含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。該切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸二酯鍵。隨著 Oligo dT引物長度(即x+y+1、a+^ , y + 6+1)的不同，本發(fā)明有多種實施方案。如圖6所示，在本發(fā)明的第二實施例中，步驟S3包括以下步驟S301.切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段；S302.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；S303.利用第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。本實施例利用Oligo dT引物上的U或P-S或I，通過切割劑切割形成粘性末端，然后該粘性末端與相適應(yīng)的第二接頭分子連接，并利用第二接頭分子上的第一 Hs型限制性內(nèi)切酶識別序列，通過第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片， 該片段再與該片段相適應(yīng)的第一接頭分子連接形成cDNA文庫。本實施例方案步驟簡單， 對步驟SI中mRNA的量的要求較低，且通過調(diào)整第二接頭分子上的IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，可保證本實施例方案所構(gòu)建的cDNA文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽長度大于等于 9，使得每種cDNA分子與建庫的初始材料mRNA混合物中的每一種mRNA保證理論上的一一對應(yīng)。一個9堿基的序列能有49 = 262144種不同的排列組合，因此理論上每一個9堿基的標(biāo)簽就能夠作為代表一種mRNA分子的特征序列。當(dāng)然，隨著待測標(biāo)簽長度的增加，其與 mRNA分子之間的對應(yīng)關(guān)系越特異。當(dāng)x+y ( 17時,本實施例方案尤其適用。需要說明的是步驟S302中的第二接頭分子為至少含有一個突出末端的核苷酸分子，該核苷酸分子還含有雙鏈區(qū)，該雙鏈區(qū)含有第一 IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列；該突出末端由dT和 /或U組成，該突出末端包含的核苷酸數(shù)a與Oligo dT引物中的U或P-S或I距離3’末端的堿基數(shù)b相關(guān)，a = b+1。例如，當(dāng)U或P-S或I距離Oligo dT引物的3’末端3個堿基時，第二接頭分子的突出末端包含的dT數(shù)為4 ;當(dāng)U或P-S或I處于Oligo dT引物的3’ 末端時，第二接頭分子的突出末端包含的dT數(shù)為I ;當(dāng)U或P-S或I距離Oligo dT引物的 3’末端10個堿基時，第二接頭分子的突出末端包含的dT數(shù)為11。如圖7所示，在本發(fā)明的第三實施例中，步驟S3包括以下步驟S311.切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段；S312.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；S313.利用第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得不含第二接頭分子的酶切片段；S314.將不含第二接頭分子的酶切片段與第三接頭分子連接，得第二連接產(chǎn)物；S315.利用第二 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。本實施例通過兩次IIs型限制性內(nèi)切酶酶切，得到含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。本實施例的方案與第二實施例相比，能夠進(jìn)一步降低對Oligo dT引物、第二接頭分子的設(shè)計要求，第二接頭分子中的IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的選擇范圍更廣，Oligo dT 引物序列長度可選擇的范圍也更廣；進(jìn)而放寬了步驟SI、步驟S3中對反應(yīng)條件，尤其是反應(yīng)溫度的要求，使得相關(guān)反應(yīng)能夠在特異性與反應(yīng)速度之間得到更好的平衡。當(dāng)然，本發(fā)明還可參考本方案的設(shè)計，通過更多次的II s型限制性內(nèi)切酶酶切，得到含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。從而更進(jìn)一步降低對Oligo dT引物、第二接頭分子的設(shè)計要求。需要說明的是步驟S313中的第三接頭分子為至少含有一個突出末端的核苷酸分子，該核苷酸分子還含有雙鏈區(qū)，該雙鏈區(qū)含有第二 IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列；該突出末端能夠與第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端匹配。第一 IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列和第二 IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列可相同或不同。為了保證Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾的結(jié)合強度，以利于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行，x+y彡14,即Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾相結(jié)合序列長度大于等于15 ;優(yōu)選在15至30之間。進(jìn)一步的,3 X ^ 9,使得第二、第三實施例中的與Oligo dT引物設(shè)計相適應(yīng)的第二接頭分子結(jié)構(gòu)更為合理，能夠兼顧連接時的結(jié)合力、第二接頭分子的成本和穩(wěn)定性等因素。其中，當(dāng)用于切割的識別位點為IIs型限制性內(nèi)切酶酶切識別序列，其位于Oligo dT引物的5’端時，可直接利用該IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，得到mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。隨著Oligo dT引物長度的不同，本發(fā)明有多種實施方案。在本發(fā)明的第四實施例中，步驟S3具體如下IIs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA， 分離純化出含有Oligo dT引物對應(yīng)序列的酶切片段，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。本實施例方案與第二、第三實施例的方案相比，步驟更簡單，實驗效率高，且減少了各步驟之間可能存在的核酸純化步驟，而核酸在純化過程中存在回收效率的問題，因此， 本方案能夠進(jìn)一步較低步驟SI中所需的mRNA量；此外，本方案通過Oligo dT引物引入IIs 型限制性內(nèi)切酶識別序列，所有的cDNA分子上均含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，省去了連接試劑，例如連接酶、接頭分子等，且不存在連接效率的問題，因此，本方案構(gòu)建cDNA 文庫的效率更高，成本更低。需要說明的是本發(fā)明的背景技術(shù)中的構(gòu)建cDNA文庫的方法所需的的起始mRNA量至少為200ng， 一般以500ng至Iyg為宜；經(jīng)發(fā)明人驗證，在本發(fā)明的第二、第三實施例中，所需的起始 mRNA的量與本發(fā)明的背景技術(shù)所需的量基本一致；本發(fā)明的第四實施例中，所需的起始 mRNA的量最低可降至50ng。又因為步驟的減少，以及所需起始mRNA量的降低，本發(fā)明能夠有效的提高建庫的成功率，降低因為步驟繁雜和所需起始mRNA量步驟而導(dǎo)致建庫失敗的現(xiàn)象出現(xiàn)的可能性。當(dāng)z < 17時，本實施例方案尤其適用。如圖8所示，在本發(fā)明的第五實施例中，步驟S3包括以下步驟S321. Hs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，分離純化出無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段；S322.將無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段與第四接頭分子連接，得第三連接產(chǎn)物；S323.利用第三IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第三連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。需要說明的是第四接頭分子為至少含有一個突出末端的核苷酸分子，該核苷酸分子還含有雙鏈區(qū)，該雙鏈區(qū)含有第三IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列；該突出末端能夠與步驟S321中的 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切形成的末端匹配。第三IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列和步驟S321中的IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列可相同或不同。本實施例通過兩次IIs型限制性內(nèi)切酶酶切，得到含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。本實施例的方案能夠進(jìn)一步降低對Oligo dT引物、第四接頭分子的設(shè)計要求，第四接頭分子中的Hs型限制性內(nèi)切酶識別序列的選擇范圍更廣，Oligo dT引物序列長度可選擇的范圍也更廣；進(jìn)而放寬了步驟SI、步驟S3中對反應(yīng)條件，尤其是反應(yīng)溫度的要求，使得相關(guān)反應(yīng)能夠在特異性與反應(yīng)速度之間得到更好的平衡。當(dāng)然，本發(fā)明還可參考本方案的設(shè)計，通過更多次的IIs型限制性內(nèi)切酶酶切，得到含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。從而更進(jìn)一步降低對Oligo dT引物、第四接頭分子的設(shè)計要求。為了保證Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾的結(jié)合強度，以利于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行，z ^ 15,即Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾相結(jié)合序列長度大于等于15 ;優(yōu)選在15至30之間，使得第四、第五實施例中的與Oligo dT引物設(shè)計相適應(yīng)的第二接頭分子結(jié)構(gòu)更為合理，能夠兼顧連接時的結(jié)合力、第二接頭分子的成本和穩(wěn)定性等因素。上述所有方案中，Oligo dT引物和建庫過程中所用到的接頭分子均可包含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物包括但不限于生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸；然后在構(gòu)建cDNA 文庫過程中，通過標(biāo)記物與相應(yīng)物質(zhì)的特異性結(jié)合(如生物素與鏈酶親和素、生物素與親和素、抗原與抗體、受體與配體或多聚組氨酸與鎳離子之間的特異性結(jié)合)，簡化驗步驟，提高建庫效率，提高中間產(chǎn)物的回收效率、降低建庫成本。優(yōu)選的，接頭分子包含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物為生物素或多聚組氨酸。為了提高Oligo dT引物在逆轉(zhuǎn)錄過程中與mRNA分子結(jié)合位置的確定性，本發(fā)明可以通過提高步驟SI中反轉(zhuǎn)錄過程中的退火溫度來實現(xiàn)，具體的優(yōu)選退火溫度范圍可根據(jù)所使用的Oligo dT引物中與mRNA分子3’端的poly A尾互補的序列的長度，以及其它實際實驗條件(如01igo dT引物所帶有的標(biāo)記類型、所使用的反轉(zhuǎn)錄酶等)來確定。此外，本發(fā)明還可以通過在Oligo dT引物的3’末端設(shè)置含含通用堿基的核苷酸 M來實現(xiàn)這一目的，M為A或G或C。該Oligo dT引物的3’末端序列可用以下通式表示5’ -M(N) E_3’ ；其中，e為自然數(shù)，N為A或G或C或T或U或I。在本發(fā)明的一典型實施例中，Oligo dT引物的3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至3’端依次為M和N，M為A或G或C，N為A或G或C或T或U或I，其引物序列為
5’ _(dT)xU(dT)yMN-3’ ；或5 ’ - (RERS) - (dT) ZMN_3 ’ ；或5，- (dT) a (P-S) (dT) 0 MN-3 ’ ；或5，- (dT) Y (I) (dT) sMN-3，；其中，x、y、z、a、P、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。本實施例通過Oligo dT引物最末端的兩個含通用堿基的核苷酸,使得Oligo dT 引物在逆轉(zhuǎn)錄過程中能夠準(zhǔn)確定位在mRNA分子poly A尾的起始位點,從而消除在合成第一條cDNA鏈時Oligo dT引物可能與poly A尾的任意位置結(jié)合所造成的不利影響,保證了所構(gòu)建的cDNA文庫中各分子攜帶的待測標(biāo)簽(即來源于各mRNA分子的特異性序列)在 mRNA分子中位置的確定性，有利于構(gòu)建的cDNA文庫在完成測序后的結(jié)果分析，進(jìn)一步提高了根據(jù)構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行mRNA表達(dá)譜分析的準(zhǔn)確性。更進(jìn)一步的，x+y^ 14, z ^ 15, a 彡 14, y + 6 彡 14。本方案保證了 Oligo dT引物與mRNA分子的poly A尾的結(jié)合強度，有利于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。下面將通過具體實施例對本發(fā)明的cDNA文庫構(gòu)建方法進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。步驟如下一、帶有Oligo dT引物的磁珠的制備I.吸取大約 10 U L磁珠(invitrogen, DynabeadsftMyOne TM Streptavidin Cl) 于0. 6mL EP管中，加入I % Triton X-1000. 6 y L (無RNA酶)，混勻。用磁鐵吸附磁珠，小心除去上清，注意不要吸到磁珠。用IOiiL TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH7. 5)清洗2次， 磁鐵吸附磁珠，用移液器除去上清。2.加入10 ii L的Binding buffer懸浮磁珠，然后再加入I U L濃度為100 y M的 5’末端帶有雙生物素標(biāo)記的Oligo dT引物，立即螺旋振蕩均勻。3.將震蕩均勻后的EP管放于旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤上低速轉(zhuǎn)動，18至25°C孵育大約I小時， 每10至15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，使生物素引物充分結(jié)合到磁珠上。注意輕彈管壁混勻時不要將磁珠彈到管壁上。4.利用磁鐵吸附住磁珠,小心除去上清,然后用TE清洗磁珠3次。重新用10 ii L TE懸浮磁珠，即得帶有Oligo dT引物的磁珠(于4°C保存?zhèn)溆?，至少能保?個月)。應(yīng)當(dāng)說明的是Binding Buffer 為含 20mM Tris-HCl, I. OM LiCl，2mM EDTA，pH為 7. 5 的水溶液。步驟2中的5’末端帶有雙生物素標(biāo)記的Oligo dT引物分為兩類，一類為對照組的 Oligo dT 引物，其序列分別為:5，-(dT)15-3，(SEQ ID N0:l)、5，- (dT) 19_3，(SEQ ID NO: 2)、5，-(dT)25-3，(SEQ ID NO :3)、5，- (dT) 13_3，(SEQ ID NO :4);另一類為實驗組的 Oligo dT 引物，其序列分別為 5’ _(dT)8U(dT) 6-3，(SEQ ID NO :5)、5’ - (dT) 13U (dT) 3MN_3’ (SEQ ID NO :6)、5’-AGAGCAGCAGC-(dT)25-3’ (SEQ ID NO :7)、5’-GAGCTGAAGATA-(dT) nMN_3’ (SEQ ID NO 8);對應(yīng)上述2類8種Oligo dT引物，得分別帶有對應(yīng)Oligo dT引物的磁珠。二、從總RNA中分離mRNA分別提取釀酒酵母Haploid. fa (S288C) ,Diploid, fa (BY4347)中的總 RNA，提取方法可參照各種常規(guī)技術(shù)，例如Trizol法。
調(diào)整總RNA的濃度至0. 5-1. 0 ii g/ ii L，取20 ii L進(jìn)行以下實驗在65°C加熱2分鐘以破壞二級結(jié)構(gòu)，然后置于冰上；同時，分別取出IOii L帶有Oligo dT引物的磁珠，并分別置于無RNA酶的管中；用磁鐵吸附磁珠，吸附30秒后，吸走上清液；用10 ii L Binding Buffer洗磁珠一次，然后吸走上清液；將磁珠懸浮于10 y L Binding Buffer中，加入10 U I總RNA，充分混勻，并置于室溫的旋轉(zhuǎn)儀上退火10分鐘；再用磁鐵吸附磁珠，移走上清液；用20 ill Washing Buffer B洗磁珠，然后用磁鐵吸附，移走上清液，重復(fù)三次，得含mRNA分子的磁珠；對應(yīng)所使用的帶Oligo dT引物的磁珠的不同，共有2類8種含mRNA分子的磁珠。Washing Buffer B 為 IOmM Tris-HCl,0. 15M LiCl, ImM EDTA，pH 為 7. 5 的水溶液。三、cDNA的合成I. cDNA第一鏈的合成用IOii I I XFirst Strand Buffer洗步驟二所得的含mRNA分子的磁珠,然后用磁鐵吸附，移走上清液，重復(fù)四次。在移走第四次洗脫的上清液之前，在冰上配置cDNA第一鏈合成反應(yīng)液，反應(yīng)液體系如下5X First Strand Buffer3. Ou I ；
RNase inhibitor (Takala D2310A)0. 2u I ；
DEPC Water9. 05 u L ；
0. IM DTTI. 5u L ；
dNTP MixdOmM each)0. 75u I ；
Total Volume14. 5 u I0 I XFirst Strand Buffer洗四次含mRNA分子的磁珠,然后用14. 5 ii L的第一鏈合成反應(yīng)液懸浮含mRNA樣品的磁珠,輕彈管壁或是輕輕旋渦振蕩以混勻溶液(如有少量磁珠沉淀，不影響結(jié)果)。然后將管子置于37°C 2分鐘，以平衡試劑。加入0.5 ii L Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/U L, Invitrogen，Cat#18064-014)，輕輕混勻，42°C反應(yīng)I小時，期間每 10至15分鐘輕彈管子或是低速旋渦振蕩。在70°C加熱15分鐘以停止反應(yīng)，然后在冰上降溫2分鐘。將反應(yīng)產(chǎn)物儲存于4°C。2. cDNA第二鏈的合成
將以下反應(yīng)液加入15 y L cDNA第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物中
DEPC Water43. 3u L ；
10XNEBuffer26 u L ；
IOmM ATP7. 5u L ；
E.coli DNA Ligase(IOU/u L, NEB, Cat#M0205S)0. 2 u L ；
E.coli DNA Polymerase (IOU/ u L, NEB, Cat#M0209S)2. 25 u L ；
E.coli RNase H(60U/u L, Takara, Cat#D2150)0. 75 u L0
其中，E. coli DNA Ligase, E. coli DNA Polymerase, E.coli RNase
旋渦振蕩混合反應(yīng)液，使反應(yīng)液中各成分充分混勻，然后低速離心，是反應(yīng)液集中在管底。 16°C反應(yīng)2小時，每10到15分鐘重新懸浮一下磁珠。反應(yīng)期間，把Wash Buffer C放在75°C預(yù)熱。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液置于冰上，加入7. 5 ii L 0. 5M EDTA終止反應(yīng)。然后用磁鐵吸附磁珠I至2分鐘，小心移走上清液。加入已經(jīng)預(yù)熱的IOOiiL Wash Buffer C使E.coli DNA聚合酶失活(此步非常重要)?；靹?，將樣品在75°C加熱20分鐘使DNA聚合酶完全失活。用磁鐵吸附磁珠，去上清。用80iiL Wash Buffer C洗三次。加入100 y L LoTE懸浮磁珠。將管子中的磁珠懸浮液全部轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，這樣可以盡量避免大腸桿菌DNA聚合酶的外切酶活性。用磁鐵吸附磁珠，去上清，然后用IOOiiL LoTE洗磁珠一次， 得含雙鏈cDNA產(chǎn)物的磁珠。對應(yīng)步驟二中所得含mRNA的磁珠的不同，共有2類8種雙鏈 cDNA產(chǎn)物的磁珠。Wash Buffer C :含 IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, ImM EDTA,0. 02% Triton X_100，pH 為7. 5的水溶液。LoTE :含 3. 33mM Tris-HCl,0. 33mM EDTA, pH 為 7. 5 的水溶液。四、構(gòu)建cDNA文庫I.第一類雙鏈cDNA文庫的構(gòu)建以對照組的4種Oligo dT引物所得的第一類雙鏈cDNA產(chǎn)物為原材料，分別按下述步驟進(jìn)行反應(yīng)。DNlaIII 酶切將含有雙鏈cDNA產(chǎn)物的磁珠，用磁鐵吸附，去除上清液；然后用 IOOu LlXNEBuffer 4洗磁珠一次，再在離心管中，按順序加入以下試劑LoTE17. 2u I ；100XBSA0. 2u L(終濃度為 100 U g/mL)；IOXNEBuffer 42 U L ；NlaIII (IOU/ U L, NEB, Cat#R0125S) 0. 6 U L ；在37°C反應(yīng)I小時，每10到15分鐘輕彈離心管；反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠， 去除上清液，然后用IOOiiL 1XT4 Ligation Buffer洗五次磁珠，得3’ -cDNA。2)連接接頭分子I在含磁珠的離心管中加入以下試劑接頭分子I (20 ii M)luL；LoTE14u L ；10 X T41igation buffer2 U L；IOXATP(IOmM)IU L ；然后在50°C加熱兩分鐘，在室溫冷卻15分鐘，再加入2 ii L T4 DNA連接酶(400U/ U L，NEB, Cat#M0202L)，室溫反應(yīng)2小時；然后用磁鐵吸附磁珠，去除上清液，再用100 u L lXNEBuffer4洗三次磁珠，得含有接頭分子I的cDNA磁珠。接頭分子I :5，-TAGCGTGTCCGACATG-3’ (SEQ ID NO 9)3，-TATCGCACAGGCT-5’ (SEQ ID NO: 10)。3) Mme I 酶切用磁鐵吸附離心管中的含有接頭分子I的cDNA磁珠，小心去除上清液，并置于冰上，在離心管中加入以下試劑CN 102533752 ALoTEIOXNEBuffer 4SAM
17. 3u L ；
2 u L ；
0.L(終濃度 50 u M)；將離心管在65°C預(yù)熱 2 分鐘，加入 0. 4 U L Mme I (2U/U L, NEB, Cat#R0637S)輕彈混勻。在65°C反應(yīng)I小時，并不時混勻；反應(yīng)后，用磁鐵吸附磁珠I 2分鐘。不要丟棄上清液！小心把上清液移置一個新的離心管中。用LoTE將液體體積補至150 iiL。提取含有接頭分子I的酶切產(chǎn)物，并將含有接頭分子I的酶切產(chǎn)物溶解于14 y L LoTE中。4)連接接頭分子2在離心管中混合以下試劑接頭分子2 (20 ii M)luL；步驟3)所得含有接頭分子I的酶切產(chǎn)物14 ii L ;10XT4 ligation buffer2 U L ；IOXATP(IOmM)IU L ；在50°C加熱2分鐘，室溫冷15分鐘；加入2uL T4 DNA連接酶后室溫反應(yīng)2小時， 得cDNA文庫。接頭分子2:5，-CGCCTCCCTGCAGTCCAG-3’ (SEQ ID NO 11)3，-NNGCGGAGGGACGTCAGGTC-5’ (SEQ ID NO: 12)。2.第二類雙鏈cDNA文庫的構(gòu)建1)5，-(dT)8U(dT)6_3，(SEQ ID NO 5)以O(shè)ligo dT引物SEQ ID NO 5制備所得的雙鏈cDNA為原材料，按下述步驟進(jìn)行反應(yīng)。A. USER 酶酶切將含有雙鏈cDNA產(chǎn)物的磁珠，用磁鐵吸附，去除上清液；然后用100 U L LoTE懸浮磁珠，再在離心管中，按順序加入以下試劑USER 酶(IU/ U L, NEB, Cat#M5505S)10 U L ；10 X USER Buffer20 U L ；ddH20 up to 200 U L。37°C孵育Ih，反應(yīng)完成后用磁鐵吸附磁珠，將上清轉(zhuǎn)移至新的600 ii L EP管中，然后用純化試劑盒提純回收雙鏈USER酶酶切產(chǎn)物。B.連接接頭分子3連接反應(yīng)體系如下雙鏈USER酶酶切產(chǎn)物2 ii g ;接頭分子3 (IOiiM)IuL;T4DNA 連接酶2 ii L ;10 X T4連接酶緩沖液2 ii L ;加ddH20 至 IOOii L。接頭分子3:5’-CTTCAGCTATGCCGAT-3’ (SEQ ID NO 13)
3’-TTTTTTTGAAGTCGATACGGCTAAA-5’ (SEQ ID NO :14)，其中 SEQ IN NO :14 鏈上的 5’末端含有生物素標(biāo)記。連接條件，14°C孵育2h。反應(yīng)完成后，加入IOiiL帶鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠 (invitrogen, Dynabeadsa MyOne TM Streptavidin Cl)吸附連接產(chǎn)物，18 至 25°C孵育大約I小時，每10至15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，使帶生物素的連接產(chǎn)物充分結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，移除上清液；用IOOiiL IXNEBuffer 4沖洗磁珠，然后再用磁體吸附磁珠，重復(fù)3次，移除上清，得連接產(chǎn)物。C. Acu I 酶切將上述步驟B所得的連接產(chǎn)物在加入至下述反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切IOXNEBuffer 48 U L ；Acu I (5U/ u L, NEB, Cat#R0641S)2u L ；SAM (3. 2mM)I. 25u L(終濃度 50 y M)；ddH20 up to 80 U L。酶切條件37°C孵育lh。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，將上清液轉(zhuǎn)移至新的 200 u L EP管中，回收得雙鏈Acu I酶切產(chǎn)物。D.連接接頭分子4連接反應(yīng)體現(xiàn)如下雙鏈Acu I酶切產(chǎn)物I U g ;接頭分子4 (10 ii M)IuLT4DNA 連接酶I ii L10 X T4連接酶緩沖液2 ii L加ddH20 至 IOOu L。接頭分子4 5，-GGGCTTCTGAAGCG-3’ (SEQ ID NO 15)3，-TAGCCCGAAGACTTCGCNN-5，(SEQ ID NO: 16)，其中 SEP ID NO: 16 鏈上含有生
物素標(biāo)記。連接條件，14°C孵育2h。反應(yīng)完成后，加入IOiiL帶鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠 (invitrogen, Dynabeadsa MyOne TM Streptavidin Cl)吸附連接產(chǎn)物，18 至 25°C孵育大約I小時，每10至15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，使帶生物素的連接產(chǎn)物充分結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，移除上清液；用IOOiiL IXNEBuffer 4沖洗磁珠，然后再用磁體吸附磁珠，重復(fù)3次，移除上清，得連接產(chǎn)物。E. Acu I 酶切將上述步驟D所得的連接產(chǎn)物加入至下述反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切IOXNEBuffer 48 U L ；Acu I (5U/ U L, NEB, Cat#R0641S)2u L ；SAM (3. 2mM)I. 25u L(終濃度 50 ii M)；ddH20 up to 80 U L。酶切條件37°C孵育lh。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，去除上清液；然后用 IOOu L I X T4連接酶緩沖液沖洗磁珠，然后再用磁體吸附磁珠，重復(fù)3次，移除上清，得AcuI酶切產(chǎn)物。F.連接接頭分子5將步驟E所得Acu I酶切產(chǎn)物加入下述反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系如下接頭分子5 (IOiiM)IuL10T4DNA 連接酶2 ii L10 X T4連接酶緩沖液2 ii L加ddH20 至 IOOii L。連接條件，14°C孵育2h。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，移除上清液；用100 UL TE 緩沖液沖洗磁珠，然后用磁鐵吸附磁珠，移除上清液，重復(fù)三次，得cDNA文庫。接頭分子5 5，-TGACGCGCACGCGCTCG-3’ (SEQ ID NO 17)3’ -NNACTGCGCATGCGCGAGC-5’ (SEQ ID NO 18)。其中，SEQ ID NO 17 的 3’ 末端
G為雙脫氧堿基。2)5’ -(dT)13U(dT)3MN_3，(SEQ ID NO :6)以O(shè)ligo dT弓丨物SEQ ID NO :6制備所得的雙鏈cDNA為原材料，參照上述I)里的步驟進(jìn)行反應(yīng)，只需根據(jù)SEQ ID NO 6對接頭分子3進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，得cDNA文庫。反應(yīng)。
3)5’-AGAGCAGCAGC-(dT)25-3’ (SEQ ID NO :7)
以O(shè)ligo dT引物SEQ ID NO :7制備所得的雙鏈cDNA為原材料，按下述步驟進(jìn)行
A. EcoP15 I 酶切雙鏈 cDNA
利用EcoP15 I (IOU/u I, NEB Cat#R0646S)酶切步驟三所得的雙鏈cDNA產(chǎn)物，反應(yīng)液體系如下IOOmMNaCl, 50mM Tris-HCl, IOmM MgC12, ImMdithiothreitol, 100 u g/mL BSA, ImM ATP，pH7.9。37°C孵育lh。反應(yīng)完后，用磁鐵吸附磁珠，將上清轉(zhuǎn)移至200 y L PCR 管中，65°C孵育20分鐘，滅活EcoP15 I，得EcoP15 I酶切產(chǎn)物。B.連接接頭分子6
連接體系如下
EcoP15I酶切產(chǎn)物2 u
接頭分子6 (IOiiM)I U
T4DNA連接酶I U
10XT4連接酶緩沖液2 u
加 ddH20 至 IOOii L。
接頭分子6
5， -ATCGTAGTGCCTGAAG-3’1 (SEQ ID NO 19)
3， -TAGCATCACGGACTTCNN--5，(SEQ ID NO 20)羥基化，SEQ ID NO : 19的5，末端含有生物素標(biāo)記。
連接條件，14 °C孵育2h。反應(yīng)完成后，加入
(invitrogen, DynabeadsR MyOneTM Streptavidin Cl)吸附連接產(chǎn)物，18 至 25°C孵育大
約I小時，每10至15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，使帶生物素的連接產(chǎn)物充分結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，移除上清液；用IOOiiL IXNEBuffer 4沖洗磁珠，然后再用磁體吸附磁珠，重復(fù)3次，移除上清，得連接產(chǎn)物。C. Acu I 酶切將上述步驟B所得的連接產(chǎn)物在加入至下述反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切IOXNEBuffer 48 U L ；Acu I (5U/ U L, NEB, Cat#R0641S)2u L ；SAM (3. 2mM)I. 25u L(終濃度 50 ii M)；ddH20 up to 80 U L。酶切條件37°C孵育Ih。反應(yīng)完成后,用磁鐵吸附磁珠,移除上清液；然后用80ii L I X T4連接酶緩沖液沖洗磁珠，然后用磁鐵吸附磁珠，移除上清液，重復(fù)三次，得Acu I酶切產(chǎn)物。D.連接接頭分子7將步驟E所得Acu I酶切產(chǎn)物加入下述反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系如下接頭分子7 (IOiiM)IuL;10T4DNA 連接酶2 ii L ;10 X T4連接酶緩沖液2 ii L ;加ddH20 至 IOOu L。接頭分子7 5’ -CCTCCCTGCAGTCCTCTATGGGCT-3’ (SEQ ID NO 21)3，-NNGGAGGGACGTCAGGAGATACCCGA-5’ (SEQ ID NO :22)。其中，SEQ ID NO 22 的
5’末端的A不帶磷酸基團(tuán)。連接條件，14°C孵育2h。反應(yīng)完成后，用磁鐵吸附磁珠，移除上清液；用100 UL TE 緩沖液沖洗磁珠，然后用磁鐵吸附磁珠，移除上清液，重復(fù)三次，得cDNA文庫。E. cDNA文庫的擴(kuò)增利用引物F(SEQ ID NO :67)和引物R(SEQ ID NO :68)對步驟4所得cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下cDNA文庫IOOu L ；
引物 F(IOiiM)IOOu L ；
引物 R(IOiiM)IOOu L ；
IOXEx Taq BufferIOOu L ；
Ex Taq(5U/u L)8 u L ；
dNTP (各 2. 5mM)80 u L ；
ddH20 up to 1000 u L0
PCR反應(yīng)條件如下
95 °C 3min ；
94°C 20s, 58°C 20s, 72°C 20s ;重復(fù) 15 個循環(huán)；
72 °C 7min。
利用PCR清潔試劑盒，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔，除去未擴(kuò)增的引物和dNTP，回收擴(kuò)增后
的產(chǎn)物，得擴(kuò)增后的cDNA文庫。 4)5，-GAGCTGAAGATA-(ClT)1 !MN-3，(SEQ ID NO :8)
以O(shè)ligo dT引物SEQ ID NO 8制備所得的雙鏈cDNA為原材料，參照上述3)中步驟進(jìn)行反應(yīng)，并根據(jù)SEQ ID NO 8對接頭分子6進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，得cDNA文庫。五、cDNA文庫的測序利用第二代高通量技術(shù)對步驟四所得的cDNA文庫進(jìn)行測序，測定的技術(shù)包括但不限于基于聚合酶的合成測序法、基于連接酶的連接測序法。基于聚合酶的合成測序法是基于帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的。在每次合成反應(yīng)中，每個模板鏈至多只能延伸一次，基于聚合酶的合成測序法的大致流程如下a.測序引物通過互補配對結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)，在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集該次加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’ 最末端堿基互補的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物(固定在引物-固相載體復(fù)合物上)的下一位的堿基序列信息。b.切除可去除標(biāo)記，然后在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸繼續(xù)進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’末端堿基互補的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的下兩位的堿基序列信息。重復(fù)b步驟，直至不能繼續(xù)進(jìn)行合成反應(yīng)為止，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的全部序列信息?；谶B接酶的連接測序法是基于帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的。其中一種連接酶的連接測序法是基于在特定位置帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的，該寡核苷酸探針帶有n個堿基，從其5’端數(shù)起的第a位帶有熒光標(biāo)記，其中不同的堿基對應(yīng)特定的熒光標(biāo)記，因為該寡核苷酸探針的3’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物只能連接一個寡核苷酸探針。該連接測序法的大致流程如下A.測序引物通過互補配對結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)上，利用上述的寡核苷酸探針，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號，即可得到與單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第a位堿基序列信息。B.切除寡核苷酸上的熒光標(biāo)記，在連接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探針為原料，繼續(xù)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后采集熒光信號，從而得到單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’ 末端后第2a位的堿基序列信息。重復(fù)B步驟，直至不能繼續(xù)進(jìn)行連接反應(yīng)為止，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第a、2a、3a、4a......位的堿基序列信息。然后將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來， 換用與之前的測序引物相比3’末端少一個堿基的引物重復(fù)上述反應(yīng)，從而獲得單分子擴(kuò)增
產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第a-l、2a-l、3a-l、4a_l......位的堿基序列信息。重
復(fù)此步驟，最后獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第a-(a-l)、2a-(a_l)、 3a_ (a-1)、4a_ (a_l)......位的堿基序列信息，從而獲得單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的全部序列信息。另一種連接酶的連接測序法同樣也是基于帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的， 該寡核苷酸探針帶有n個堿基，分為h(h ^ n)組，同一組寡核苷酸探針的不同熒光標(biāo)記對應(yīng)同一特定位置的不同堿基序列，不同組之間的區(qū)別在于不同熒光標(biāo)記對應(yīng)的特定位置不同，因為該寡核苷酸探針的3’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物只能連接一個寡核苷酸探針。該連接測序法的大致流程如下a.測序引物通過互補配對結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)上，利用上述寡核苷酸探針中的一組(熒光標(biāo)記對應(yīng)的堿基位置為x，x < h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號，即可得到與單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第X位堿基序列信息，將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來。b.然后重新將測序引物結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上，換用與a步驟不同的寡核苷酸探針組(熒光標(biāo)記對應(yīng)的堿基位置為1，I ( h)，在連接酶的作用下，將核酸探針與上述寡核苷酸鏈連接，然后采集熒光信號，即可得到與單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第y位堿基序列信息，將測序引物及其所連接的寡核苷酸探針從單分子擴(kuò)增產(chǎn)物上變性洗脫下來。c.重復(fù)步驟b，直至h組寡核苷酸探針均分別進(jìn)行過一次連接反應(yīng)，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端后第1、2.......h位的堿基序列信息。換用與之前的測序引物相比3’末端多一個或各通用堿基的引物按上述原理進(jìn)行反應(yīng)，能夠延長獲得的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列的3’末端堿基序列的讀長。這種基于連接酶的連接測序法的原理和具體實施方案可參考CN200710170507. I。 優(yōu)選采用深圳華因康基因科技有限公司開發(fā)的PStar II高通量測序儀進(jìn)行高通量測序，并對序列進(jìn)行分析，進(jìn)而得到測序結(jié)果。六、實驗結(jié)果I.對照組實驗結(jié)果經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)查找，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母Haploid. fa (S288C), Diploid. fa(BY4347)的相關(guān)基因共有5720個。表I對照組檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物為含有連續(xù)的dT序列的單鏈 DNA分子，其含有用于切割的識別位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的OligodT引物，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或II s型限制性內(nèi)切酶識別序列，所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的OligodT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物序列為.5，-(dT)xU(dT)y-3，；或 5’ - (RERS) _(dT)z-3’ ；或 5’ -(dT)a (P-S) (dT)廠3，；或 5’ -(dT)Y(I) (dT)s-3’ ；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的OligodT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3’末端為含通用堿基的核苷酸M, M為A或G或C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的OligodT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至3’端依次為M和N，N為A或G或C或T或U或I ; 所述Oligo dT引物序列為.5，_(dT)xU(dT)yMN-3’ ；或 5，- (RERS) _(dT)zMN-3’ ；或 5’ -(dT)a (P-S) (dT)eMN-3’ ；或 5’ -(dT)Y(I) (dT)sMN-3’ ；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的OligodT引物,其特征在于,所述Oligo dT引物含有標(biāo)記物，所述標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種。
7.—種cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A.利用OligodT引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，形成第一條cDNA鏈，得RNA/DNA雜合分子；該Oligo dT引物為含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點；B.對RNA/DNA雜合分子中的第一條cDNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增，得雙鏈cDNA；C.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；D.含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段與第一接頭分子連接，得cDNA文庫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、脫氧肌苷、硫代磷酸酯鍵或IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，所述IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列在Oligo dT引物的5’端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷；所述步驟C包括以下步驟C01.切割劑切割雙鏈cDNA，得雙鏈切割片段；C02.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；C03.利用第一 IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；所述切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸二酯鍵。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述OligodT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3’ ；或 5’ -(dT)a (P-S) (dT)-3，；或 5’ -(dT)Y(I) (dT)s-3’ ；其中，x、y、a、@、Y、S均為自然數(shù)，14≤x+y≤17，14≤a+@ ( 17， 14≤y + 8≤17，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷；所述步驟C包括以下步驟Cll.切割劑切割雙鏈eDNA，得雙鏈切割片段；C12.將雙鏈切割片段與第二接頭分子連接，得第一連接產(chǎn)物；C13.利用第一 11s型限制性內(nèi)切酶酶切第一連接產(chǎn)物，得不含第二接頭分子的酶切片段；C14.將不含第二接頭分子的酶切片段與第三接頭分子連接，得第二連接產(chǎn)物；C15.利用第二 11s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段；所述切割劑用于特異性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯鍵或脫氧肌苷3’端的第二個磷酸二酯鍵。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述OligodT引物序列為5，_(dT)xU(dT)y-3’ ；或 5’ -(dT)a (P-S) (dT)-3’；或 5’ -(dT)Y(I) (dT)s-3’ ；其中，x、y、a、@、Y、S 均為自然數(shù)，x+y ≥14，3 ≤ x ≤ 9，a + 3 ≥ 14,3≤ a ≤ 9， Y + 6 ≥ 14, 3 ≤ y ≤9。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，其位于Oligo dT引物的5’端；所述步驟C具體為11s型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，分離純化出含有Oligo dT引物對應(yīng)序列的酶切產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述OligodT引物序列為5’ -(RERS) _(dT)z-3’;其中，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列， z為自然數(shù)，10≤z≤17。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于切割的識別位點為IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列，其位于Oligo dT引物的5’端；所述步驟C包括以下步驟C21. Hs型限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，分離純化出無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段；C22.將無IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的酶切片段與第四接頭分子連接，得第三連接產(chǎn)物；C23.利用第三IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第三連接產(chǎn)物，得含mRNA分子3’端對應(yīng)序列的片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述OligodT引物序列為5’ -(RERS) _(dT)z-3’;其中，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列， z為自然數(shù)，15彡z彡30。
17.根據(jù)權(quán)利要求7所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟 A，:利用Oligo dT引物從總RNA中分離純化mRNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求7、8、9、11、13、15或17所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述 Oligo dT引物的3’末端為含通用堿基的核苷酸M，M為A或G或C。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述OligodT引物的 3’末端為兩個含通用堿基的核苷酸，從5’端至3’端依次為M和N，N為A或G或C或T或 U或I ;所述Oligo dT引物序列為5，_(dT)xU(dT)yMN-3’ ；或 5，- (RERS) _(dT)zMN-3’ ；或 5’ -(dT)a (P-S) (dT)eMN-3’ ；或 5’ -(dT)Y(I) (dT)sMN-3’ ；其中，x、y、z、a、@、Y、S均為自然數(shù)，RERS為含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別序列的核苷酸序列，P-S為硫代磷酸酯鍵，I為脫氧肌苷。
20.根據(jù)權(quán)利要求7至17中任一項所述的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述Oligo dT引物在5’端含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種；和/或所述接頭分子含有標(biāo)記物，該標(biāo)記物采用生物素、抗原、抗體、受體、配體、 多聚組氨酸中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，提供了一種Oligo dT引物，該Oligo dT引物為含有連續(xù)的dT序列的單鏈DNA分子，其含有用于切割的識別位點。本發(fā)明還提供了一種基于上述Oligo dT引物進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建的方法。本發(fā)明的Oligo dT引物適用性好，可應(yīng)用于多種不同的建庫方案；還能準(zhǔn)確的定位在mRNA分子poly A尾的起始位點；本發(fā)明的構(gòu)建cDNA文庫的方法能夠保證樣品中所有的mRNA分子在構(gòu)建的cDNA文庫中得到特異性的體現(xiàn)。
文檔編號C12N15/11GK102533752SQ201210047909
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼